《基因芯片技術(shù)》第4章利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析

1、基因芯片技術(shù)Gene chip technology第四章 利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析內(nèi)容提要：第一節(jié)基因芯片應(yīng)用 一、基因芯片的應(yīng)用范 二、CDNA芯片的應(yīng)用范 三、寡核甘酸芯片的應(yīng)用范圍四、單雙色熒光系統(tǒng)第二節(jié) 陣列表達(dá)分析(Expression Analysis Arrays)一、Unique PM-MM Probe Design二、PMMM探針設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)三、單鏈和雙鏈探針第三節(jié)基因芯片實(shí)驗(yàn)流程及方法一、cDNA microarray (TWO CHANNEL MICROARRAY)二、Affymetrix Expression Analysis第四部分?jǐn)?shù)據(jù)分析流程圖第一節(jié)基因芯片應(yīng)

2、用基因芯片主要用于:RNA的檢測(cè)：表達(dá)豐度，剪切體DNA的檢測(cè)：SNP, CGH （比較基因組雜交）Methylation （甲基化作用） cDNA芯片主要用于：表達(dá)譜芯片，CGHRNA寡核甘酸芯片主要用于：診斷芯片，SNP分型芯片DNA- aCGH SNPsAlternate-ChlP/LA -5Upresslpj? Splicing - miRNA ChromosomesDNA Gene promotersnRNA mRNA variants microRNAs雙色熒光系統(tǒng) cDNA芯片技術(shù)及載有較長(zhǎng)片段的寡核昔酸芯片實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兩種組織的mRNA在反轉(zhuǎn)錄成 cDNA的過程中分別標(biāo)記上C

3、y3和Cy5兩種熒光, 競(jìng)爭(zhēng)性地與芯片上的核酸片段進(jìn)行雜交兩種波長(zhǎng)的激光掃描讀取競(jìng)爭(zhēng)雜交的結(jié)果，通過計(jì)算機(jī)處理就能確定芯片上基因所結(jié)合探針的量,通過計(jì)算兩種熒光強(qiáng)度的比值來判斷兩種組織中基因表達(dá)是否有變化。單熒光系統(tǒng)芯片的原理及流程圖混合探針雜交Cy3標(biāo)記的A組織mRNACy5標(biāo)記的B組織mRNA以兩種波長(zhǎng)的激光掃描Cy3-532nmCy5-635nm數(shù)據(jù)分析、尋找差異表達(dá)的基因單色熒光系統(tǒng)較短的寡核昔酸芯片如Affymatrix芯片;載有較長(zhǎng)片段的寡核昔酸芯片也可使用,如川umina （可照明的）芯片實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別用同樣的熒光物質(zhì)標(biāo)記（或生物素biotin）,分別與芯片雜交, 即一張芯片

4、只雜交一個(gè)樣本根據(jù)雜交結(jié)果判斷待測(cè)樣品同芯片上哪個(gè) 片段結(jié)合，通過與對(duì)照組的比較轉(zhuǎn)化成基 因表達(dá)的改變探針A： biotin標(biāo)記探針B： biotin標(biāo)記3QS3兩張芯片上 相同位點(diǎn)信Bins號(hào)比掃描數(shù)據(jù)分析、尋找差異表達(dá)的基因單通道和雙通道的比較單通道實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性更好，使得比較不同樣品之間各種基因表達(dá)的相對(duì)比例是可 靠的。進(jìn)行多個(gè)樣品之間（芯片之間）的 比較時(shí)，只需在多個(gè)樣本中設(shè)置對(duì)照。點(diǎn) 樣的一般是寡核昔酸。雙通道（點(diǎn)樣cDNA）重復(fù)性相對(duì)較差，但是探針可以測(cè)序驗(yàn)證。雙色法需在每次雜交檢測(cè)中設(shè)置對(duì)照，只能進(jìn)行兩個(gè)樣品之 間的比較，多芯片之間的比較并不可靠。第二節(jié)表達(dá)陣列分析Unique

5、PM-MM Probe Design (Affymetrix)5*3Probe PairProbe cell or feature上=ChiPEach gene is represented on the probe array by multiple probe pairsEach probe pair consists of a perfect match and a mismatch oligonucleotideP幽t .豺到翳朝銬只有V期幅PMMM探針設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)靈敏度提高The Value of Mismatcti ProbesConcentration pM將已克隆的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 以不

6、同的濃度摻入到組 織樣品中。經(jīng)過標(biāo)記的 樣品與 Affymetrix Genechip人類基因組 芯片雜交，在克隆轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物濃度低于8PM時(shí)， PM單獨(dú)探針無法探測(cè) 出相應(yīng)的濃度變化，而 與MM探針聯(lián)合使用則 可以探測(cè)出。單鏈和雙鏈探針雙鏈探針：在液相條件下自我復(fù)性 從而大大降低與固著的靶DNA雜交的機(jī)會(huì)，從而降低了探測(cè)靈敏度, 因此需更多的探針量。單鏈探針：使雜交靈敏度提高RXA Eaqpermrvtrf RNA標(biāo)記第三節(jié) 基因芯片實(shí)驗(yàn)流程及方法cDNA microarray(TWO CHANNELMICROARRAY )步驟：1提取mRNA2將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA3 cDNA進(jìn)行標(biāo)記

7、4雜交5將未雜交的cDNA洗掉6激光掃描7結(jié)果分析Affymetrix Expression AnalysismRNAReverse Transcriptase （擬轉(zhuǎn)錄酶）in vitro transcription （體外轉(zhuǎn)錄）Fragmentation of cRNA（cRNA的破裂）GeneChip HybridizationHybridization process of GeneChipLabeling cRNA fragmentHybridizatio n mixturehybridization (16hour)DataanalysisWash & stainScan實(shí)驗(yàn)步驟:

8、1樣本制備:1）提取mRNA （mRNA的純化方法）2）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA （方法）3） cDNA進(jìn)行標(biāo)記（樣本量）2樣本標(biāo)記：1）核昔酸的修飾方法2）標(biāo)記方法：a）擴(kuò)增mRNA （cRNA）靶分子b）合成cDNA二鏈3預(yù)雜交4雜交：1）雜交過程2）原核生物樣品雜交過程5洗滌6染色（如生物素標(biāo)記）7掃描8數(shù)據(jù)分析樣本制備表達(dá)譜基因芯片研究的對(duì)象是樣本中的mRNA, 抽提出的mRNA需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶的作用轉(zhuǎn)變 為cDNA,同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記，標(biāo)記好的cDNA 靶分子就可用于雜交?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)中的RNA抽提大都采用分子生物學(xué)中傳統(tǒng)的方法，但要求必須能夠盡可能多的抽提出組織中的RNA分子，保持

9、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)信息與組織中mRNA拷貝數(shù)信息之間的平行性。mRNA的純化方法兩步法：從樣本中制備總RNA,再?gòu)目俁NA中分離mRNA,總RNA中包括rRNA、tRNA和 mRNA,其中90%以上是rRNA和tRNA,分離mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的3 端都有polyA尾，用poly (dT) 纖維素親和層 析純化mRNA。 一步法：從組織樣本中直接用poly (dT) 纖 維素親和層析純化mRNA,這種方法簡(jiǎn)便，但 RNA的純度不夠，當(dāng)組織量少或?qū)NA質(zhì)量要 求不高時(shí)可采用逆轉(zhuǎn)錄：合成cDNA一鏈 mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)用poly (dT)作引物，可以直接用總RNA作為摸板進(jìn)行

10、逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，簡(jiǎn)化步驟，減少mRNA的損失，從 而減少對(duì)組織的需求，也避免了從總RNA中純化mRNA的工作總RNA的純度不如mRNA高，直接從總RNA 進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄在一定程度上會(huì)影響到 逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的效率，需要盡可能保證總RNA 的純度樣本量從多少總RNA中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄才能滿足實(shí)驗(yàn)需要？非擴(kuò)增：20微克；擴(kuò)增：1微克有些情況下，樣本極為稀有，不可能得到大量的mRNA靶分子基因芯片實(shí)驗(yàn)對(duì)總RNA量的需求在一定程 度上限制了該技術(shù)的推廣發(fā)展方向：提高檢測(cè)靈敏度，減少基因芯 片實(shí)驗(yàn)樣本用量類別，揩官,/組織*.提取3,1 竺niRZA 所 需組織量（克），提取1 Oji 1約 11RNTA 所 需

11、組織量（克X同人正常組級(jí)a月干70.2083.10 6944成人正常組織腦戶魴i,類成,人正常組織Q月巾Q0.3a1 A成人正常組織心、0.54，1.6667成人正常組織.、牌.0.14290.4762/成人正常組織Q肌+，0.7353.2 451A成人正常組織“皮膚-1.55A成人正常組織,聚丸305，1 6667成人正常組織，賁門一0.38461，1.2821川成人正常組織,甲狀腺衣02、0.66G7，類別器官，組織*.提取jjnoiiiRXA / 需組織量（克）提取1 OpiiRJSTA 所 需組織量（克X胎兒。月干一0 1667,，0.5556”胎兒腦,，0.75,2.5胎兒。肺一0.

12、42861.4286胎兒山、0.2-0.6667k胎兒，腔,、0.12.0.6667胎兒，肌.，0.250.8333d胎兒腎A0.3%船兒-軟骨一1.24。胎兒戶腸。0.250.8333a類別一器官/組織工提取31i腎癌。O.4762c1.5873戶病理組織小肝瘙/0.1116/0.3 72病理組織，肺癌C0.128204274c病理組織膽裳煽鐮數(shù)據(jù)廣核昔酸的修飾方法生物素標(biāo)記的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin Fluorescent dye的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè),標(biāo)記探針穩(wěn)定，不失活，并能配用多種檢測(cè)系統(tǒng)，簡(jiǎn)單方便，掃描成本較低。熒光素標(biāo)記的dNT

13、P： Cy3的dNTP , Cy5的dNTP同位素標(biāo)記的dNTP amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，摻入DNA和RNA鏈的效率與未標(biāo)記的NTP相同；檢測(cè)的時(shí)候只需在它的氨基反應(yīng)基團(tuán)上偶聯(lián)Cy系列的染料或其他 染料；但實(shí)驗(yàn)誤差大。熒光標(biāo)記：標(biāo)記分子在特定的波長(zhǎng)范圍被激光光源激 發(fā)出熒光，從而對(duì)含有標(biāo)記分子的樣本進(jìn)行檢測(cè)。如 花青素（Cyanin） Cy3、Cy5,其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為：550/570和649/670。大部分掃描儀都能對(duì)這兩 種熒光標(biāo)記進(jìn)行圖像處理。這種標(biāo)記方法沒有同位 素標(biāo)記的限制；而且具有極高的靈敏度，能夠進(jìn)行定 量檢測(cè)標(biāo)記方法 RNA樣本不擴(kuò)增進(jìn)行標(biāo)記：在

14、反轉(zhuǎn)錄的體系中加入Cy3或Cy5標(biāo)記過的dNTP類似物,通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用，標(biāo)記新合成的CDNA。 這種實(shí)驗(yàn)方法效率較低，對(duì)RNA樣本需求量大，通常要50200Hg總RNA, 13用mRNA RNA樣本擴(kuò)增后進(jìn)行標(biāo)記1在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下, 反轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA一 條鏈。2并在cDNA一鏈的3， 端加上非模板的寡聚 C殘基3加入3,端帶有寡聚G 的引物，可以結(jié)合到 cDNA的3,端，生成一 小段雙鏈的cDNA 4再在DNA聚合酶的 作用下延伸5加入RNase H,水 解淖R(shí)NA模板，以殘 留的與cDNA一鏈配 對(duì)的短片段RNA為引 物，在DNA聚合酶的 作用下生成雙鏈 cDNA擴(kuò)增mRNA (cR

15、NA)靶分子聯(lián)合應(yīng)用cDNA擴(kuò)增和模板指導(dǎo)下的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來完成線性擴(kuò)增。 PCR方法：同一用量和限制循環(huán)次數(shù)的條件下， 通過RT-PCR可平行的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的RNA樣本以滿足實(shí)驗(yàn)要求并同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記O 基于T7的mRNA線性擴(kuò)增：利用模板指導(dǎo)下的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來完成線性擴(kuò)增。該方法能從150ngmRNA分子出發(fā)擴(kuò)增出足夠數(shù)量的cDNA靶分子。這種擴(kuò)增方法更具線性合成cDNA二鏈AAAA 丁總心Ann-n 皿。(虹)-17弓I粉MMLV反轉(zhuǎn)錄TS引物夕 TS 引物 GGGaKAA 3CCCTTTI-T7 0HAI Ms H1 rex%總-門 ds CENAcccmr-T7I體外反轉(zhuǎn)錄于一

16、CCCVUU1T 寧于一HCmianti-sense 取于一cccumm 5UUUU 5rcccTotal RNA1. Primer hybridization5 I I I I I I I I I I I AAAAA 31 3, TTTTT -5,噬菌體T7 DNA編碼 的酶，對(duì)T7啟動(dòng)子序 列具有高度特異性， 不能識(shí)別其它生物來 源的啟動(dòng)子。是依賴于DNA的RNA 聚合酶，具有5，t3， 的RNA聚合酶活性， 以含有T7啟動(dòng)子序列 的雙鏈DNA為模板， 以NTP為底物，合成 與啟動(dòng)子下游的模板 DNA互補(bǔ)的RNA。2. Reverse transcription First strand

17、cDNA synthesis3. Second strand cDNA synthesis5, I I I I I I I I I I I AAAAA 31TTTTT -55, I I I I I I I I I I I AAAAA 3,31口 ndiooonn?？?ttttt - bsDODDOODOOOO aaaaa - 31aHDnDnnonOD O ttttt - 5,4. Cleanup of double-stranded cDNA5. Amplification and biotin labeling of antisense cRNABk)tinlabeled URibonuc

18、leotides *-C f TTTTT3 I I I I I I I i I I I UUUUU 516. Cleanup ofbiotinylated cRNA芯片雜交*將靶分子變性后，用預(yù)雜交液與芯片進(jìn)行預(yù)雜交1小時(shí)左右(cDNA和長(zhǎng)鏈寡核昔酸，42 (50%甲酰胺)；短鏈寡核昔酸，50 )雜交：溫度同預(yù)雜交，標(biāo)記好的樣品與雜交倉(cāng)內(nèi)反應(yīng)1418小時(shí)洗片，掃描檢測(cè)雜交量依賴靶DNA和探針的濃度，當(dāng)靶DNA濃 度一定時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與探針量 成線性關(guān)系RNA相對(duì)不穩(wěn)定影響雜交速率和雜交雙鏈穩(wěn)定性的因素:1 .核酸濃度2 .探針的類型和長(zhǎng)度3 .堿基組成4 .雜交液成分(1)離子強(qiáng)度(2) Formamide(3)(4)季鐵鹽溶液雜交加速劑5 .不匹配序列6 .雜交時(shí)間7 .雜交溫度原核生物樣品1 . RZA ExtreictionRNA3,2. Random priming eONA syct八os -S1，口口 口口口 口 13. RfMA doQrodotion with ZnOIA. oONA c