九原生質(zhì)體融合原理技術(shù)應(yīng)用PPT課件

1、歷史沿革基本原理主要實驗技術(shù)第2頁/共28頁第1頁/共28頁011、早期嘗試期早期嘗試期2、基礎(chǔ)研究期基礎(chǔ)研究期 營養(yǎng)營養(yǎng)3、新技術(shù)建立時期新技術(shù)建立時期 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合 植物細胞固化植物細胞固化 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體體 體細胞克隆與變異體細胞克隆與變異4 4、植物生物技術(shù)期植物生物技術(shù)期 與基因工程結(jié)合與基因工程結(jié)合 產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)業(yè)化第3頁/共28頁第2頁/共28頁02滅菌培養(yǎng)基培養(yǎng)保存第4頁/共28頁第3頁/共28頁021植物材料 滅菌前處理、表面滅菌劑、內(nèi)感染2培養(yǎng)基 濕熱、過濾3器皿和工具 干熱、濕熱、火焰灼燒4培養(yǎng)室5無菌技術(shù) 超凈工作臺 100級滅菌滅菌第5頁/共2

2、8頁第4頁/共28頁02水 雙蒸水以上無機鹽 大量 微量有機成分 碳源 蔗糖 葡萄糖 氨基酸 幾種常用的 有能力合成，但刺激生長 產(chǎn)物合成前體 多種混合 維生素 有能力，但不夠 幾種常用的培養(yǎng)基培養(yǎng)基第6頁/共28頁第5頁/共28頁02生長調(diào)節(jié)劑 生長素 細胞激動素 促進分裂 打破頂芽休眠 促進莖的分化 赤霉素和脫落酸不確定成分混合物其他物質(zhì) 瓊脂 活性炭 去除植物細胞產(chǎn)生的 酚類、氧化物、丹寧PH 滅菌前5-6培養(yǎng)基培養(yǎng)基第7頁/共28頁第6頁/共28頁02儀器設(shè)備 常用儀器設(shè)備 培養(yǎng)器皿和設(shè)備 實驗室設(shè)置培養(yǎng)條件 溫度 低于植物生長溫度3-4 光照 用于分化的細胞和光自養(yǎng)型細胞 氧培養(yǎng)類型

3、 愈傷組織 生長迅速 疏松 非褐化 單細胞培養(yǎng) 懸浮細胞培養(yǎng) 大量培養(yǎng) 發(fā)酵罐 生物反應(yīng)器 植物細胞與微生物比較 固定細胞培養(yǎng) 特點 轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)第8頁/共28頁第7頁/共28頁03愈傷組織培養(yǎng)單細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)大量培養(yǎng)固定細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)細胞保存第9頁/共28頁第8頁/共28頁03愈傷組織培養(yǎng)1外植體的選擇 外植體的來源 部位 年齡 生理狀態(tài) 外植體的大小2培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基的配制 大量成分 微量成分 有機成分 鐵、激動素 按比例混合 調(diào)酸堿 定容 分裝 滅菌 定容后加瓊脂 融化 定容 培養(yǎng)基的選擇 外植體 培養(yǎng)基 生長素 激動素四因子3愈傷組織的誘導(dǎo) 接種材料的滅菌 莖段

4、和葉：蠟質(zhì) 表面活性劑擦 種子：一般的采用莖段和葉片的方法 根和地下器官無菌操作愈傷組織的培養(yǎng)第10頁/共28頁第9頁/共28頁03單細胞培養(yǎng)1單細胞的分離 機械法 酶法 懸浮培養(yǎng)法 愈傷組織在振蕩器中培養(yǎng)， 過濾得到單細胞2單細胞的培養(yǎng) 看護培養(yǎng)：將親本愈傷組織或高密度的懸浮細胞同低密度細胞一起培養(yǎng)，以促進低密度細胞生長、分裂的培養(yǎng)方法。 鋪板培養(yǎng) 微室培養(yǎng) 第11頁/共28頁第10頁/共28頁03懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)的建立 細胞系的建立 松散色淡的愈傷組織轉(zhuǎn)入懸浮五代以上 培養(yǎng) 接種量1/5、1/2、1/10 繼代培養(yǎng) 生長模式 封閉系統(tǒng)中S型曲線培養(yǎng)基的選擇 培養(yǎng)基的特點 酸堿緩沖能

5、力差 生長素的濃度 條件培養(yǎng) 低密度培養(yǎng)液中放高密度培養(yǎng)懸浮細胞的透析袋細胞生活力和生長的測定 生活力測定 熒光素二乙酸酯法、伊萬蘭染色法 細胞生長的測定 細胞計數(shù)法、干重、鮮重、堆積細胞體積法 第12頁/共28頁第11頁/共28頁03大量培養(yǎng)1高產(chǎn)細胞系的篩選 顏色目視（紫草素） 化學(xué)分析（生物堿）2種子的準備 逐級繼代培養(yǎng)3生物反應(yīng)器的設(shè)計 獲得產(chǎn)品生物反應(yīng)器 得到細胞發(fā)酵罐4培養(yǎng)條件的最適化 混合、通氣、剪切力、溫度、PH5培養(yǎng)系統(tǒng)的操作 成批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)6測定方法 電導(dǎo)率測定、kla測定 第13頁/共28頁第12頁/共28頁03固定細胞培養(yǎng)細胞固定 在膠體中固定植物細胞

6、在網(wǎng)或泡沫中固定 空心纖維膜中固定固定細胞反應(yīng)器的設(shè)計 流動床式 固定床式第14頁/共28頁第13頁/共28頁03轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 根瘤農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化細胞的建立 葉片 懸浮液 不要沒過 誘導(dǎo)愈傷組織 轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng) 農(nóng)桿菌質(zhì)粒中攜帶生長素基因轉(zhuǎn)化細胞的分析 轉(zhuǎn)化細胞的篩選 抗性基因 報道基因 標記基因 外源基因表達 產(chǎn)物積累（生物、免疫、化學(xué)）第15頁/共28頁第14頁/共28頁03細胞保存冷凍保存 冷凍 慢凍 快凍 莖尖保存 分部凍 莖尖 芽 懸浮培養(yǎng) 慢 中間溫度30min 液氮快 干凍 真空脫水 液氮保藏 維持 融冰 液氮迅速37-40度90s后 室溫 再培養(yǎng)冷藏保存 1-9度下仍需繼代培

7、養(yǎng)低壓保存低氧保存第16頁/共28頁第15頁/共28頁植物細胞中主要生理活性物質(zhì)和其他化學(xué)組分植物細胞技術(shù)的優(yōu)缺點應(yīng)用實例一二三第17頁/共28頁第16頁/共28頁011.生理活性物質(zhì)（1）酶類:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶（2）維生素:輔酶（3）植物激素（4）抗生素和植物殺菌素:蒜，蔥，蘿卜第18頁/共28頁第17頁/共28頁012.其他成分（后含物）（1）生物堿:罌粟科，茄科（2）糖苷類:洋地黃毒苷（3）揮發(fā)油:薄荷油，丁香油（4）有機酸:蘋果酸，檸檬酸，水楊酸第19頁/共28頁第18頁/共28頁03工業(yè)化產(chǎn)品希臘毛地黃細胞 生物轉(zhuǎn)化 地高辛地高辛日本黃連細胞 黃連堿黃連堿人參根細胞 人參皂甙人

8、參皂甙中試水平長春花 吲哚生物堿丹參 丹參酮青蒿 青蒿素紅豆杉 紫杉醇紫草 萘醌三七 皂甙第20頁/共28頁第19頁/共28頁021、不受地區(qū)、季節(jié)、土壤及有害生物的影響2、節(jié)約農(nóng)田 3、在無菌條件下完成的, 能排除病菌及蟲害對藥用植物的侵擾; 4、研究植物的代謝途徑, 探索或創(chuàng)造新的合成路線5、人工控制提高代謝物產(chǎn)量 優(yōu)點第21頁/共28頁第20頁/共28頁02(1)生長周期長,易污染。(2)生物反應(yīng)器的設(shè)計裝置要求較高。(3)高產(chǎn)細胞株較難獲得。缺點第22頁/共28頁第21頁/共28頁03發(fā)狀根、冠癭組織細胞培養(yǎng)技術(shù) 激素自主 增殖快常規(guī)細胞 次生代謝物含量高、種類廣懸浮培養(yǎng)細胞 桔味薄荷

9、冠癭細胞 萜烯 洋地黃冠癭細胞 強心甙 丹參冠癭細胞 丹參酮 長春花冠癭細胞 吲哚生物堿 人參發(fā)狀根培養(yǎng) 人參皂甙 長春花發(fā)狀根培養(yǎng) 長春堿 青蒿發(fā)狀根培養(yǎng) 青蒿素 蘿芙木發(fā)狀根培養(yǎng) 生物堿第23頁/共28頁第22頁/共28頁03兩相培養(yǎng)技術(shù) 培養(yǎng)體系形成上、下兩相,細胞在水相中生長與合成次生物質(zhì),然后分泌出來轉(zhuǎn)移到有機相中。 減少減少反饋抑制反饋抑制 產(chǎn)量產(chǎn)量提高提高 有機相循環(huán)使用有機相循環(huán)使用, ,連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng), ,成本降低成本降低 長春花細胞 XAD-7大孔吸附樹脂 吲哚生物堿 花菱草懸浮細胞 液體硅膠 血根堿 第24頁/共28頁第23頁/共28頁03 美國 白細胞介素 荷蘭 轉(zhuǎn)基因馬鈴薯 血清白蛋白 南朝鮮 轉(zhuǎn)基因煙草和番茄 人胰島素 BoyceThompson研究所 馬鈴薯 食用霍亂疫苗 美國 開發(fā)研究煙草 治療人類高歇氏病和費勃萊氏病的酶 新思路：以病毒為載體在植物中生產(chǎn)藥用蛋白，還處在實驗階段藥用蛋白(1)易吸收(2)安全(3)簡化下游純化工藝第25頁