谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶目錄第一、介紹第一、介紹第二、分離與純化第二、分離與純化第三、理化性質(zhì)的研究第三、理化性質(zhì)的研究第四、應(yīng)用前景第四、應(yīng)用前景第一、介紹第一、介紹 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶( transglutaminase，ec2 3 213，簡(jiǎn)稱tgase) 是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它具有多種催化功能，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)，從而直接改變蛋白質(zhì)本身及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)和功能特性。 因此，tgase 在食品、生物醫(yī)藥、組織工程、紡織和皮革工業(yè)中都有著廣泛的應(yīng)用前景。第二、分離與純化第二、分離與純化

2、1.1 主要儀器和試劑j2-mc 微控高速冷凍離心機(jī)；imagemaster vds 膠成像分析系統(tǒng)；冷凍干燥機(jī)。n-cbz-gln-gly、l-谷氨酸-單羥肟酸、還原型谷胱甘肽、羥胺。香菇、平菇、金針菇、杏鮑菇等。1.2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活測(cè)定方法 grossowicz 比色法測(cè)定酶活力， 以n-cbz-gln-gly 和羥胺為作用底物， 以l-谷氨酸-單羥肟酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。一個(gè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力單位定義為：37 時(shí)每分鐘催化形成1 mol l-谷氨酸-單羥肟酸的酶量為一個(gè)酶單位。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶活： 酶活力/（u /ml）=7.983 5a525稀釋倍數(shù)/101.3 提取 經(jīng)過初步試驗(yàn)，確定

3、食用菌中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種胞外酶。從新鮮香菇子實(shí)體中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶的工藝流程為： 分別測(cè)定香菇、平菇、金針菇、杏鮑菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗提液的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性，結(jié)果分別為0.261、0.116、0.115、0.276 u/ml。可見不同菌種的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性有較大的差異，香菇和杏鮑菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性較強(qiáng)，平菇、金針菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的酶活性較弱，從它們的比活性來看，杏鮑菇最高，但市場(chǎng)上杏鮑菇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比香菇貴，且香菇容易獲得，所以選用香菇作為以后的試驗(yàn)材料。超濾方法超濾方法 采用wb-3 型的中空纖維膜， 截留分子量為30 000 u，在加冰冷卻的條件下，保持泵出水壓為

4、0.4mpa，對(duì)粗酶濾液進(jìn)行超濾循環(huán)，直到達(dá)到相應(yīng)的濃縮倍數(shù)，收集濃縮液。乙醇沉淀乙醇沉淀 取粗提取液100 ml，按v（提取液）v（乙醇）=11；v（提取液）v （乙醇）=11.5；v（提取液）v（乙醇）=12體積分?jǐn)?shù)比分別加入經(jīng)預(yù)冷至0 的95 乙醇，迅速攪拌，將混和液離心（3 ，10 000 r/min，10 min），所得沉淀用0.2 mol/l tris-hcl 緩沖液（ph6.0）溶解，再次以相同的條件離心，取上清液定容于100 ml，測(cè)定酶活，計(jì)算酶活收率。 （酶活收率分別為40 、387 、408 ）丙酮沉淀法丙酮沉淀法 實(shí)驗(yàn)方法與乙醇相同。（酶活收率為59.2 ）飽和硫酸銨沉

5、淀飽和硫酸銨沉淀 室溫下， 加不同量的硫酸銨到100 ml 經(jīng)超濾后的提取液（預(yù)冷至0）中，形成濃度為20、40、60、80的硫酸銨溶液，保持6 h 后，離心（10 000 r/min、3、5 min）， 將所得沉淀用0.2 mol/l tris -hcl 緩沖液（ph6.0）溶解，再次以相同的條件離心，取上清液定容于100ml，測(cè)定酶活，計(jì)算酶活收率。（在60%時(shí)酶活最高，達(dá)到56.9%）不同沉淀法對(duì)酶收率的影響不同沉淀法對(duì)酶收率的影響 分別采用60 %飽和硫酸銨沉淀、95 %乙醇與丙酮沉淀法對(duì)粗酶進(jìn)行沉淀分離，3 種沉淀法的酶活收率分別為569 %、436 %、59.2 %。 結(jié)果表明用丙

6、酮和飽和硫酸銨沉淀的酶活收率要比乙醇沉淀酶活收率稍高一些。但是飽和硫酸銨沉淀法在酶液中引入了水溶性無機(jī)鹽， 需要進(jìn)行脫鹽等步驟，較繁瑣。有機(jī)溶劑沉淀法則不需脫鹽及多次分離等步驟，過程短，且其為揮發(fā)性液體，在干燥中可揮發(fā)成氣體而不殘留， 或僅留其痕跡。而考慮到作為食品用酶，最好不用丙酮沉淀法，所以最終采用乙醇沉淀。第三、理化性質(zhì)的研究第三、理化性質(zhì)的研究3.1 3.1 粗酶的最適溫度粗酶的最適溫度 冷凍干燥后的粗酶制成酶液分別在20、30、40、50、60 下測(cè)定酶活，以最高點(diǎn)酶活為100 %。3.2 3.2 溫度對(duì)粗酶穩(wěn)定性的影響溫度對(duì)粗酶穩(wěn)定性的影響 冷凍干燥后的粗酶制成酶液， 分別在20、

7、30、40、50、60 的水浴中保留10 min，用冰浴快速冷卻，然后在37下測(cè)定酶活，以未經(jīng)處理的酶液酶活為100%。3.3 ph 3.3 ph 對(duì)粗酶穩(wěn)定性的影響對(duì)粗酶穩(wěn)定性的影響 分別將酶液ph 值調(diào)節(jié)至（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）， 于4 放置12 h， 取出調(diào)節(jié)各樣品的ph 至6.0，37 測(cè)定各樣品酶活， 以未經(jīng)處理的酶液酶活為100 %。計(jì)算相對(duì)酶活，得出曲線。3.4 3.4 粗酶的最適粗酶的最適phph 將酶液的ph 值調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 測(cè)定酶活， 以最高點(diǎn)相對(duì)酶活為100 %，作出曲線

8、。3.5 3.5 金屬離子對(duì)酶活的影響金屬離子對(duì)酶活的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入相同濃度（1 mg/l）的各種金屬離子（ca2+、na+、k+、mg2+、cu2+），37 保溫10 min測(cè)定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶酶活。以不加任何金屬離子的酶活為參照。3.6 3.6 底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響 分別加入底物（0.03 mol/l） 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，每支試管各加入0.2 ml 濃縮酶液，37 反應(yīng)10 min，各管加0.2 mol/l tris-hcl 緩沖液至1.6 ml，分別測(cè)定酶活性，求出反應(yīng)速率，采用lineweaver-burk 雙

9、倒數(shù)法求得米氏常數(shù)km 和最大反應(yīng)速率vmax。3.7 3.7 純酶的最適溫度純酶的最適溫度 取濃縮酶液，分別在20、30、40、50、60 下測(cè)定酶活，以最高點(diǎn)酶活為100 %。 由圖2 可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶的最適溫度在40 左右， 在30 50 范圍內(nèi)有較高活性，當(dāng)溫度大于50 后活性急劇下降。 從圖3 可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶在50 以下保持其穩(wěn)定性，高于50 時(shí)酶的穩(wěn)定性變差，活性喪失較快。這是因?yàn)槊冈诜€(wěn)定升高到一定限度時(shí)，就會(huì)發(fā)生高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化失去部分催化活性， 酶發(fā)生的肽鏈伸展隨穩(wěn)定不同而有不同的伸展速度，溫度越高，肽鏈伸展加深，直至變性，完全失去活性。 由圖4 可見，

10、香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最適反應(yīng)ph為6.0。 從圖5 可看出，粗酶在ph5.07.0 左右穩(wěn)定性最好。結(jié)果如表2 所示，離子強(qiáng)度對(duì)酶活的影響不大 由圖6 可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，酶促反應(yīng)速度顯著加快， 當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.5 g/l時(shí)反應(yīng)速度不再顯著增加，酶促反應(yīng)速率接近vmax。 做lineweaver-burk 圖（圖7），根據(jù)測(cè)定結(jié)果得到米氏方程1/v=74.5931/s+49.07，vmax=0.020 g/（lmin），米氏常數(shù)km=1.520 g/l。 從圖8 可以看出， 純酶的相對(duì)酶活溫度曲線與粗酶大致相同，最適溫度也在40 左右，但在30 50 的范圍內(nèi)都具有較

11、高的酶活性。3.8 3.8 結(jié)論結(jié)論 香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶和純酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示：香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶最適溫度為40，溫度穩(wěn)定范圍在50 以下，最適ph 6.0，ph 穩(wěn)定范圍為ph5.07.0。香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶促反應(yīng)的vmax 為0.020 g/（lmin），米氏常數(shù)km 為1.520 g/l 。na+、ca2+、pb2+、k+、mg2+、cu2+ 等離子對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶酶活影響甚微，該酶為非ca2+依賴性酶。第四、應(yīng)用前景第四、應(yīng)用前景 谷氨酰胺酶在食品、醫(yī)藥（研究癌細(xì)胞方面）、紡織（如改善羊毛制品性能）等方面都有廣闊的應(yīng)用前景，其中在食品行業(yè)應(yīng)用最受關(guān)注。4.1 4.1

12、在肉制品中的應(yīng)用在肉制品中的應(yīng)用 肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是肌肉的重要組成成分，是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的良好底物。在肉制品加熱時(shí)，彼此間能夠形成二硫鍵，對(duì)維持肉制品的保水性和粘彈性等方面起著重要的作用。在肉制品中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，經(jīng)催化反應(yīng)在肌肉蛋白質(zhì)分子間形成的共價(jià)鍵的作用力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于二硫鍵，能使蛋白質(zhì)更緊密地結(jié)合在一起，形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顯著提高了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、改善了肉制品品質(zhì)、增加了產(chǎn)品的附加價(jià)值。4.2 4.2 在乳制品中的應(yīng)用在乳制品中的應(yīng)用 乳制品中的酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的良好底物，所以谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在乳制品加工中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。牛乳酪蛋白是重要的食品蛋白質(zhì)，在許多食品的加工中，加入酪蛋白可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)9。經(jīng)過谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶改性后的酪蛋白，在功能性質(zhì)方面得到顯著增強(qiáng)，是優(yōu)良的食品添加劑，可應(yīng)用于焙烤食品、冰淇淋，也可作為脂肪的替代物，用于香腸、重組肉制品、魚制品。4.3 4.3 在水產(chǎn)品中的應(yīng)用在水產(chǎn)品中的應(yīng)用 魚肉在低溫下可形成凝膠，這與其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的含量有關(guān)。新鮮的魚含有較多的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，可以生產(chǎn)出高品質(zhì)的魚凝膠制品，但經(jīng)過冷凍貯藏后的魚，其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的含量隨新鮮程度的下降而減少，因此可以通過加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺