01微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

1、課題課題1 1 微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng) 了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。 一、課題目標(biāo)：一、課題目標(biāo)： 掌握掌握培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌高壓蒸氣滅菌和和平板劃線法平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：二、課題重點和難點：三、技能目標(biāo)：三、技能目標(biāo)：課題課題1 1 微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)基本操作程序基本操作程序1 1、

2、培養(yǎng)基的配制、培養(yǎng)基的配制2 2、培養(yǎng)基、器具的滅菌、培養(yǎng)基、器具的滅菌3 3、倒平板、倒平板4 4、微生物的接種、微生物的接種5 5、微生物的培養(yǎng)、微生物的培養(yǎng)6 6、菌種的保存、菌種的保存 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基。置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基。 一般都含有一般都含有水水、碳源碳源、氮源氮源和和無機(jī)鹽無機(jī)鹽等等營養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對phph、特殊營特殊營養(yǎng)物質(zhì)，如：生長因子養(yǎng)物質(zhì)，如：生長因子( (即細(xì)菌生長必需，而自身即細(xì)菌生長必需，

3、而自身不能合成的化合物不能合成的化合物, ,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶嘧啶) )以及以及氧氣氧氣、二氧化碳二氧化碳、滲透壓滲透壓等要求。等要求。 培養(yǎng)基的基本成分培養(yǎng)基的基本成分液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的種類1.1.按物理狀態(tài)分按物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：2.2.按原料來源分按原料來源分合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基半天然培養(yǎng)基半天然培養(yǎng)基3.3.按用途分按用途分選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基 培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添的基礎(chǔ)上再添加瓊脂。加瓊脂。 半固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：增菌增菌純化，

4、增菌純化，增菌動力檢測，保種動力檢測，保種 無菌技術(shù) 無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌入侵。獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌入侵。無菌技術(shù)的種類使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害的微生物。殺死部分對人體有害的微生物。將培養(yǎng)皿、接種用具進(jìn)行滅菌；將培養(yǎng)皿、接種用具進(jìn)行滅菌；使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。所有微生物（包括芽孢和孢子）。對實驗操作

5、的空間、操作者的衣著和對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔消毒；手進(jìn)行清潔消毒； 無菌技術(shù)接種的過程要在酒精燈附近進(jìn)行。接種的過程要在酒精燈附近進(jìn)行。單鏈季胺鹽、雙胍類、中單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子草藥、金屬離子殺滅細(xì)菌繁殖體、殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒親脂病毒低效消低效消毒法毒法超聲波、碘類、醇類、酚超聲波、碘類、醇類、酚類類殺滅除芽孢外的殺滅除芽孢外的致病微生物致病微生物中效消中效消毒法毒法紫外線、含氯劑、臭氧、紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等復(fù)配劑等殺滅一切致病微殺滅一切致病微生物生物高效消高效消毒法毒法物理法：熱力、輻射、微物理法：熱力、輻射、微波、等離子體波、等離子體殺滅

6、一切微生物殺滅一切微生物滅菌法滅菌法方法方法定義定義分類分類化學(xué)法：醛類、烷化劑化學(xué)法：醛類、烷化劑常用的消毒與滅菌的方法 無菌技術(shù)1.1.灼燒滅菌：灼燒滅菌：常用的消毒與滅菌的方法2.2.干熱滅菌：干熱滅菌：3.3.高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌： 接種用具和接種過程中的試管口或瓶口放在酒精接種用具和接種過程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的燃燒層中進(jìn)行充分灼燒滅菌。燈火焰的燃燒層中進(jìn)行充分灼燒滅菌。 將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在160160170170中加熱中加熱1 12h2h即可。即

7、可。 將需滅菌物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)煮沸，將需滅菌物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓達(dá)待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓達(dá)100kpa100kpa，溫度達(dá)溫度達(dá)121121后，維持后，維持151530min30min即可。即可。 無菌技術(shù) 二、實 驗 操 作 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.1.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方物質(zhì)物質(zhì)牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨naclnacl瓊脂瓊脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至100ml100ml2.2.稱量稱量 按比例稱取各種物質(zhì)。按比例稱取各種物質(zhì)。注意：牛肉膏

8、要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨注意：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。3.3.溶化：溶化：4.4.滅菌：滅菌：5.5.倒平板：倒平板： 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加水拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶

9、解后，加水定溶至定溶至100ml100ml。 將配制好培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，將配制好培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3 35 5套，用幾層報紙?zhí)祝脦讓訄蠹埌茫┮黄鸱诺礁邏哄亙?nèi)滅菌。包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。 待培養(yǎng)基冷卻到待培養(yǎng)基冷卻到5050左右時倒平板。左右時倒平板。倒平板操作的討論 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到5050時倒平板。時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 2. 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 用手觸摸錐形瓶，溫度下

10、降到剛剛不燙手用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。時即可開始倒平板。 通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。養(yǎng)基。 3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？物嗎？為什么？ 平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將

11、平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。微生物。倒平板操作的討論 純化大腸桿菌 微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。釋涂布平板法。1.1.平板劃線法平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步

12、稀釋分散到培養(yǎng)線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。基的表面。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細(xì)胞繁殖在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落菌落。1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？ 第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；的微生物污染培養(yǎng)物；平板劃線法的討論 每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束每次劃線前灼燒接種環(huán)是

13、為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。便得到菌落。 劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？進(jìn)行劃線

14、？平板劃線法的討論3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)比線條起始處劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細(xì)要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法 將菌

15、液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。表面進(jìn)行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表微生物將分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。面形成單個的菌落。稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟: :系列稀釋操作系列稀釋操作涂布平板操作涂布平板操作系列稀釋操作系列稀釋操作101102103104105106(1)(1)將分別盛有將分別盛有9ml9ml水的試管滅菌

16、并編號。水的試管滅菌并編號。(2)(2)用移液管吸取用移液管吸取1ml1ml培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。(3)(3)從從10101 1倍稀釋的試管中吸取倍稀釋的試管中吸取1ml1ml稀釋液，注入第三支稀釋液，注入第三支試管中，重復(fù)步驟試管中，重復(fù)步驟2 2，直至到第六支試管。，直至到第六支試管。涂布平板操作涂布平板操作(1)(1)將涂布器浸在盛有將涂布器浸在盛有7070的酒精的燒杯中。的酒精的燒杯中。(2)(2)取少量菌液（不超取少量菌液（不超0.1ml0.1ml），滴加到培養(yǎng)基表），滴加到培養(yǎng)

17、基表面。面。(3)(3)將沾有酒精的涂布器將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄在火焰上引燃，火熄后冷卻后冷卻8 810s10s。(4)(4)用涂布器將菌液均勻用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。地涂布在培養(yǎng)基表面。2.2.稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法涂布平板操作討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第二步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？一想，第二步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？ 將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基均放到均放到3737的恒溫箱中，

18、培養(yǎng)的恒溫箱中，培養(yǎng)121224h24h后觀察并后觀察并記錄結(jié)果。記錄結(jié)果。 應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“無菌無菌”。如。如: :酒酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。 1.1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？菌落生長，說明了什么？ 2.2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？ 未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1 12d2d后無后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。需要重新制備。 如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。察到大小、形狀、顏色相似的菌落。