激光顯微切割

1、激光捕獲顯微切割技術(shù)Laser Micro-Dissection (LMD)Definition of LMDn顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細(xì)胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細(xì)胞從組織三維構(gòu)造中分離出來，獲得純的細(xì)胞群（pure cell population），以備進(jìn)一步作分子水平的研究。顯微切割技術(shù)的貢獻(xiàn)就是克服了組織的細(xì)胞成分非常繁雜這一重大的缺點(diǎn)。nLaser capture microdissectionThe History of LMDn1965 ，Baxter TJ，腎小管n1990s ，紫外激光切割超薄膜上的組織n1996，NIH，紅外激光光源，轉(zhuǎn)運(yùn)膜技術(shù)n

2、美國Arcturus 公司：熱塑膜n德國PALM 公司：激光脈沖所產(chǎn)生的壓力Advance of LMDn無破壞性，用于粘附目的細(xì)胞的熱塑膜厚度約為100200 m, 能夠吸收激光產(chǎn)生的絕大部分能量，n高精確性，激光定位的準(zhǔn)確程度可以達(dá)到1 m， 切割直徑可以小到2 m，捕獲點(diǎn)范圍達(dá)到35 m，n高效率，每次激發(fā)耗時(shí)不超過1秒, ,單張轉(zhuǎn)運(yùn)膜可以一次捕獲上萬個(gè)細(xì)胞；n自動化程度高，全電腦操作n無污染，使用全封閉操作，能避免外來物質(zhì)的污染。Weakness of LMDn用儀器和耗材昂貴；QIAGENn染色時(shí)對后續(xù)反應(yīng)可能有影響；n對涂片的要求比較苛刻等。Use Of LMDnCancern腫瘤

3、基因突變檢測n腫瘤特異基因表達(dá)分析n雜和性丟失檢測n微衛(wèi)星序列不穩(wěn)定性分析n新基因發(fā)現(xiàn)n核酸及蛋白質(zhì)的定量研究n染色體畸變分析n細(xì)胞局部病變病因?qū)WnPathology and Forensic n組織切片n冰凍切片檢驗(yàn)。n法醫(yī)學(xué)中的各種細(xì)胞涂片,目前常見的法醫(yī)物證檢材如液體類(精液、血液、唾液、精陰混和液)、斑跡類(精斑,血斑,唾液斑,混和斑等)等Note the use of LCM nDNAn分析基因組DNA 時(shí), 細(xì)胞越大, 則需要切割更多的細(xì)胞, 才能保證包含細(xì)胞的全部基因組n保持基因組的相對完整性, 避免在樣品處理過程中造成DNA 的降解和斷裂nRNAn建議樣本使用冰凍組織塊, 同時(shí)

4、用Trizol 法抽提原始組織樣本RNA,鑒定樣本降解情況,確保樣本質(zhì)量。n常規(guī)HE 染色,伊紅和蘇木精配好后用DEPCnProteinn可以根據(jù)需要制備總蛋白, 或膜蛋白, 或核蛋白等, 也可以富集糖蛋白n通過去除白蛋白來減少蛋白質(zhì)類型的復(fù)雜程度。Introduction of Leica LMD6000n紫外激光 UV Laser n熱塑膜：保證生物大分子不受損害n自動辨別樣品Work fashion of Leica LMD6000n重力掉落方式, 掉落到指定的 PCR ( RT-PCR ) 蓋子上 n組織：石蠟切片/冰凍切片/活細(xì)胞nLMD 專用 SmartCut UVI-鏡頭: 6.

5、3x, 10 x, 20 x, 40 x, 63x, 100 x. 150 xSpecimen placement of LMD6000n載片臺上有三個(gè)平行載片夾n切割時(shí)視野只在單一玻片內(nèi)Collection tubenA/B/C/D四個(gè)收集孔，管蓋固定在收集孔上Focus Moden電動控制焦距調(diào)節(jié)n步幅小n穩(wěn)定Special Glass slide n含熱塑膜n特制玻片，成本約40元/片Cutting of paraffin sectionn石蠟包埋nHE染色Multiple cutting of brain sectionn連續(xù)切割n容易出現(xiàn)切割不下來，需要手動輔助Living cell

6、 cutting of LMD6000n熒光顯微鏡下切割活細(xì)胞Annotation:How to prepare frozen sectionn1. 取取 材：取新鮮的組織。材：取新鮮的組織。n2. 固固 定：組織固定于定：組織固定于10%中性福爾馬林中性福爾馬林,冰凍切片。冰凍切片。n3. 切切 片：片：n利用切片機(jī)的厚度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié)切片厚度，調(diào)整切片角度，利用切片機(jī)的厚度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)節(jié)切片厚度，調(diào)整切片角度，安裝切片刀。安裝切片刀。n將樣品放到樣品托上，利用包埋劑固定，放到冷臺上冷凍，將樣品放到樣品托上，利用包埋劑固定，放到冷臺上冷凍，在即將完成冷透前用熱交換裝置壓平。在即將完成冷透前用熱交換裝置壓平。n將樣品放到樣品頭上，用樣品快進(jìn)按鈕將樣品移近刀口，將樣品放到樣品頭上，用樣品快進(jìn)按鈕將樣品移近刀口，利