WB完整步驟課件

1、Western blot 步驟：配膠 制膠跑膠 轉(zhuǎn)移膠（轉(zhuǎn)膜）封閉和孵抗體 掃膜 一.配膠 這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而變小，比率接近1：20時(shí)孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”為1：29配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。 1.分離膠（按照自己目的蛋白的大小說明選擇合適的濃度）2.濃縮膠均可事先配好（除AP及TEMED外），過濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%AP（0.70.8:100,分離膠

2、濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及TEMED（分離膠用0.4:1000,15%的可用到0.3:1000，濃縮膠用0.8：1000） PAGE配膠的試劑和配方比例對電泳結(jié)果的質(zhì)量當(dāng)然有決定性的影響，這個(gè)配膠的比例，在分子克隆上有詳細(xì)的論述，相信大家都不難查到。容易忽視的問題主要在于過硫酸銨（AP）一定要新鮮最好用小指管配AP（寫日期）保存在-20度，超過2周的AP扔掉算了，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多次的AP都別用，二制膠1.灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，即壓線。30分鐘膠濃度10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封

3、膠后切記，勿動(dòng)。 如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴 10%的AP最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好棄掉 過硫酸銨（APS）(10%;w/v) 取3g過硫酸銨，溶于去離子水，至終體積為30mL。此溶液4下在短暫的數(shù)日內(nèi)是穩(wěn)定的，但建議，對每一組新膠均應(yīng)新鮮配制 但搖動(dòng)溶液時(shí)不要過于劇烈以免引入過多地氧氣 2.灌積層膠5%（統(tǒng)一） 40min說明：可延長，寧長勿短。防止凝固不均勻，形成月牙狀。三跑膠1.配制running buffer ：1) tris 3g；2) Glycine:甘氨酸14.4g

4、在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵 的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對于分子質(zhì)量小于15 kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。甘氨酸并非作為緩沖成分參與，而是作為尾隨離子來參與電泳過程3) 10%SDS 10ml；SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中， 與SDS分子按比

5、例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為 特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移 速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分 子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它 的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得

6、分子量。4) 加雙蒸水ddH2O至1000ml 不需調(diào)節(jié)pH2.上樣上樣前蛋白樣品最好離心，上樣量不宜過多，以免看結(jié)果時(shí)，每個(gè)條帶都彎彎地“笑”你貪多嚼不爛哦。所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1loadingbuffer上樣，Marker也用1loadingbuffer調(diào)整至與樣品等體積3.電泳加running buffer其他的操作，按照說明控制電流，不要過多重復(fù)使用電泳running Buffer（別小氣，重復(fù)使用會(huì)降低緩沖能力的），好像基本不會(huì)出問題了。電壓及時(shí)間：70V 40min 大約到分離膠與濃縮膠的交界處。 100/120v 90min當(dāng)預(yù)染的Marker告

7、訴你，你要分辨的蛋白已經(jīng)到達(dá)最佳分辨區(qū)分離膠的2/3處，OK，電泳結(jié)束了。 電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物 溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部. 樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形

8、成一個(gè)各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。 低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通 以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時(shí)改為穩(wěn)壓電泳 注意加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液 凝膠上所加電壓為8V/cm

9、。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm， 四卸膠注意膠勿破！可根據(jù)自己所需要蛋白的大小選擇膠的范圍，maker為標(biāo)志。 五.轉(zhuǎn)移膠（轉(zhuǎn)膜）由于轉(zhuǎn)膜過程中的氣泡問題對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響 切記：每層之間用滴管將其中的氣泡全部趕出，決不允許氣泡存在。 1. trans buffer電轉(zhuǎn)移緩沖液調(diào)Ph 1) tris 5.8g2) 甘氨酸 2.9g3) SDS 0.37g4) 甲醇 200ml轉(zhuǎn)移緩沖液中都含有適量的甲醇，對于分子量較小的蛋白質(zhì)，甲醇能促進(jìn)它們固定在固相紙膜上，但對于大分子量蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)移緩沖液中是不宜加入甲醇的。因甲醇使凝膠孔徑變小，不利于分子量較大

10、的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移出。由于甲醇能將結(jié)合在堿性蛋白質(zhì)上面的SDS解離出來，而使其帶正電或呈電中性，蛋白質(zhì)也就更難從凝膠中轉(zhuǎn)移出。在印跡轉(zhuǎn)移中，轉(zhuǎn)膜成功與否，直接關(guān)系到整個(gè)Western Blotting 的成?。浩渲修D(zhuǎn)移緩沖液，膜的選擇至關(guān)重要。要使蛋白質(zhì)組分能有效地從凝膠轉(zhuǎn)移到固相紙膜上,緩沖液的pH很重要。有些分子量并不是很大的蛋白質(zhì)區(qū)帶，即使延長電轉(zhuǎn)移時(shí)間也不能從凝膠轉(zhuǎn)移到固相紙膜上。這是由于蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液中恰好處于等電點(diǎn)狀態(tài)所造成的，因此應(yīng)適當(dāng)改變轉(zhuǎn)移緩沖液的pH以利于轉(zhuǎn)膜。此外，膜的選擇也很重要.硝酸纖維素NC膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜，重氮化膜和陽離子尼龍膜為最常用的膜，硝酸纖

11、維素NC膜使用得最普遍。因其價(jià)格便宜，使用方便，吸附蛋白質(zhì)容量大，可用各種染色方法進(jìn)行檢測。它的缺點(diǎn)是：與蛋白的結(jié)合為非共價(jià)性，膜干燥后很脆，易碎。重氮化膜則與蛋白形成共價(jià)結(jié)合，有較好的機(jī)械強(qiáng)度，但它只能在那些沒有游離氨基的凝膠緩沖液中使用。陽離子尼龍膜與蛋白是通過離子鍵結(jié)合的，其結(jié)合容量很大，尤其對分子量較小的蛋白質(zhì)結(jié)合特別有效。它有極好的機(jī)械強(qiáng)度，在沖洗和干燥中膜的大小不發(fā)生改變。PVDF膜是用來吸附從各種凝膠中轉(zhuǎn)印的蛋白質(zhì)的最佳用膜。這種疏水膜呈均一控制的孔結(jié)構(gòu)，具有極強(qiáng)的吸附生物分子的能力。與硝酸纖維素膜相比，Immobilon-P膜具有易于操作，染色性能好、抗溶劑能力強(qiáng)和信噪比高的特

12、點(diǎn)，提高了檢測的靈敏度。其開放的孔結(jié)構(gòu)使其容易接近被吸收的蛋白質(zhì)，并去除背景上沒有吸附的探針。可以說，它是免疫檢測理想的印跡膜。此外，膜的孔徑的大小也是需要考慮的重要因素。對于分子量大于20kD的蛋白質(zhì)，需要選擇0.45um的膜，分子量小于20kD，需要選擇0.2um的膜。分子量小于7kD，需要選擇0.2um的膜。有的蛋白質(zhì)由于分子量太大，而很難轉(zhuǎn)膜，針對這種情況，PIERCE專門推出了在膠上做Blotting的試劑盒。將PVDF膜先在甲醇中浸泡幾分鐘,再轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜緩沖液中處理15min。 PVDF膜，125200ug/cm2（適合于SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合） 另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合

13、的蛋白會(huì)因?yàn)橐恍┤ノ蹌┒淮?，因此在封閉時(shí)最好使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果最好） PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡，才能用 如果WB前沒有可參考的資料比如不知道是否有表達(dá)，比如抗體少還要摸條件（稀釋度），可以用剪膜剩下的邊角料來先做幾組點(diǎn)雜交摸條件，省點(diǎn)時(shí)間省點(diǎn)試劑； 切個(gè)小角是常用的方法。膜上要做好標(biāo)記，識別正反面和上下 ，孵抗體是正面朝下，使氣泡往上走。正面充分的結(jié)合抗體，并且掃膜時(shí)掃正面。膜徹底浸潤后顏色會(huì)變深一點(diǎn)，任何白點(diǎn)或者斑都是沒有完全浸潤的標(biāo)志，會(huì)影響轉(zhuǎn)膜的 半干電轉(zhuǎn)移要防止過熱 轉(zhuǎn)膜后，膜上

14、其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限于封閉做的好不好 切記。封閉時(shí)間和封閉劑的量都要足夠。封閉不完全，后面就全白忙活了 六封閉及雜交 可以遵從以下原則：單抗專一性高，但是經(jīng)過SDS-PAGE變性膠電泳的蛋白質(zhì)可能由于原來的識別位點(diǎn)構(gòu)象發(fā)生改變而不被識別，多抗不如單抗專一性高但更容易得到結(jié)果。 一抗的稀釋度通常需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸條件，可以根據(jù)說明書上建議的WB稀釋度附近做23個(gè)梯度，如果是用化學(xué)發(fā)光法檢測，由于靈敏度高而建議將稀釋度再放大一些 反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要

15、留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。 封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時(shí)取200mlPBST或TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。 為使抗體反復(fù)利用，抗體溶劑可不用脫脂奶粉配制1. 脫脂奶粉封閉：5% 37 50r 2h 為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進(jìn)行膜的封閉， 傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會(huì)結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景 某些抗體用BSA封閉時(shí)因不明原因可能會(huì)產(chǎn)生比

16、脫脂奶粉更強(qiáng)的信號，請仔細(xì)閱讀說明書注明的注意事項(xiàng)和膜的特殊的封閉方法 配制5脫脂奶粉或 BSA 溶液：每100 ml TBST中加入5 g脫脂奶粉或 BSA，混勻后過濾，如不過濾會(huì)導(dǎo)致使膜污染上細(xì)微黑顆粒 封閉時(shí)，4C搖動(dòng)，封閉1 hour ，再用TBST洗5秒，進(jìn)入下一步抗體的孵育 TBST的配制 配制1 L TBST：: 量取100 ml 10x TBS 900超純水 1ml Tween20 Tween20非常粘稠，用槍頭不易吸取，請確定加入準(zhǔn)確的量，最好用Tris buffer.配成10的Tween20母液后使用 2. 一抗孵育后洗三次：1:10000(0.5微升抗體：5ml抗體容積)

17、u 第一次PBS 加吐溫 （1：:1000）20 130r 10min一抗溶液中加入0.2%疊氮鈉后可4存放至少2周（一個(gè)月我也用過，沒問題，再長時(shí)間還沒試u 同樣方法洗第二次，第三次各10min 孵育Buffer：按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋一抗，如果說明書沒有建議的稀釋倍數(shù)，則參照一日本最好的貴族學(xué)校般推薦的稀釋倍數(shù)(1:100-1:3000)，一抗?jié)舛冗^高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶 某些實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體，而有些實(shí)驗(yàn)室用不含封閉劑的TBST來孵育抗體，結(jié)果因抗體而異，有時(shí)兩者結(jié)果相同，有時(shí)結(jié)果不同 注：如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 0.25脫脂

18、奶粉或 BSA的封閉液來,稀釋，可產(chǎn)生相對更強(qiáng)的信號條帶 孵育時(shí)間：一抗的孵育時(shí)間可從幾小時(shí)至過夜（一般不超過18小時(shí)）不等，取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度，建議使用較高的抗體稀釋倍數(shù)和較長的孵育時(shí)間來保證特異性結(jié)合 孵育溫度：盡可能低溫孵育，如果在封閉液中孵育一抗過夜，應(yīng)在4oC進(jìn)行否則會(huì)產(chǎn)生污染而破壞蛋白（降別是磷酸基團(tuán)） 3. 二抗的孵育 1:1000洗膜兩次，第二次時(shí)不加吐溫一抗孵育結(jié)束后，用TBST搖動(dòng)洗膜3次，每次10min或更長，去除殘留的一抗 孵育Buffer和稀釋倍數(shù)：用TBST按說明書推薦的倍數(shù)稀釋二抗，如果說明書沒有標(biāo)出稀釋倍數(shù)，則按常規(guī)的倍數(shù)稀釋(1:1000

19、- 1:20,000)預(yù)試，二抗的濃度過高也會(huì)導(dǎo)致非特異性條帶亦可以在封閉液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同時(shí)導(dǎo)致特異性易簡兒童理發(fā)器條帶的信號也減弱，可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結(jié)合 孵育時(shí)間和溫度：室溫、1-2 hours, 搖動(dòng) 二抗連接物：推薦使用二抗連接HRP，不建議連接AP堿性磷酸酶，因其不夠靈敏孵育一抗時(shí)需保持適當(dāng)?shù)膿u動(dòng)使之均勻覆沒膜，防止結(jié)合不均勻C 轉(zhuǎn)膜與顯色（Western Blot） C-1 膠中蛋白的檢測 電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬斯藍(lán)染色檢測，如果凝膠中的蛋白需要進(jìn)行轉(zhuǎn)膜則需可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯藍(lán)法染色 銅染法：電泳膠

20、用蒸餾水洗數(shù)秒鐘，加入0.3 M CuCl2染色5-10分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶，膠置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次，再置于電轉(zhuǎn)緩沖液中開始轉(zhuǎn)膜 考馬斯藍(lán)法：用40雙蒸水, 10 醋酸, 50甲醇的溶液固定膠中蛋白，考馬斯藍(lán)R-250染液（凱基產(chǎn)品）室溫染色4小時(shí)至過夜，保持搖勻，轉(zhuǎn)入67.5雙蒸水, 7.5 醋酸, 25甲醇l搖勻至脫去多余的染料，蛋白被染成深藍(lán)色 C-2 蛋白轉(zhuǎn)膜 蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，在電場下從膠中轉(zhuǎn)至膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電轉(zhuǎn)儀制造商的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和

21、濕轉(zhuǎn)兩種，半干式轉(zhuǎn)膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白 濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列為：海綿/紙/膠/膜/紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向確認(rèn)正確負(fù)極方為帶負(fù)電的膠里的蛋白，向正極方（膜）電遷移 標(biāo)準(zhǔn)的電轉(zhuǎn)緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20甲醇，如果提亮膚色的粉底轉(zhuǎn)膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS使之終濃度為01 半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為：/紙/膠/膜/紙，用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕后，直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間膠于負(fù)極而膜置于正極半干式的電轉(zhuǎn)緩沖液可不同于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液，推薦為：48 m

22、M Tris, 39 mM glycine, 0.04 SDS, 20甲醇， 兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和PVDF膜（正電荷尼龍膜），根據(jù)不同需要選擇（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分鐘，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡3-5分鐘，否則轉(zhuǎn)膜時(shí)會(huì)導(dǎo)致條帶變形 注：大蛋白和小蛋白的轉(zhuǎn)膜 電轉(zhuǎn)移緩沖液中SDS與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果，如下調(diào)整可以增加轉(zhuǎn)膜效率： 大蛋白（大于100 KD） 1對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應(yīng)該用低濃度的凝膠，8或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所

23、以操作時(shí)需十分小心， 2 大蛋白易在凝膠里形成湊集沉淀，因此；轉(zhuǎn)膜時(shí)在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度為0.1的SDS，以避免出現(xiàn)這種情況，甲醇易便SDS從蛋白上脫失，因此應(yīng)降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至10或更低，以防止蛋白沉淀 3 降低電轉(zhuǎn)移緩沖深圳水晶文具源發(fā)液中甲醇的比例以促進(jìn)凝膠的膨脹，易于大蛋白的轉(zhuǎn)出 4 如果使用硝酸纖維素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)移緩沖液中，但轉(zhuǎn)膜前PVDF需用甲醇活化 5 選擇濕式，4轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜 小蛋白（小于100 KD 1 SDS妨礙蛋白與膜的結(jié)合，特別是對小蛋白更是如此，因此，對于小分子的蛋白，電轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加SDS 2 保持20的甲醇濃度 對于大于500KD的蛋白，請參考下述文獻(xiàn)：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of pro