WesternBlot實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

1、western blot 的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)一、實(shí)驗(yàn)步驟1. 緩沖液配制(1 Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加） , 200ml Methanol （臨用前加） ,ddH2O to 1L(210 TBS: 1 M Tris HCl （pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L(3TBST: 1 TBS 中加入 1/1000 的 Tween(4 封閉液：脫脂奶粉5%(w/v, 用 TBST 配制2. SDS-PAGE電泳電壓：積層膠電泳電壓80V 左右，分離膠電泳電壓110V120V3.

2、 免疫印跡(1 SDS 聚丙烯酞胺凝膠電泳結(jié)束后，將膠放至轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15m in，切 6張 Whatman 3mm濾紙和 1 張 PVDF 膜，與凝膠大小相符合。將PVDF 膜事先用甲醇浸泡，再用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡。(2 將凝膠及 PVDF 膜以 “三明治 ”狀 (即 3 層濾紙、凝膠、 PVDF 膜、 3 層濾紙逐 層鋪于轉(zhuǎn)印儀上，凝膠一面連接陰極，100 V 轉(zhuǎn)移 40 min（根據(jù)轉(zhuǎn)移蛋白的分子量確定轉(zhuǎn)移時間）。(3 將膜放入小盒中，加入5 mL 封閉液，搖床上溫育1 h。(4 以 1/1000 的比例，加入 5 L第一抗體， 4 溫育過夜。(5 TBST 溶液洗膜 10 min，輕倒

3、，重復(fù) 3 次。(6 加入 5 mL TBST 溶液，以 1/2000 的比例，加入 2.5第L二抗體，溫育1h。(7 TBST 溶液洗膜 5min ，輕倒，重復(fù) 3 次。(8 加入 2 mL 顯色底物溫育 3 min ，將薄膜封入保鮮袋中，壓平，盡可能不留空氣，濾紙吸干顯色底物。放入夾板中。(9 配制顯影液和定影液。暗室操作：將X 光片放入夾板中，曝光5 s（根據(jù)熒光強(qiáng)度確定），然后放入顯影液中，至出現(xiàn)明顯的條帶取出，水洗后放入定影液中，定影一段時間，取出用水沖洗干凈。二、注意事項(xiàng)1. 在 Western 實(shí)驗(yàn)中，通常有人采用 TBS ，有人采用 PBS ，能否有人解釋一下二者在使用中的區(qū)別

4、？選擇合適的緩沖液對于維持一定 PH 值下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定及保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性是很重要的。 PBS 的緩沖能力強(qiáng)于 TBS （因?yàn)榛旌暇彌_液在一定的離子強(qiáng)度下常常具有更寬的緩沖范圍）， TBS 在 PH7.0 以下緩沖能力較弱（不過 PBS 易污染）。但我們常常要根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進(jìn)行陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選 TBS ；陽離子交換層析時，陰離子緩沖液則首選PBS 。Western blot 中使用 TBS 和 PBS 均可，只是要根據(jù)需要選擇合適的濃度。2. 沒有注明可以用來做Western blot 的一抗，可以用來做Western blot 嗎？不一定 ,

5、因?yàn)橛械目贵w是識別線性表位的 , 有的是識別構(gòu)象型表位的，識別構(gòu)象型表位的抗體不能用于 western blotting，因?yàn)樵?western blotting 中抗體識別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時被破壞。3. 做 Western 每次只加一種一抗，請教有人同時加兩種或者多種一抗的嗎？最好還是不要同時加兩種一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號的話，就說不清楚了。做 Western 在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗， ECL 顯色、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對照的一抗、二抗，ECL顯色、壓片、洗片。4. Western blot 使用

6、的膜哪種最好啊， PVDF 好還是 NC 膜，能介紹一下膜的選擇嗎？PVDF 膜價格較貴，可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)，但價格比較昂貴。 NC 膜價格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF ，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。都可以用麗春紅染色。具體使用還要參考相關(guān)文獻(xiàn)。5. 為什么出現(xiàn)了多條帶 , 每個加樣槽中都出現(xiàn)了多條帶，而且好象都很有規(guī)律 ,為什么 ? 是封閉時間不夠嗎 , 請指教 .做 WESTERN 必須要內(nèi)參嗎？一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應(yīng)，抗體的特異性不強(qiáng)，目的蛋白經(jīng)過處理后發(fā)生變化 , 而內(nèi)參的條帶基本均勻一

7、致 . 這樣才有說服力 , 表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或認(rèn)為的造成目的條帶濃度的變化 . 所以嚴(yán)格意義上說 , 內(nèi)參是必須做的。6. 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20%甲醇（是指終濃度） (優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考蛋白質(zhì)技術(shù)手冊 ，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和 NC 膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度 0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的 NC 膜（ 0.2 微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6。太

8、大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓電流；增加轉(zhuǎn)移時間。7. DAB 顯色、堿性磷酸酶 -抗堿性磷酸酶顯色原理是什么？DAB 顯色在辣根過氧化酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑， DAB 的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。堿性磷酸酶 -抗堿性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結(jié)合而產(chǎn)生有色的、不溶性偶氮染料。8. 酶顯色與熒光顯色之間，各自的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？免疫酶技術(shù)就是用酶 (如辣根過氧化物酶 標(biāo)記已知抗體 (或抗原 ，然后與組織標(biāo)本在一定條件下反應(yīng)，如果組織中含有相應(yīng)抗原 (或抗體 ，抗原抗體相互結(jié)合形成的復(fù)合物中所帶酶分子遇到底物時，能催化底物水解、氧化或還原，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，這樣就可以識別出標(biāo)本抗原 (抗體 分布的位置和性質(zhì)，通過圖像分析并可達(dá)到定量的目的。免疫熒光技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)的研究與診斷，但是熒光抗體染色標(biāo)本不能長期保存，對組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨不清，免疫酶技術(shù)則能克服上述不足，標(biāo)記免疫酶技術(shù)的敏感性更優(yōu)于免疫熒光法，對石蠟切片標(biāo)本尤為適用，為