外源基因的表達課件

1、外源基因的表達外源基因的表達外源基因的表達外源基因的表達第一節(jié)第一節(jié) 基因表達的機制基因表達的機制 1.外源基因的轉(zhuǎn)錄外源基因的轉(zhuǎn)錄 2.mRNA的延伸與穩(wěn)定性的延伸與穩(wěn)定性 3.外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯 4.表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性 5.目的基因的沉默目的基因的沉默外源基因的表達1.外源基因的轉(zhuǎn)錄外源基因的轉(zhuǎn)錄 啟動子類型： 組成型啟動子 原核生物T7啟動子 誘導型啟動子 原核生物lac、trp等 組織特異性表達啟動子 外源基因的表達2.mRNA的延伸與穩(wěn)定性的延伸與穩(wěn)定性 原核生物避免序列存在衰減子(attenuator) 帶有正常轉(zhuǎn)錄終止序列

2、受體細胞情況 外源基因的表達ABtrp衰減子衰減子外源基因的表達帶有正常轉(zhuǎn)錄終止序列帶有正常轉(zhuǎn)錄終止序列 真核生物要帶有轉(zhuǎn)錄終止序列與poly(A) 滲入位點 poly(A)滲入信號序列AAUAAA外源基因的表達受體細胞情況受體細胞情況原核生物原核生物 最佳選擇RNase缺失個體真核生物真核生物 mRNA正確加工，提高穩(wěn)定性外源基因的表達3.外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯 原核生物原核生物 AUG(ATG)首選起始密碼子 SD序列 SD與起始翻譯密碼子間合適距離 翻譯起始區(qū)周圍不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)外源基因的表達真核生物真核生物 具有類似于SD序列的保守區(qū)CCA(G)CCATGG

3、 對于翻譯效率仍然十分重要 密碼子偏愛性 主密碼子(major codon) 罕用密碼子(rare codon)外源基因的表達翻譯終止翻譯終止 UAA UAG UGA釋放因子釋放因子(release factor) 原核 RF1 UAA UAG RF2 UAA UGA 真核 兩種eRF UAA 終止效率最高外源基因的表達4.表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性表達蛋白在細胞中的穩(wěn)定性 受體細胞存在的蛋白水解酶可降解外源蛋白 避免或降低被水解的途徑避免或降低被水解的途徑: 構(gòu)建融合蛋白表達系統(tǒng) 構(gòu)建分泌蛋白表達系統(tǒng) 構(gòu)建包涵體表達系統(tǒng) 選擇蛋白水解酶缺陷型受體系統(tǒng)外源基因的表達5.目的基因沉默目的基因沉默

4、基因沉默基因沉默(gene silencing) 位置效應 轉(zhuǎn)錄水平(TGS) 甲基化 轉(zhuǎn)錄后(PTGS) siRNA外源基因的表達1.啟動子啟動子(promoter) 序列特異性 方向性 順式調(diào)控元件 位置特性 轉(zhuǎn)錄區(qū)上游 種屬特異性 第二節(jié)第二節(jié) 基因表達調(diào)控元件基因表達調(diào)控元件外源基因的表達(1)原核生物啟動子原核生物啟動子 轉(zhuǎn)錄起始位點 Pribnow框 Sextama框 間隔區(qū)外源基因的表達(2)真核生物啟動子真核生物啟動子 I型啟動子 rRNA II型啟動子 mRNA TATA框 CAAT框 GC框 III型啟動子 tRNA 5SrRNA sRNA 外源基因的表達(3)啟動子與轉(zhuǎn)錄

5、的啟動啟動子與轉(zhuǎn)錄的啟動 原核亞基參與起始 真核生物轉(zhuǎn)錄啟動較復雜外源基因的表達(4)啟動子的分離啟動子的分離 隨機克隆法 HindIII EcoRI聚合酶保護法 ABA B加入聚加入聚合酶合酶外源基因的表達過濾膜結(jié)合法PCR方法外源基因的表達2.增強子增強子(enhancer) 雙向性 重復序列 與所處位置無關 特異性 可增強異源基因外源基因的表達3.終止子終止子(terminator) 常用大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2 噬菌體上T4.衰減子衰減子(attenuator)5.絕緣子絕緣子(insulator)6.反義子反義子(antisense RNA)外源基因的表達第三節(jié)第三節(jié)

6、 外源基因表達系統(tǒng)外源基因表達系統(tǒng)原核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng) 外源基因的表達目前廣泛應用的為原核系統(tǒng)特點目前廣泛應用的為原核系統(tǒng)特點 大腸桿菌、芽胞桿菌、鏈霉菌等 單細胞、生長快、易控制 基因組結(jié)構(gòu)簡單 含質(zhì)?；蚴删w 生理代謝途經(jīng)與基因表達調(diào)控比較清楚 不具備真核生物蛋白加工系統(tǒng) 內(nèi)源蛋白酶會降解外源蛋白，表達產(chǎn)物不穩(wěn)定外源基因的表達一一.大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng) 1.大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體 (1)復制子復制子 高拷貝 pMB1、p15A、ColE1等 低拷貝 pSC101等 (2)啟動子與終止子啟動子與終止子外源基因的表達 (3)核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點(SD) AGG

7、AGG 翻譯起始密碼子與SD的距離 SD后為AAAA或UUUU效率最高 (4)密碼子密碼子 (5)選擇標記選擇標記外源基因的表達2.宿主菌宿主菌 蛋白水解酶缺陷型 菌株如:BL21等外源基因的表達3.常見大腸桿菌表達系統(tǒng)常見大腸桿菌表達系統(tǒng) Lac和和Tac標達系統(tǒng)標達系統(tǒng) 以lac操縱子調(diào)控機 制為基礎設計和構(gòu)建 的表達系統(tǒng) 外源基因的表達阻遏蛋白過量表達阻遏蛋白過量表達 當帶lac操縱區(qū)的基因多拷貝存在，lacI表達的阻遏蛋 白不夠用時，采用阻遏蛋白過量表達突變體 lacI突變體lacIq 溫度敏感型突變體lacIq(ts) 30C抑制表達 42C轉(zhuǎn)錄保持開放外源基因的表達PL和和PR表達

8、系統(tǒng)表達系統(tǒng) cI基因表達蛋白阻遏PL和PR表達 cI基因溫度敏感型突變體cI857(ts)T7表達系統(tǒng)表達系統(tǒng) T7噬菌體RNA聚合酶高效率轉(zhuǎn)錄 在大腸桿菌內(nèi)，存在T7噬菌體RNA聚合酶 下，T7啟動子可高效轉(zhuǎn)錄外源基因的表達4.外源基因在大腸桿菌表達的形式外源基因在大腸桿菌表達的形式 外源基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物可能 存在于： 細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)、細胞外培養(yǎng)基 表達蛋白形式表達蛋白形式 可溶性蛋白 不可溶性蛋白外源基因的表達包涵體包涵體 (inclusion body)表達蛋白表達蛋白一定條件下，外源基因的表達產(chǎn)物在大腸桿菌中積累，并致密地聚集在一起，形成無膜的或被膜的裸露結(jié)構(gòu)分布位置分布

9、位置主要存在于細胞質(zhì)中，也存在于細胞周質(zhì)構(gòu)成構(gòu)成主要為表達的外源蛋白，還有RNA聚合酶、核糖核蛋白體等，此外還包括一些DNA、RNA、脂多糖等非蛋白成分外源基因的表達包涵體的形成包涵體的形成 折疊狀態(tài)的蛋白聚集作用折疊狀態(tài)的蛋白聚集作用 高表達導致水難溶的折疊態(tài)蛋白分子間相互作 用而聚在一起 非折疊態(tài)的蛋白聚集作用非折疊態(tài)的蛋白聚集作用 在較高培養(yǎng)溫度的細菌中，熱穩(wěn)定性差的蛋白 處于非折疊態(tài)，以二硫鍵等結(jié)合在一起 蛋白折疊中間體的聚集作用蛋白折疊中間體的聚集作用 由于折疊中間體的難溶而聚在一起 外源基因的表達包涵體表達的優(yōu)缺點包涵體表達的優(yōu)缺點包涵體表達的優(yōu)點：包涵體表達的優(yōu)點：簡化外源表達蛋

10、白的分離保持表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定包涵體表達的缺點：包涵體表達的缺點：表達的外源蛋白喪失了原有生物活性，必須經(jīng)過有效的變性、復性操作，才能得到具有正確空間構(gòu)想的活性蛋白體外源基因的表達融合蛋白融合蛋白外源蛋白基因與受體菌蛋白基因重組，不改變兩外源蛋白基因與受體菌蛋白基因重組，不改變兩個基因的閱讀框，表達的蛋白為個基因的閱讀框，表達的蛋白為融合蛋白融合蛋白GeneProteinA BA BNC外源基因的表達融合蛋白的優(yōu)點：融合蛋白的優(yōu)點：在自身蛋白引導下，形成良好的雜合構(gòu)象，可很大程度封閉蛋白水解酶切割位點某些情況下，具有水溶性和一定生物活性易于分離純化外源基因的表達寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白低拷貝

11、質(zhì)粒，多基因串聯(lián)排列。目的蛋白高表達，非目的蛋白低表達。多個轉(zhuǎn)錄元排列多個轉(zhuǎn)錄元排列 大分子量蛋白同于轉(zhuǎn)錄元，多編碼框排列同于轉(zhuǎn)錄元，多編碼框排列 中等分子量蛋白同一編碼框，多肽段排列同一編碼框，多肽段排列 小分子量蛋白外源基因的表達整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白 在信號肽引導下分泌到胞外或周質(zhì)中外源基因的表達5.高效表達外源基因的策略高效表達外源基因的策略 優(yōu)化載體設計 密碼子偏愛性 mRNA穩(wěn)定性 表達蛋白穩(wěn)定性 優(yōu)化發(fā)酵過程外源基因的表達二二.酵母表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)酵母(yeast)是一類芽殖或裂殖進行無性生殖的單細胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔子菌綱和半知菌

12、綱，是外源基因最理想的真核生物基因表達系統(tǒng)。外源基因的表達基因表達調(diào)控機制比較清楚，遺傳操作簡單 1996年完成了釀酒酵母全基因組測序具備蛋白翻譯后的加工和修飾系統(tǒng)可將外源基因表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中安全性好，對人與環(huán)境無害可進行大規(guī)模發(fā)酵，工藝較簡單酵母表達外源基因的優(yōu)勢酵母表達外源基因的優(yōu)勢外源基因的表達載體一般包含的元件DNA復制起始區(qū) 酵母自主復制序列 來源于天然2質(zhì)粒 YEp 來源于酵母自主復制序列(ARS) YRp 選擇標記 營養(yǎng)缺陷型選擇標記 顯性選擇標記有絲分裂穩(wěn)定區(qū)(CEN) YCp酵母表達載體酵母表達載體外源基因的表達表達盒(expression cassette) 啟動子、

13、分泌信號序列、終止子 啟動子上游含有各種調(diào)控元件 如: 上游激活序列(UAS) 上游阻遏序列(URS) 組成型啟動子序列外源基因的表達酵母表達宿主菌酵母表達宿主菌外源基因的表達釀酒酵母 應用與研究最早 乙醇積累影響酵母生長與基因表達 蛋白過度糖基化 分泌能力不強巴斯德畢赤酵母 甲醇營養(yǎng)菌 甲醇可誘導與甲醇代謝相關酶高效表達 利用甲醇誘導的乙醇氧化酶基因AOX1啟動子 高效表達外源基因外源基因的表達三三.哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)外源基因的表達哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)的優(yōu)勢哺乳動物細胞基因表達系統(tǒng)的優(yōu)勢更好的蛋白輔助折疊系統(tǒng)蛋白糖基化、磷酸化、寡聚體、二硫鍵形成等蛋白加工系

14、統(tǒng)可直接表達具有完全生物功能的活性蛋白外源基因的表達哺乳動物表達載體哺乳動物表達載體載體一般包含的元件哺乳動物細胞中進行基因轉(zhuǎn)錄的元件 啟動子、增強子、終止子、poly(A)信號、內(nèi)含子剪切信號基因表達調(diào)控元件細菌中進行復制和篩選的元件篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記外源基因的表達常用篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記常用篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標記外源基因的表達外源基因的表達外源基因的表達哺乳動物常用表達載體哺乳動物常用表達載體外源基因的表達哺乳動物常用受體細胞哺乳動物常用受體細胞外源基因的表達三三.植物基因表達系統(tǒng)植物基因表達系統(tǒng) 一個轉(zhuǎn)基因細胞就可發(fā)育成一株轉(zhuǎn)基因個體 可得到一個轉(zhuǎn)基因的完整生命系統(tǒng) 培養(yǎng)條件簡單、生產(chǎn)成

15、本低外源基因的表達植物表達載體植物表達載體載體大多數(shù)情況以Ti質(zhì)粒為基礎構(gòu)建T-DNA序列 含有植物基因表達的啟動子、終止子等元件含有選擇標記基因與報告基因外源基因的表達植物基因表達受體植物基因表達受體愈傷組織再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)生殖細胞受體系統(tǒng)外源基因的表達第四節(jié)第四節(jié) 基因表達產(chǎn)物的檢測與分離純化基因表達產(chǎn)物的檢測與分離純化一一.基因表達產(chǎn)物的檢測基因表達產(chǎn)物的檢測 (1)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測 Northern blot (2)報告基因酶法檢測 GUS基因等 (3)免疫學檢測 ELISA、Western blot等 (5)酶活性檢測外源基因的表達二二.基因表達產(chǎn)物