基層培訓(xùn)-免疫學(xué)技術(shù)ppt課件

1、1第五章第五章 常用免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)常用免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)2臨床免疫檢驗(yàn)是運(yùn)用免疫學(xué)基本的基本原理和技術(shù)，檢查臨床標(biāo)本中的微生物抗原、臨床免疫檢驗(yàn)是運(yùn)用免疫學(xué)基本的基本原理和技術(shù)，檢查臨床標(biāo)本中的微生物抗原、腫瘤抗原以及相應(yīng)的微生物抗體、自身抗體，為感染性性疾病、腫瘤、自身免疫病腫瘤抗原以及相應(yīng)的微生物抗體、自身抗體，為感染性性疾病、腫瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供診斷依據(jù)。以及免疫缺陷提供診斷依據(jù)。3免疫檢驗(yàn)分為兩個(gè)部分，一部分為利用免疫檢測原理檢測免疫活性細(xì)胞、抗原、免疫檢驗(yàn)分為兩個(gè)部分，一部分為利用免疫檢測原理檢測免疫活性細(xì)胞、抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)，另一部分是

2、利用免疫檢抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)，另一部分是利用免疫檢測原理檢測體液中微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元測原理檢測體液中微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素等。這些檢測結(jié)果為臨床上確定診斷、分析病情、調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后等素等。這些檢測結(jié)果為臨床上確定診斷、分析病情、調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后等提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4第一節(jié)第一節(jié) 免疫學(xué)檢驗(yàn)原理、特點(diǎn)和方法免疫學(xué)檢驗(yàn)原理、特點(diǎn)和方法 5一、免疫學(xué)檢驗(yàn)原理一、免疫學(xué)檢驗(yàn)原理（一）抗原抗體反應(yīng)是抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可發(fā)生在體內(nèi)，（一）抗原抗體

3、反應(yīng)是抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可發(fā)生在體內(nèi)，也可發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)即為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的也可發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)即為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，根據(jù)參與反應(yīng)的抗原的物理性狀（可溶性或顆粒性）以及參與反抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，根據(jù)參與反應(yīng)的抗原的物理性狀（可溶性或顆粒性）以及參與反應(yīng)的條件（電解質(zhì)、補(bǔ)體等）不同，表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象，如沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、應(yīng)的條件（電解質(zhì)、補(bǔ)體等）不同，表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象，如沉淀、凝集、細(xì)胞溶解、補(bǔ)體結(jié)合和毒素中和等。一般將檢查血清中病原微生物抗原和抗體的試驗(yàn)稱為血清學(xué)補(bǔ)體結(jié)合和毒素中和等。

4、一般將檢查血清中病原微生物抗原和抗體的試驗(yàn)稱為血清學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)。6抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。第一階段為特異性結(jié)合階段，此階段僅需數(shù)秒至數(shù)分抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。第一階段為特異性結(jié)合階段，此階段僅需數(shù)秒至數(shù)分鐘，但并不出現(xiàn)可見的反應(yīng)；第二階段為可見反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在鐘，但并不出現(xiàn)可見的反應(yīng)；第二階段為可見反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)、適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)、pH、溫度和補(bǔ)體等的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)聚集，出現(xiàn)凝集、沉淀、溶、溫度和補(bǔ)體等的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)聚集，出現(xiàn)凝集、沉淀、溶解和補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。第二階段反應(yīng)較慢，往往需要數(shù)分解和補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)

5、的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。第二階段反應(yīng)較慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。這兩個(gè)階段不能嚴(yán)格劃分，所需的時(shí)間也受多種因素的影響。鐘至數(shù)小時(shí)。這兩個(gè)階段不能嚴(yán)格劃分，所需的時(shí)間也受多種因素的影響。7（二）抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：（二）抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)：1、特異性、特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性（抗原抗體反應(yīng)的特異性（specificity）是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)）是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)結(jié)合的特異性，由這兩個(gè)分子之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。形同鑰匙與鎖一樣，所結(jié)合的特異性，由這兩個(gè)分子之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。形同鑰匙與鎖一樣，所以抗原抗體的結(jié)合是有高度特異性的。例

6、如白喉抗抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，以抗原抗體的結(jié)合是有高度特異性的。例如白喉抗抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。因此，在抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可以用已知的而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。因此，在抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，可以用已知的抗原或抗體來檢測特定的相對應(yīng)的抗體或抗原?？乖蚩贵w來檢測特定的相對應(yīng)的抗體或抗原。82、比例性、比例性比例性（比例性（proportionality）是指抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)時(shí)，生成肉眼可見結(jié)合物）是指抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)時(shí)，生成肉眼可見結(jié)合物的量與反應(yīng)物濃度的關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，才出現(xiàn)可見反應(yīng)?？乖沟牧颗c反應(yīng)物濃

7、度的關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)，才出現(xiàn)可見反應(yīng)?？乖贵w分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶。在此范圍抗原抗體結(jié)合充分，體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶。在此范圍抗原抗體結(jié)合充分，沉淀物形成得快而多。沉淀物形成得快而多。9在等價(jià)帶的前后，由于抗體和抗原的過量，上清液中可測出游離的抗體或抗原，形成在等價(jià)帶的前后，由于抗體和抗原的過量，上清液中可測出游離的抗體或抗原，形成的沉淀物少。當(dāng)抗體過量時(shí)，稱為前帶，抗原過量時(shí)稱為后帶。因此，在抗原抗體反的沉淀物少。當(dāng)抗體過量時(shí)，稱為前帶，抗原過量時(shí)稱為后帶。因此，在抗原抗體反應(yīng)的試驗(yàn)中，如果沒有產(chǎn)生肉眼可見的抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)，一

8、方面要考慮是否有抗應(yīng)的試驗(yàn)中，如果沒有產(chǎn)生肉眼可見的抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)，一方面要考慮是否有抗原與相應(yīng)的抗體存在，另一方面還必須注意到兩者反應(yīng)的比例是否適當(dāng)。原與相應(yīng)的抗體存在，另一方面還必須注意到兩者反應(yīng)的比例是否適當(dāng)。103、可逆性、可逆性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性稱為抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性稱為抗原抗體結(jié)合的可逆性（抗原抗體結(jié)合的可逆性（reversibility）。由于抗原抗體的結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵）。由于抗原抗體的結(jié)合是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，故形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定的條件下可以解

9、離，所以說抗原抗體結(jié)合形結(jié)合，故形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定的條件下可以解離，所以說抗原抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一動(dòng)態(tài)平衡過程。成抗原抗體復(fù)合物的過程是一動(dòng)態(tài)平衡過程。11抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素：一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素：一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。親和力高的抗體與抗原表位在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合因素對復(fù)合物的影響。親和力高的抗體與抗原表位在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離，反之，親和力低的抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。環(huán)境因素牢固，不容易解離，反之，親和力低的抗體與抗原形

10、成的復(fù)合物較易解離。環(huán)境因素中的過高或過低均可破壞離子間的靜電引力，使抗原抗體的結(jié)合力下降。增加離子強(qiáng)中的過高或過低均可破壞離子間的靜電引力，使抗原抗體的結(jié)合力下降。增加離子強(qiáng)度，也可使靜電引力消失，降低抗原抗體的結(jié)合力，促使其解離。解離后的抗原和抗度，也可使靜電引力消失，降低抗原抗體的結(jié)合力，促使其解離。解離后的抗原和抗體仍然保持游離抗原、抗體的生物活性。體仍然保持游離抗原、抗體的生物活性。12（三）影響抗原抗體反應(yīng)的因素（三）影響抗原抗體反應(yīng)的因素 影響抗原抗體反應(yīng)的因素較多，主要有兩方面：一是反應(yīng)物自身的因素，另一方影響抗原抗體反應(yīng)的因素較多，主要有兩方面：一是反應(yīng)物自身的因素，另一方面

11、是反應(yīng)環(huán)境的因素。面是反應(yīng)環(huán)境的因素。131、反應(yīng)物自身因素、反應(yīng)物自身因素（1）抗原）抗原抗原的理化性狀、表面抗原決定簇的種類和數(shù)目均可影響抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。如抗原的理化性狀、表面抗原決定簇的種類和數(shù)目均可影響抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。如顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生沉顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象；單價(jià)抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。淀現(xiàn)象；單價(jià)抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。14（2）抗體）抗體來源來源 來源于不同動(dòng)物的免疫血清，其反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血來源于不同動(dòng)物的免疫血清，其

12、反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血清，由于具有較寬的等價(jià)帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見的抗原抗體復(fù)合物。馬、清，由于具有較寬的等價(jià)帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見的抗原抗體復(fù)合物。馬、人的免疫血清等價(jià)帶窄，抗原不足或過剩，均易形成可溶性復(fù)合物。單克隆抗體一人的免疫血清等價(jià)帶窄，抗原不足或過剩，均易形成可溶性復(fù)合物。單克隆抗體一般不適合用于凝集和沉淀反應(yīng)。般不適合用于凝集和沉淀反應(yīng)。15濃度濃度 抗體的濃度往往是與抗原相對而言，二者合適的濃度才易出現(xiàn)可見的反應(yīng)結(jié)抗體的濃度往往是與抗原相對而言，二者合適的濃度才易出現(xiàn)可見的反應(yīng)結(jié)果。果。特異性和親和力特異性和親和力 特異性與親和力是影響抗原抗體反應(yīng)的

13、關(guān)鍵因素，它們共同影響特異性與親和力是影響抗原抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。診斷試劑應(yīng)盡可能選高特異性、高親和力的抗體，才能提高試試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。診斷試劑應(yīng)盡可能選高特異性、高親和力的抗體，才能提高試驗(yàn)的可靠性。驗(yàn)的可靠性。 162、反應(yīng)的環(huán)境條件、反應(yīng)的環(huán)境條件（1）電解質(zhì)）電解質(zhì)抗原抗體結(jié)合后，由親水性向疏水性轉(zhuǎn)換過程中必須要有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體結(jié)合后，由親水性向疏水性轉(zhuǎn)換過程中必須要有電解質(zhì)參與才能進(jìn)一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，破壞水化層，使復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊凝抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，破壞水化層，使復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊凝集

14、、沉淀。若無電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。在抗原抗體反應(yīng)中，通常使用集、沉淀。若無電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。在抗原抗體反應(yīng)中，通常使用0.85%NaCl溶液或各種緩沖液作抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液。溶液或各種緩沖液作抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液。17（2）酸堿度）酸堿度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行，環(huán)境中進(jìn)行，pH過低或過高都會(huì)影響抗原抗體的反應(yīng)。過低或過高都會(huì)影響抗原抗體的反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)中一般以抗原抗體反應(yīng)中一般以pH69為宜。有補(bǔ)體參與的反應(yīng)為宜。有補(bǔ)體參與的反應(yīng)pH為為7.27.4，超過這個(gè)范，超過這個(gè)范圍會(huì)降低補(bǔ)體的酶活性而影響反應(yīng)。圍會(huì)降低補(bǔ)體的酶

15、活性而影響反應(yīng)。18（3）溫度）溫度抗原抗體反應(yīng)需要合適的溫度才有利于二者結(jié)合。一般以抗原抗體反應(yīng)需要合適的溫度才有利于二者結(jié)合。一般以1540為宜，最適溫度為為宜，最適溫度為37。在此范圍內(nèi)，溫度越高，抗原抗體分子運(yùn)動(dòng)越快，碰撞接觸機(jī)會(huì)越多，兩者結(jié)。在此范圍內(nèi)，溫度越高，抗原抗體分子運(yùn)動(dòng)越快，碰撞接觸機(jī)會(huì)越多，兩者結(jié)合反應(yīng)速度越快。但是如果溫度高于合反應(yīng)速度越快。但是如果溫度高于56，會(huì)導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物解離，甚至分子變，會(huì)導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物解離，甚至分子變性。溫度越低，反應(yīng)速度越緩慢，但抗原抗體結(jié)合越牢固，易于觀察。性。溫度越低，反應(yīng)速度越緩慢，但抗原抗體結(jié)合越牢固，易于觀察。19（4）振

16、蕩）振蕩在抗原抗體反應(yīng)中，適當(dāng)?shù)恼駬u可促使抗原抗體分子的接觸，加速其反應(yīng)。在抗原抗體反應(yīng)中，適當(dāng)?shù)恼駬u可促使抗原抗體分子的接觸，加速其反應(yīng)。20（四）抗原抗體反應(yīng)的類型（四）抗原抗體反應(yīng)的類型隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在原有經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上，新的免疫學(xué)測定隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在原有經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上，新的免疫學(xué)測定方法不斷出現(xiàn)，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)更特異、更敏感和更穩(wěn)定。目前根據(jù)抗原和抗體方法不斷出現(xiàn)，使免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)更特異、更敏感和更穩(wěn)定。目前根據(jù)抗原和抗體的性質(zhì)不同，反應(yīng)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果的不同，以及反應(yīng)時(shí)參與的其他條件不同，將的性質(zhì)不同，反應(yīng)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果的不同，以及反應(yīng)

17、時(shí)參與的其他條件不同，將抗原抗體反應(yīng)分為五種類型。抗原抗體反應(yīng)分為五種類型。21（1）可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)；（）可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)；（2）顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)）顆粒抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合發(fā)生的凝集反應(yīng)；（合發(fā)生的凝集反應(yīng)；（3）抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體所產(chǎn)生的溶細(xì)胞反應(yīng)；（）抗原抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體所產(chǎn)生的溶細(xì)胞反應(yīng)；（4）細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)；（細(xì)菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)；（5）標(biāo)記免疫的抗原抗體反）標(biāo)記免疫的抗原抗體反應(yīng)。每種反應(yīng)類型都包括若干實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（見抗原抗體反列應(yīng)表應(yīng)。每種反應(yīng)類型都包括若干實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（見抗原抗

18、體反列應(yīng)表1）22表表1 抗原抗體反應(yīng)的類型和試驗(yàn)方法抗原抗體反應(yīng)的類型和試驗(yàn)方法-反應(yīng)類型反應(yīng)類型 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 結(jié)果判斷結(jié)果判斷-沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)液相沉淀實(shí)驗(yàn)液相沉淀實(shí)驗(yàn)觀察沉淀、檢測濁度觀察沉淀、檢測濁度 瓊脂凝膠擴(kuò)散瓊脂凝膠擴(kuò)散觀察和測定掃描沉淀線或環(huán)觀察和測定掃描沉淀線或環(huán) 凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù)觀察和測定掃描沉淀峰弧等觀察和測定掃描沉淀峰弧等凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)直接凝集實(shí)驗(yàn)直接凝集實(shí)驗(yàn)用裸眼、放大鏡或顯微鏡觀察紅用裸眼、放大鏡或顯微鏡觀察紅 細(xì)胞或膠乳顆粒的凝集現(xiàn)象細(xì)胞或膠乳顆粒的凝集現(xiàn)象 間接凝集實(shí)驗(yàn)間接凝集實(shí)驗(yàn) 同上同上 凝集抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)种茖?shí)驗(yàn) 同上同上 協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)協(xié)同凝

19、集實(shí)驗(yàn) 同上同上 抗球蛋白實(shí)驗(yàn)抗球蛋白實(shí)驗(yàn) 同上同上-23-補(bǔ)體參與反應(yīng)補(bǔ)體參與反應(yīng)補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn)補(bǔ)體溶血實(shí)驗(yàn) 以裸眼或光電比色儀觀察以裸眼或光電比色儀觀察 測定溶血現(xiàn)象測定溶血現(xiàn)象 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 同上同上中和反應(yīng)中和反應(yīng) 病毒中和實(shí)驗(yàn)病毒中和實(shí)驗(yàn)病毒感染性喪失病毒感染性喪失 毒素中和實(shí)驗(yàn)毒素中和實(shí)驗(yàn)外毒素毒性丟失外毒素毒性丟失標(biāo)記免疫標(biāo)記免疫 熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 檢測熒光檢測熒光 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù) 檢測放射性檢測放射性 酶標(biāo)免疫酶標(biāo)免疫 檢測酶底物顯色、發(fā)光、熒光檢測酶底物顯色、發(fā)光、熒光 發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù) 檢測發(fā)光檢測發(fā)光 金標(biāo)免疫技術(shù)金標(biāo)免疫技術(shù) 觀察金顆

20、沉淀線觀察金顆沉淀線-24二、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法和應(yīng)用二、免疫學(xué)檢驗(yàn)方法和應(yīng)用（一）凝集反應(yīng)（一）凝集反應(yīng)顆粒性抗原或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，與相應(yīng)抗體（或顆粒性抗原或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。凝集試驗(yàn)應(yīng)用廣而且敏感度高，方法簡便，迄今已成為通用的免疫學(xué)技術(shù)之一，反應(yīng)。凝集試驗(yàn)應(yīng)用廣而且敏感度高，方法簡便，迄今已成為通用的免疫學(xué)技術(shù)之一，廣泛用于細(xì)菌的鑒定和分型、抗原分析、測定抗體和診斷

21、疾病等臨床檢驗(yàn)。在免疫檢廣泛用于細(xì)菌的鑒定和分型、抗原分析、測定抗體和診斷疾病等臨床檢驗(yàn)。在免疫檢驗(yàn)技術(shù)中，根據(jù)參與反應(yīng)的顆粒的不同，把凝集反應(yīng)分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反驗(yàn)技術(shù)中，根據(jù)參與反應(yīng)的顆粒的不同，把凝集反應(yīng)分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。而自身紅細(xì)胞凝集反應(yīng)試驗(yàn)和抗球蛋白參與的凝集試驗(yàn)是兩種特殊的凝集反應(yīng)。應(yīng)。而自身紅細(xì)胞凝集反應(yīng)試驗(yàn)和抗球蛋白參與的凝集試驗(yàn)是兩種特殊的凝集反應(yīng)。251、直接凝集反應(yīng)：、直接凝集反應(yīng)：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體反應(yīng)，細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體反應(yīng)，當(dāng)二者比例適當(dāng)時(shí)，出

22、現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，參與當(dāng)二者比例適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法、試管法和微量血凝反應(yīng)板法。反應(yīng)的抗體稱為凝集素。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法、試管法和微量血凝反應(yīng)板法。26（1）玻片凝集試驗(yàn)：多用于定性。用以知抗體診斷血清與受檢菌液在玻片上混勻，）玻片凝集試驗(yàn)：多用于定性。用以知抗體診斷血清與受檢菌液在玻片上混勻，放置數(shù)分鐘后如抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)即出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)。如沙門菌玻片凝集放置數(shù)分鐘后如抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)即出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)。如沙門菌玻片凝集試驗(yàn)。試驗(yàn)。（2）試管凝集試驗(yàn)：

23、多用于半定量和定量試驗(yàn)，常用已知一定量的抗原（細(xì)菌、細(xì)）試管凝集試驗(yàn)：多用于半定量和定量試驗(yàn)，常用已知一定量的抗原（細(xì)菌、細(xì)胞等）與一系列稀釋的病人血清混合，在保溫放置后觀察結(jié)果，判定受檢血清有無相胞等）與一系列稀釋的病人血清混合，在保溫放置后觀察結(jié)果，判定受檢血清有無相應(yīng)抗體以及效價(jià)，如肥達(dá)反應(yīng)。應(yīng)抗體以及效價(jià)，如肥達(dá)反應(yīng)。272、間接凝集反應(yīng)：將可溶性抗原（或抗體）先吸附或偶聯(lián)與免疫無關(guān)大小適當(dāng)?shù)摹㈤g接凝集反應(yīng)：將可溶性抗原（或抗體）先吸附或偶聯(lián)與免疫無關(guān)大小適當(dāng)?shù)念w粒表面，使之成為致敏載體顆粒，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電顆粒表面，使之成為致敏載體顆粒，然后與相應(yīng)抗體（或抗原

24、）作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。其敏感度比直接凝解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。其敏感度比直接凝集反應(yīng)高集反應(yīng)高28倍，亦明顯高于沉淀反應(yīng)。在臨床上廣泛用于各種抗體和可溶性抗原倍，亦明顯高于沉淀反應(yīng)。在臨床上廣泛用于各種抗體和可溶性抗原的檢測。間接凝集反應(yīng)試驗(yàn)可分為：的檢測。間接凝集反應(yīng)試驗(yàn)可分為：28（1）間接凝集試驗(yàn)：用抗原致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體。將可溶性抗原與）間接凝集試驗(yàn)：用抗原致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體。將可溶性抗原與載體顆粒結(jié)合，再與樣品中的抗體反應(yīng)，形成肉眼可見的凝集顆?；蚰瘔K者為陽載體顆粒結(jié)合，再與

25、樣品中的抗體反應(yīng)，形成肉眼可見的凝集顆?；蚰瘔K者為陽性。性。29（2）反向間接凝集試驗(yàn)：用已知特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗）反向間接凝集試驗(yàn)：用已知特異性抗體致敏載體以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。臨床上用于檢測原。臨床上用于檢測HbsAg、AFP等。等。30（3）間接抑制試驗(yàn)：試劑為已知抗原致敏的顆粒載體和相應(yīng)的抗體，用于檢測標(biāo)）間接抑制試驗(yàn)：試劑為已知抗原致敏的顆粒載體和相應(yīng)的抗體，用于檢測標(biāo)本中與致敏抗原相同的抗原。檢測方法是將標(biāo)本與抗體試劑混合反應(yīng)，然后加入致本中與致敏抗原相同的抗原。檢測方法是將標(biāo)本與抗體試劑混合反應(yīng)，然后加入致敏載體，若出現(xiàn)凝集，說明標(biāo)本中不存在相應(yīng)抗原，抗體試

26、劑未被結(jié)合，仍與載體敏載體，若出現(xiàn)凝集，說明標(biāo)本中不存在相應(yīng)抗原，抗體試劑未被結(jié)合，仍與載體上的抗原反應(yīng)；如未出現(xiàn)凝集，則說明標(biāo)本中含有相應(yīng)抗原，凝集反應(yīng)被抑制。上的抗原反應(yīng)；如未出現(xiàn)凝集，則說明標(biāo)本中含有相應(yīng)抗原，凝集反應(yīng)被抑制。 31（4）協(xié)同凝集試驗(yàn)：其原理同反向間接凝集試驗(yàn)，但所用的載體是金黃色葡萄球菌，）協(xié)同凝集試驗(yàn)：其原理同反向間接凝集試驗(yàn)，但所用的載體是金黃色葡萄球菌，其細(xì)胞壁中有其細(xì)胞壁中有A蛋白（蛋白（SPA），），SPA具有能與特異性抗體具有能與特異性抗體IgG的的Fc段結(jié)合的特性。當(dāng)段結(jié)合的特性。當(dāng)這種這種葡萄球菌與葡萄球菌與IgG抗體連接時(shí)，就成為抗體致敏的顆粒載體，若

27、與相應(yīng)抗原接觸，抗體連接時(shí)，就成為抗體致敏的顆粒載體，若與相應(yīng)抗原接觸，就會(huì)出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)，常用于細(xì)菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速檢測。就會(huì)出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)，常用于細(xì)菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速檢測。 32間接血凝試驗(yàn)：是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)。可根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度間接血凝試驗(yàn)：是以紅細(xì)胞作為載體的間接凝集試驗(yàn)?？筛鶕?jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱。在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，是經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)之一。判斷陽性反應(yīng)的強(qiáng)弱。在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，是經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)之一。膠乳凝集試驗(yàn)：是以聚苯乙烯膠乳微粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。膠乳凝集試驗(yàn)：是以聚苯乙烯膠乳微粒為載體的間接

28、凝集試驗(yàn)。明膠凝集試驗(yàn)：即以明膠顆粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。常用于血清中抗病毒抗體明膠凝集試驗(yàn)：即以明膠顆粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。常用于血清中抗病毒抗體的檢測。的檢測。33 間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用間接凝集試驗(yàn)的應(yīng)用間接凝集試驗(yàn)具有敏感、快速、操作簡便和不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，既可以檢測抗原，間接凝集試驗(yàn)具有敏感、快速、操作簡便和不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，既可以檢測抗原，又可以檢測抗體。已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。特別是對某些疾病的診斷治療和效果的觀察又可以檢測抗體。已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。特別是對某些疾病的診斷治療和效果的觀察有著重要的參考價(jià)值。有著重要的參考價(jià)值。34（1）抗體的檢測）抗體的檢測 用于檢測微生物

29、、寄生蟲等感染所產(chǎn)生的抗體及自身抗體和藥物用于檢測微生物、寄生蟲等感染所產(chǎn)生的抗體及自身抗體和藥物抗體。如檢測沙門菌抗體和類風(fēng)濕因子等?？贵w。如檢測沙門菌抗體和類風(fēng)濕因子等。（2）抗原的檢測）抗原的檢測 用于在臨床上用反向間接凝集試驗(yàn)檢測甲胎蛋白抗原和乙型肝炎用于在臨床上用反向間接凝集試驗(yàn)檢測甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查。在婦產(chǎn)科常用膠乳凝集試驗(yàn)檢測孕婦尿中的絨毛膜促性腺激素病毒流行病學(xué)調(diào)查。在婦產(chǎn)科常用膠乳凝集試驗(yàn)檢測孕婦尿中的絨毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以診斷早期妊娠。）抗原。以診斷早期妊娠。35（二）沉淀反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)生特異

30、性結(jié)合而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖等可溶性物質(zhì)?？乖c相應(yīng)抗體再介質(zhì)中或固相沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖等可溶性物質(zhì)?？乖c相應(yīng)抗體再介質(zhì)中或固相表面發(fā)生特異性結(jié)合，可分為兩個(gè)階段，第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，在幾表面發(fā)生特異性結(jié)合，可分為兩個(gè)階段，第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，在幾秒或幾十秒內(nèi)就可完成，出現(xiàn)可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可見。在免疫比秒或幾十秒內(nèi)就可完成，出現(xiàn)可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可見。在免疫比濁法中可以測定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率比濁法。第二

31、階段則形成大的可見濁法中可以測定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率比濁法。第二階段則形成大的可見的免疫復(fù)合物，需要幾十分鐘到數(shù)小時(shí)才能完成。如沉淀線或沉淀環(huán)。沉淀反應(yīng)的常的免疫復(fù)合物，需要幾十分鐘到數(shù)小時(shí)才能完成。如沉淀線或沉淀環(huán)。沉淀反應(yīng)的常用試驗(yàn)方法有：用試驗(yàn)方法有：361、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)、液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)（1）絮狀沉淀試驗(yàn)：將抗原和抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)）絮狀沉淀試驗(yàn)：將抗原和抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合形成絮狀沉淀物。合形成絮狀沉淀物。（2）免疫濁度測定：是將光學(xué)測量儀器與分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對各）免疫濁度測定：是將光學(xué)測量儀器與

32、分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其它小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測定的方法。種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其它小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測定的方法。37其原理是：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)比例結(jié)合時(shí)，在特殊緩沖液中快速形成其原理是：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)比例結(jié)合時(shí)，在特殊緩沖液中快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。采用透射比濁或散射比濁的方法，一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。采用透射比濁或散射比濁的方法，根據(jù)所測的吸光度值可推算出待測抗原的量。免疫濁度測定又可分為速率比濁法和根據(jù)所測的吸光度值可推算出待測抗原的量。免

33、疫濁度測定又可分為速率比濁法和終點(diǎn)比濁法。其優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確定量，校正曲線比較穩(wěn)定，簡便快捷，無污染，易終點(diǎn)比濁法。其優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確定量，校正曲線比較穩(wěn)定，簡便快捷，無污染，易于自動(dòng)化，也適合于大批量標(biāo)本的檢測，在臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。于自動(dòng)化，也適合于大批量標(biāo)本的檢測，在臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。382、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)：利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)：利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的抗原抗體濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的

34、方式和特性，發(fā)展為以下幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)：方式和特性，發(fā)展為以下幾種實(shí)驗(yàn)技術(shù)：（1）單向擴(kuò)散試驗(yàn)：在瓊脂凝膠中混入一定量的抗體，使待測抗原溶液從局部向瓊）單向擴(kuò)散試驗(yàn)：在瓊脂凝膠中混入一定量的抗體，使待測抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。脂內(nèi)自由擴(kuò)散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。39（2）雙向擴(kuò)散試驗(yàn)：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最適當(dāng)?shù)谋壤幮纬桑╇p向擴(kuò)散試驗(yàn)：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在最適當(dāng)?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察沉淀線的位置、形狀及對比關(guān)系，可作抗原和抗體的定性分析?？乖贵w沉淀線，觀察沉淀線的位置、形狀及對比關(guān)系，可作抗原和抗體的定性分

35、析。（3）免疫電泳技術(shù)：是將瓊脂內(nèi)電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種常用的一種免疫學(xué)實(shí)）免疫電泳技術(shù)：是將瓊脂內(nèi)電泳與免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種常用的一種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。有對流免疫電泳、火箭電泳、交叉免疫電泳、免疫電泳、固相免疫電泳等實(shí)驗(yàn)方法。有對流免疫電泳、火箭電泳、交叉免疫電泳、免疫電泳、固相免疫電泳等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。驗(yàn)技術(shù)。40（三）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：（三）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：是經(jīng)典途徑的抗原抗體反應(yīng)之一，應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞和溶血?jiǎng)┳髦甘緞?，建立了檢測抗是經(jīng)典途徑的抗原抗體反應(yīng)之一，應(yīng)用綿羊紅細(xì)胞和溶血?jiǎng)┳髦甘緞⒘藱z測抗原抗體與補(bǔ)體結(jié)合的方法，如檢測梅毒的華氏試驗(yàn)（現(xiàn)已被淘汰）。凡是能激活補(bǔ)體原抗體與補(bǔ)體結(jié)合的方法

36、，如檢測梅毒的華氏試驗(yàn)（現(xiàn)已被淘汰）。凡是能激活補(bǔ)體的的IgG、IgM類抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的反應(yīng)都可以用本法檢測。目前主要用于病毒性類抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的反應(yīng)都可以用本法檢測。目前主要用于病毒性傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及一些自身抗體、腫瘤相關(guān)抗原等的檢測。傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及一些自身抗體、腫瘤相關(guān)抗原等的檢測。 41（四）免疫標(biāo)記技術(shù)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是將多種可以微量或超微量檢測的示蹤物（如熒光素、放射性核素、酶、化免疫標(biāo)記技術(shù)是將多種可以微量或超微量檢測的示蹤物（如熒光素、放射性核素、酶、化學(xué)或生物發(fā)光劑）對抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，制成標(biāo)記物，加入抗原抗體反應(yīng)體系中與相應(yīng)學(xué)

37、或生物發(fā)光劑）對抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記，制成標(biāo)記物，加入抗原抗體反應(yīng)體系中與相應(yīng)未標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，使免疫反應(yīng)結(jié)果可被靈敏地進(jìn)行分析測定?？梢圆粶y定免疫未標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，使免疫反應(yīng)結(jié)果可被靈敏地進(jìn)行分析測定。可以不測定免疫復(fù)合物本身，僅對其中的標(biāo)記物進(jìn)行測定就可確定待測物質(zhì)的含量。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)復(fù)合物本身，僅對其中的標(biāo)記物進(jìn)行測定就可確定待測物質(zhì)的含量。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)具有高度特異性和高度敏感性，由于它具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、操作簡便、易于商品化具有高度特異性和高度敏感性，由于它具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、操作簡便、易于商品化和自動(dòng)化的特點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為生物活性物質(zhì)分析重要的方法之

38、一。和自動(dòng)化的特點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為生物活性物質(zhì)分析重要的方法之一。421、放射免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)是利用放射性核素的靈敏性和精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合放射免疫技術(shù)是利用放射性核素的靈敏性和精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合而創(chuàng)建的一類免疫測定技術(shù)。常用的放射性核素有而創(chuàng)建的一類免疫測定技術(shù)。常用的放射性核素有 125I和和 131I等，主要有兩種基本類等，主要有兩種基本類型：（型：（1）放射免疫分析：是最經(jīng)典的模式，是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反應(yīng)系）放射免疫分析：是最經(jīng)典的模式，是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記的抗原競爭特異性抗體為基本原理來測定抗原含量的分析方法

39、。（統(tǒng)中未標(biāo)記的抗原競爭特異性抗體為基本原理來測定抗原含量的分析方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體方法?？贵w與待測抗原直接結(jié)合，免疫放射分析：是用放射性核素標(biāo)記的過量抗體方法?？贵w與待測抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競爭放射免疫分析。采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競爭放射免疫分析。43放射免疫技術(shù)由于其測定的靈敏度高，特異性強(qiáng)、精密度好，而且可對抗原和半抗原放射免疫技術(shù)由于其測定的靈敏度高，特異性強(qiáng)、精密度好，而且可對抗原和半抗原進(jìn)行測定，對儀器設(shè)備條件要求不高，所以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。常用于各種激素、進(jìn)行測定，對儀器設(shè)備條件要

40、求不高，所以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。其缺點(diǎn)是：放射性污染和危害；微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。其缺點(diǎn)是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期短、不易快速及自動(dòng)化檢驗(yàn)等，已逐步被其它標(biāo)記常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期短、不易快速及自動(dòng)化檢驗(yàn)等，已逐步被其它標(biāo)記免疫分析方法所取代。免疫分析方法所取代。 442、熒光免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法，熒光免疫技術(shù)是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法，是最早發(fā)展的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。其原理

41、是利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上是最早發(fā)展的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。其原理是利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本的待測抗原特異性地結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過或組織切片上與標(biāo)本的待測抗原特異性地結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過濾光板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，然后借濾光板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，然后借助熒光顯微鏡觀察底物片上的熒光染色形態(tài)，判斷待測抗原或抗體。助熒光顯微鏡觀察底物片上的熒光染色形態(tài)，判斷待測抗原或抗體。45熒光免疫技術(shù)在臨床檢驗(yàn)上常用作細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)以及自身抗體的檢測。熒光免疫技術(shù)在臨床

42、檢驗(yàn)上常用作細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)以及自身抗體的檢測。免疫熒光間接染色法可用于測定血清中的抗體，如免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的免疫熒光間接染色法可用于測定血清中的抗體，如免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷方法之一。間接免疫熒光試驗(yàn)是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測瘧檢測是梅毒特異性診斷方法之一。間接免疫熒光試驗(yàn)是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。疾抗體的方法。 463、酶免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)是經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記酶免疫技術(shù)是經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生

43、物放大作用，提高特異性抗原免疫分析技術(shù)。酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。臨床常用的酶免疫技術(shù)是酶聯(lián)免抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。臨床常用的酶免疫技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（見第三章第疫吸附試驗(yàn)（見第三章第3節(jié)）節(jié)）47酶免疫測定除具有高度的敏感性和特異性，酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定，而且易與其他相關(guān)酶免疫測定除具有高度的敏感性和特異性，酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定，而且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，因此發(fā)展迅速。市場上各種符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包被好的技術(shù)偶聯(lián)，因此發(fā)展迅速。市場上各種符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包被好的

44、的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測儀上的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動(dòng)或半自動(dòng)檢測儀上不斷研究發(fā)明問世，極大地促進(jìn)了酶免疫測定技術(shù)的普及。特別是固相載體酶免疫技不斷研究發(fā)明問世，極大地促進(jìn)了酶免疫測定技術(shù)的普及。特別是固相載體酶免疫技術(shù)與膠體金技術(shù)等的結(jié)合，使市場上出現(xiàn)了一大批適用于家庭及床旁檢測的快速試劑術(shù)與膠體金技術(shù)等的結(jié)合，使市場上出現(xiàn)了一大批適用于家庭及床旁檢測的快速試劑盒，大大方便了人群的自我保健和臨床的快速診斷。盒，大大方便了人群的自我保健和臨床的快速診斷。ELISA則應(yīng)用更為廣泛，幾乎所則應(yīng)用更為廣泛，幾乎所有的可溶性

45、抗原抗體系統(tǒng)均可用以檢測。有的可溶性抗原抗體系統(tǒng)均可用以檢測。48該技術(shù)的檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，酶標(biāo)記試劑能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定，該技術(shù)的檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好，酶標(biāo)記試劑能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定，檢測方法簡便安全易行，而且容易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法等。檢測方法簡便安全易行，而且容易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法等。因此，酶免疫技術(shù)在方法學(xué)上的研究重點(diǎn)除與其他標(biāo)記免疫技術(shù)一樣需制備高純度抗因此，酶免疫技術(shù)在方法學(xué)上的研究重點(diǎn)除與其他標(biāo)記免疫技術(shù)一樣需制備高純度抗原和高親和力的特異性抗體外，還包括：選擇高活性的純化標(biāo)記用酶；試驗(yàn)有效的交原和高親和力的特

46、異性抗體外，還包括：選擇高活性的純化標(biāo)記用酶；試驗(yàn)有效的交聯(lián)試劑和交聯(lián)反應(yīng)，制備高質(zhì)量的酶標(biāo)記物；選用適宜的酶作用底物系統(tǒng)；確定有效聯(lián)試劑和交聯(lián)反應(yīng)，制備高質(zhì)量的酶標(biāo)記物；選用適宜的酶作用底物系統(tǒng)；確定有效的分離結(jié)合的分離結(jié)合/游離反應(yīng)物的方法；篩選操作步驟以及研究自動(dòng)化測定技術(shù)等。游離反應(yīng)物的方法；篩選操作步驟以及研究自動(dòng)化測定技術(shù)等。494、金標(biāo)免疫技術(shù)、金標(biāo)免疫技術(shù) 是以膠體金為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。（見第三章第是以膠體金為標(biāo)記物的免疫標(biāo)記技術(shù)。（見第三章第4節(jié)）節(jié)）50第二節(jié)第二節(jié) 免疫膠乳試驗(yàn)及應(yīng)用免疫膠乳試驗(yàn)及應(yīng)用51一、膠乳凝集試驗(yàn)原理及方法一、膠乳凝集試驗(yàn)原理及方法（一）原理：

47、膠乳凝集試驗(yàn)是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。使用抗原（一）原理：膠乳凝集試驗(yàn)是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體的間接凝集試驗(yàn)。使用抗原或抗體致敏膠乳顆粒，再用此致敏膠乳檢測相應(yīng)的抗體或抗原。膠乳凝集試驗(yàn)所用的或抗體致敏膠乳顆粒，再用此致敏膠乳檢測相應(yīng)的抗體或抗原。膠乳凝集試驗(yàn)所用的膠乳顆粒是人工合成的載體，均一性較好，性能比紅細(xì)胞穩(wěn)定，但與蛋白質(zhì)的結(jié)合能膠乳顆粒是人工合成的載體，均一性較好，性能比紅細(xì)胞穩(wěn)定，但與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此膠乳凝集試驗(yàn)敏感性不如血凝試驗(yàn)。力及凝集性能不如紅細(xì)胞，因此膠乳凝集試驗(yàn)敏感性不如血凝試驗(yàn)。52（二）（二） 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)方法：1、膠乳凝

48、集試驗(yàn)：在反應(yīng)板的一格中，先加受檢標(biāo)本一滴，再加致敏膠乳一滴，、膠乳凝集試驗(yàn)：在反應(yīng)板的一格中，先加受檢標(biāo)本一滴，再加致敏膠乳一滴，連續(xù)搖動(dòng)連續(xù)搖動(dòng)23min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陽性。不凝集者為陰性。同時(shí)作陰、陽觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陽性。不凝集者為陰性。同時(shí)作陰、陽性對照。性對照。2、膠乳凝集抑制試驗(yàn)：先加受檢標(biāo)本一滴，再加一滴相應(yīng)抗血清混勻，再加一滴、膠乳凝集抑制試驗(yàn)：先加受檢標(biāo)本一滴，再加一滴相應(yīng)抗血清混勻，再加一滴致敏膠乳抗原，連續(xù)搖動(dòng)致敏膠乳抗原，連續(xù)搖動(dòng)23min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陰性，不凝集者為陽性。觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陰性，不凝集者為陽性。53（三）（三） 注意事項(xiàng)：注

49、意事項(xiàng)：1、受檢標(biāo)本和試劑的加入順序應(yīng)遵照規(guī)定的步驟，否則無法判定結(jié)果。、受檢標(biāo)本和試劑的加入順序應(yīng)遵照規(guī)定的步驟，否則無法判定結(jié)果。2、試劑一般保存在、試劑一般保存在46較為適宜，膠乳試劑不能冷凍，試驗(yàn)前取出待接近室溫時(shí)較為適宜，膠乳試劑不能冷凍，試驗(yàn)前取出待接近室溫時(shí)的溫度再使用。的溫度再使用。3、此試驗(yàn)一般作定性檢測，嚴(yán)格的操作也能達(dá)到半定量的要求。滴加標(biāo)本和試劑時(shí)，、此試驗(yàn)一般作定性檢測，嚴(yán)格的操作也能達(dá)到半定量的要求。滴加標(biāo)本和試劑時(shí)，液滴大小應(yīng)均勻一致，每滴約液滴大小應(yīng)均勻一致，每滴約50l。54二、抗鏈球菌溶血素二、抗鏈球菌溶血素“O”的測定的測定（一）試驗(yàn)原理：在受檢者血清標(biāo)本

50、中，加入適量的溶血素（一）試驗(yàn)原理：在受檢者血清標(biāo)本中，加入適量的溶血素“O”。如標(biāo)本中含有高。如標(biāo)本中含有高單位抗體，中和后則有多余的抗體存在，與溶血素單位抗體，中和后則有多余的抗體存在，與溶血素“O”致敏的膠乳試劑反應(yīng)，可出致敏的膠乳試劑反應(yīng)，可出現(xiàn)清晰而均勻的凝集顆?！，F(xiàn)清晰而均勻的凝集顆粒。55（二）（二） 試驗(yàn)步驟：試驗(yàn)步驟：1、將溶血素、將溶血素“O”貯存液用生理鹽水稀釋到每貯存液用生理鹽水稀釋到每ml含含5和和2.5結(jié)合單位的兩種了應(yīng)用液。結(jié)合單位的兩種了應(yīng)用液。2、血清標(biāo)本、血清標(biāo)本5630min滅活后用生理鹽水作滅活后用生理鹽水作1：50稀釋。稀釋。3、在膠乳試驗(yàn)反應(yīng)板上滴入

51、稀釋血清標(biāo)本、在膠乳試驗(yàn)反應(yīng)板上滴入稀釋血清標(biāo)本1滴，再滴加滴，再滴加2.5結(jié)合單位應(yīng)用液結(jié)合單位應(yīng)用液1滴，輕滴，輕輕搖動(dòng)輕搖動(dòng)3min，使其均勻。，使其均勻。4、滴加、滴加ASO膠乳膠乳1滴，輕輕搖動(dòng)滴，輕輕搖動(dòng)8min，有清晰凝集者為陽性。，有清晰凝集者為陽性。5、將陽性血清用、將陽性血清用5結(jié)合單位應(yīng)用液重復(fù)試驗(yàn)，有清晰凝集者為強(qiáng)陽性。結(jié)合單位應(yīng)用液重復(fù)試驗(yàn)，有清晰凝集者為強(qiáng)陽性。56（三）（三） 臨床意義臨床意義1、陰性者、陰性者250u，陽性者，陽性者ASO在在330500 u，強(qiáng)陽性者，強(qiáng)陽性者ASO在在625 u以上。以上。2、正常健康人、正常健康人ASO水平隨地區(qū)、年齡、氣候

52、、季節(jié)、環(huán)境條件不同而異，通常成人水平隨地區(qū)、年齡、氣候、季節(jié)、環(huán)境條件不同而異，通常成人在在250 u以內(nèi)，以內(nèi)，3歲以下兒童在歲以下兒童在100 u以內(nèi)者均屬正常。以內(nèi)者均屬正常。3、A群溶血性鏈球菌感染后，群溶血性鏈球菌感染后，80%85%的患者的患者ASO升高。升高。35周達(dá)最高值，兩個(gè)月周達(dá)最高值，兩個(gè)月后開始下降，后開始下降，612個(gè)月恢復(fù)到正常水平。用于診斷急性風(fēng)濕熱和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。個(gè)月恢復(fù)到正常水平。用于診斷急性風(fēng)濕熱和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。57（四）注意事項(xiàng)：（四）注意事項(xiàng)：1、患者標(biāo)本應(yīng)新鮮，如被細(xì)菌污染或嚴(yán)重溶血者，可影響結(jié)果，引起假陽性。、患者標(biāo)本應(yīng)新鮮，如被細(xì)菌污染或

53、嚴(yán)重溶血者，可影響結(jié)果，引起假陽性。2、高血脂標(biāo)本，試管或試劑被膽固醇污染均可出現(xiàn)假陽性。、高血脂標(biāo)本，試管或試劑被膽固醇污染均可出現(xiàn)假陽性。3、所用器具應(yīng)清潔，取量要準(zhǔn)確。、所用器具應(yīng)清潔，取量要準(zhǔn)確。584、溶血素、溶血素“O”單位標(biāo)定不準(zhǔn)，?？捎绊懡Y(jié)果。每次試驗(yàn)應(yīng)取一個(gè)已知的單位標(biāo)定不準(zhǔn)，常可影響結(jié)果。每次試驗(yàn)應(yīng)取一個(gè)已知的ASO單位單位的標(biāo)本為對照，如出現(xiàn)偏高或偏低的結(jié)果，應(yīng)重新測定溶血素的標(biāo)本為對照，如出現(xiàn)偏高或偏低的結(jié)果，應(yīng)重新測定溶血素“O”的結(jié)合量。的結(jié)合量。5、鏈球菌溶血素、鏈球菌溶血素“O”在在pH 6.5時(shí)活性最強(qiáng)，偏酸或偏堿均可影響結(jié)果。時(shí)活性最強(qiáng)，偏酸或偏堿均可影響結(jié)

54、果。6、膠乳試劑不可冰凍，放置、膠乳試劑不可冰凍，放置4冰箱可保存一年。不同膠乳商品試劑有不同要求，冰箱可保存一年。不同膠乳商品試劑有不同要求，操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書。操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書。59三、類風(fēng)濕因子三、類風(fēng)濕因子RF的檢測的檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是由自身抗體）是由自身抗體-免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。多發(fā)于免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。多發(fā)于青壯年，女性多于男性?；颊哂捎诟腥尽⒀装Y等原因產(chǎn)生了變性青壯年，女性多于男性?；颊哂捎诟腥?、炎癥等原因產(chǎn)生了變性IgG。變性。變性IgG成為成為自身抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了各種抗變性自身抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了各種抗變

55、性IgG抗體，即類風(fēng)濕因子抗體，即類風(fēng)濕因子RF。變性。變性IgG與與類風(fēng)濕因子結(jié)合，形成中等大小的免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)等部位，激活補(bǔ)體，引類風(fēng)濕因子結(jié)合，形成中等大小的免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)等部位，激活補(bǔ)體，引起慢性漸進(jìn)性免疫炎癥性損害，嚴(yán)重時(shí)可累及心、肺和血管等，免疫學(xué)檢查血清和起慢性漸進(jìn)性免疫炎癥性損害，嚴(yán)重時(shí)可累及心、肺和血管等，免疫學(xué)檢查血清和關(guān)節(jié)滑膜液中出現(xiàn)類風(fēng)濕因子。關(guān)節(jié)滑膜液中出現(xiàn)類風(fēng)濕因子。60（一）試驗(yàn)原理：膠乳凝集法，將熱凝聚（一）試驗(yàn)原理：膠乳凝集法，將熱凝聚IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒表面，如待包被于聚苯乙烯膠乳顆粒表面，如待測血清中含有測血清中含有RF，與相應(yīng)抗原

56、結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。，與相應(yīng)抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。（二）試驗(yàn)步驟：按試劑盒說明書操作，待測血清預(yù)先（二）試驗(yàn)步驟：按試劑盒說明書操作，待測血清預(yù)先5630min滅活，再用滅活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸緩沖液作甘氨酸緩沖液作1：201：80稀釋，取各稀釋度血清一滴，加于反稀釋，取各稀釋度血清一滴，加于反應(yīng)板上，滴加應(yīng)板上，滴加RF膠乳試劑一滴，充分混勻并輕輕搖動(dòng)反應(yīng)板，膠乳試劑一滴，充分混勻并輕輕搖動(dòng)反應(yīng)板，3min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性，集者為陽性，61（三）臨床意義（三）臨床意義 正常人用本法檢測常為陰性。陽性主要見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。另外，

57、干燥綜合正常人用本法檢測常為陰性。陽性主要見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。另外，干燥綜合征、冷球蛋白血癥、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可陽性。征、冷球蛋白血癥、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可陽性。因此因此RF對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者并不具有嚴(yán)格的特異性，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者并不具有嚴(yán)格的特異性，RF陽性不能作為診斷類風(fēng)濕陽性不能作為診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的惟一標(biāo)準(zhǔn)。盡管在多種疾病性關(guān)節(jié)炎的惟一標(biāo)準(zhǔn)。盡管在多種疾病RF可陽性，但是滴度均較低，隨可陽性，但是滴度均較低，隨RF滴度增加。滴度增加。對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷特異性也增高。多種疾病對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷特異性也增高。多種

58、疾病RF測定陽性率如表測定陽性率如表2。62表表2 多種疾病多種疾病RF測定陽性率測定陽性率- 疾病疾病 RF測定陽性率測定陽性率- 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 79.6% 系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性紅斑狼瘡 30% 干燥綜合征干燥綜合征 95% 皮肌炎皮肌炎 80% 硬皮病硬皮病 80% 混合性結(jié)締組織病混合性結(jié)締組織病 25%-63注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：本法檢測出陽性主要為本法檢測出陽性主要為IgM類類RF，陽性血清可連續(xù)雙倍稀釋測效價(jià)。每次試驗(yàn)，陽性血清可連續(xù)雙倍稀釋測效價(jià)。每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陰、陽性對照。其它見膠乳凝集法注意事項(xiàng)。均應(yīng)設(shè)陰、陽性對照。其它見膠乳凝集法注意事項(xiàng)。 64第三節(jié)第三節(jié)

59、酶聯(lián)免疫技術(shù)及應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)及應(yīng)用65一、酶免疫分析技術(shù)一、酶免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)中酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)中使用最廣泛的一種方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、酶標(biāo)記物有效期長等優(yōu)點(diǎn)，使用最廣泛的一種方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、酶標(biāo)記物有效期長等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。66（一）原理和分類（一）原理和分類酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它具有高效性和專一性的特點(diǎn)。酶免疫分析技術(shù)是將酶酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它具有高效性和專一性

60、的特點(diǎn)。酶免疫分析技術(shù)是將酶的催化放大作用和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原或抗體后，的催化放大作用和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原或抗體后，既不影響抗原或抗體免疫反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。免疫反應(yīng)進(jìn)行以后，既不影響抗原或抗體免疫反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。免疫反應(yīng)進(jìn)行以后，酶還能催化相應(yīng)的底物顯色，最后利用酶標(biāo)儀檢測顏色的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。酶還能催化相應(yīng)的底物顯色，最后利用酶標(biāo)儀檢測顏色的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。顯色反應(yīng)顯示酶的存在，表示結(jié)合或游離的酶標(biāo)抗原或抗體的量的變化。顯色反應(yīng)顯示酶的存在，表示結(jié)合或游離的酶標(biāo)抗原或抗體的量