免疫組化技術(shù)PPT課件

1、四大常用基本技術(shù)四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）免疫組織化學技術(shù)（免疫組化）免疫印跡技術(shù)（Western blot）細胞培養(yǎng)技術(shù)局限性 聯(lián)合應(yīng)用第1頁/共99頁免疫組織化學技術(shù)免疫組織化學技術(shù)免疫組化 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。抗原（antigen）：蛋白質(zhì)具有抗原性。抗體（antibody） ：能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白Immunoglobin（Ig）。 第2頁/共99頁免疫組化技術(shù)的分類 按標記

2、物質(zhì)的種類 如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。按染色步驟 可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。第3頁/共99頁基本原理基本原理抗原一抗+ +二抗標記的抗原抗體復合物一抗第4頁/共99頁 免疫組化的全過程免疫組化的全過程抗原的提取 與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體及純化標記物與抗體集合形成標記抗體 標本的 處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)顯微鏡下 觀察結(jié)果第5頁/共99頁常用標本的獲得常用標本的獲得 組織標本和細胞標本兩大類 石

3、蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片 細胞爬片和細胞涂片第6頁/共99頁免疫組化對組織和細胞標本的要求 ：保持所檢標本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)； 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。 各種抗原由于其含量及特性的差異對標本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實驗的最佳方法。 標本的處理標本的處理第7頁/共99頁 標本的獲得標本的獲得 標本新鮮：一般在2h以內(nèi)進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴重彌散。 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。 避

4、開壞死區(qū)：細胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。 第8頁/共99頁標本的固定與保存標本的固定與保存目的：使組織和細胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)； 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免在染色和反復清洗的過程中抗原失活或彌散。好的固定劑：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質(zhì)擴散（3）固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反應(yīng)第9頁/共99頁常用固定劑常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 醇類（常用乙醇）

5、 其它 （丙酮） 第10頁/共99頁常用固定劑甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。 優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，組織收縮少。 缺點： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。 第11頁/共99頁常用固定劑組織塊不宜過厚。縮短固定時間。降低固定溫度。 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10甲醛固定液，減少固定液pH的變化。 固

6、定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。 切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復)。第12頁/共99頁常用固定劑多聚甲醛(常用4%)： 用于免疫熒光染色。 主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。 第13頁/共99頁戊二醛： 穿透性強，微細結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。常用固定劑第14頁/共99頁常用固定劑乙醇（最常用）原理：使細胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。 缺點： 脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。 乙

7、醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。第15頁/共99頁常用固定劑丙酮： 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用于組織標本。第16頁/共99頁 冰凍切片和石蠟切片是免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡單較好的保存組織的抗原免疫活性，避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮組織學切片制作第17頁/共99頁石蠟切片：觀察組織細胞結(jié)構(gòu)的理想方法較好的保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)切片有連續(xù)性長期存檔，供回顧性研究由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以

8、原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好?？乖谋４媪坎蝗绫鶅銮衅?。組織學切片制作第18頁/共99頁抗原修復化學方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶加熱方法 水浴加熱法 微波照射法 高壓加熱法 第19頁/共99頁抗原修復化學方法 :主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 胰蛋白酶：主要用于細胞內(nèi)抗原的顯示；-：一般使用濃度為0.050.1，消化時間為37 度1040min， 胃蛋白酶：主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示。一般使用濃度為0.1%0.4，消化時間為37 度30180min， 例如：Laminin、CollagenIV 第20頁

9、/共99頁抗原修復水浴加熱法 ：將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。 優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟，適用于所有的實驗室， 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。 第21頁/共99頁抗原修復微波照射法 ：將玻片放入裝有抗原修復液的容器中，置微波爐加熱至95以上，持續(xù)l015分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進行。 優(yōu)點：此方法由于微波場內(nèi)極性分子、離子高速運動，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復正常，且因分子運動產(chǎn)熱、效率高、時間短，對抗原再現(xiàn)效果好。 第22頁/共99頁抗原修復 高壓加熱法暴露抗原 ：將玻片浸入抗原修復液內(nèi)，置高壓鍋中高壓 23min，可取得極好的效果。

10、優(yōu)點：由于高壓下受熱均勻，特別適用于大批量標本的染色。 應(yīng)用于一些較難修復的抗原。 Mart-1抗原修復前 抗原修復后第23頁/共99頁抗原修復加熱法的注意事項 ：達到規(guī)定的溫度(9295 C以上) 維持一定的時間； 避免切片干涸 (抗原可能完全丟失)； 加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻2030分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復天然構(gòu)型； 修復液：最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液； 第24頁/共99頁 抗體的結(jié)構(gòu)：每個抗體都含有兩個較小的 蛋白質(zhì) （輕鏈）和兩個較大的蛋白質(zhì)（重鏈）。組成 抗體 的這四個蛋白質(zhì)通過二硫鍵（ S-S ）結(jié)合在一起。 Fab（fragment anti

11、gen binding）：該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位 Fc（fragment crystalline）：是免疫球蛋白的羧基端，因其純化時呈結(jié)晶狀態(tài)而得名，該片斷與特異性的識別抗原有關(guān)。TissueAgAgFabFc抗體第25頁/共99頁抗體的分類多克隆抗體：多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國外產(chǎn)品目錄上常以RaH（rabbit against human）表示。單克隆抗體：單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備。小鼠抗人的抗體常以MaH（m

12、ouse against human）表示。第26頁/共99頁抗體的選擇（一抗）單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單一淋巴細胞產(chǎn)生的抗體。多克隆抗體：多株B細胞針對多個抗原決定簇產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體的特異性更強，多克隆抗體的敏感性更高。如何使用二者完全取決于使用者的目的。弄清一抗的動物來源對后續(xù)二抗的選擇至關(guān)重要。第27頁/共99頁一抗的獲得一抗的獲得 商品化一抗：Millipore、Cell Signaling、 Abcam、Santa Cruz 等。 自己制備或定制 第28頁/共99頁抗體的標記（二抗）在抗體上用化學方法連接某種標記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到。熒光素-異硫氰

13、酸熒光素（FITC）、羅丹明（TRITC）酶-辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）重金屬-膠體金第29頁/共99頁常用的染色方法根據(jù)標記物的不同：免疫熒光法免疫酶標法親和組織化學法以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用（ABC法）?？乖豢苟沟?0頁/共99頁常用的染色方法 免疫熒光法:最早建立的免疫組織化學技術(shù)。 基本原理：它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受

14、激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。 優(yōu)點：由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用較廣。第31頁/共99頁 熒光素熒光素 作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物FluorochromeExcitation (nm) Emission (nm)ColorDAPI365420BlueFluorescein495525GreenHoechts 33258360470BlueR-phycocyanin555, 618634RedB-phycoerythrin5

15、45, 565575Orange, redR-phycoerythrin480, 545, 565578Orange, redRhodamine552570RedTexas red596620Red第32頁/共99頁熒光顯微鏡熒光顯微鏡 短波長的激發(fā)光激發(fā)出長波長的熒光。短波長的激發(fā)光激發(fā)出長波長的熒光。 紫外線紫外線 藍光藍光 藍光藍光 綠光綠光 綠光綠光 紅光紅光第33頁/共99頁免疫熒光染色免疫熒光染色第34頁/共99頁免疫熒光雙標染色免疫熒光雙標染色第35頁/共99頁熒光顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡 熒光顯微鏡：X光片效果 激光共聚焦顯微鏡：CT效果 用于目的蛋

16、白的精確細胞內(nèi)定位分析第36頁/共99頁常用的染色方法 免疫酶標方法：繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)。 基本原理：先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。 優(yōu)點：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。 目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等。第37頁/共99頁常用的標記酶及其顯色底物 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)： DAB或AEC顯色系統(tǒng) （結(jié)果染為棕黃色）堿性磷酸酶

17、(alkaline phosphatase, AP)： NBT/BCIP（結(jié)果染為藍黑色） 第38頁/共99頁DAB顯色 辣根過氧化物酶（HRP）+DAB溶液=棕黃色產(chǎn)物第39頁/共99頁 ABC法（avidin-biotin complex親和素-生物素法）： 組成： 一抗、生物素化的二抗、ABC復合物（親和素+酶標生物素） 生物素(biotin)又稱維生素H，是一種小分子維生素，分子量為244，是轉(zhuǎn)氨甲?；^程中的輔酶。 抗生物素(avidin)，又稱卵白素或親和素，是一種分子量為67000的堿性蛋白，對生物素具有很強的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬倍。它由4個亞基組成，每個

18、亞基都有生物素的結(jié)合位點。 兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種示蹤物所標記，形成生物素-抗生物素系統(tǒng)。 ABC復合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將其與過量的抗生物素反應(yīng)而制備的。第40頁/共99頁 優(yōu)點： 親和素-生物素復合物是一個三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體連接一抗，一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高生物反應(yīng)的敏感性和特異性。生物素和親和素有很強的親和力，比抗原-抗體的親和力要高一萬倍以上。第41頁/共99頁免疫膠體金技術(shù)：以特殊的金屬顆粒膠體金作為標記物。 基本原理：膠體金是金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋

19、白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。 優(yōu)點：由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。常用的染色方法第42頁/共99頁背景染色背景染色 免疫組化中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性染色。 常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處，壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性，均勻性的背景染色。也可以是隨機分布的陽性反應(yīng)產(chǎn)物點、團或塊狀。第43頁/共99頁 Cub ilin

20、分布于近端小管的刷狀緣和近官腔面, 而在遠端小管和細段及集合管上無分布。 遠端小管有背景, 淡棕黃色( 圖1、2)。 組織上無背景, 遠端小管胞質(zhì)為淡藍色（圖3、4）第44頁/共99頁 Ig與Fc受體結(jié)合 ：多見于冰凍切片（特別是淋巴造血組織，淋巴細胞，單核細胞，組織細胞表面多），主要是和二抗反應(yīng)，因為一抗一般稀釋度均較大，因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體，所以石蠟切片不多見。 二抗與組織中的Ig結(jié)合：如羊抗兔的二抗，二抗可以標本中（人）Ig發(fā)生交叉反應(yīng)，科學上越接近的動物，交叉反應(yīng)越明顯，如人與猴，兔與豚鼠。背景染色的原因背景染色的原因第45頁/共99頁

21、靜電吸附 抗體是一種帶負電荷的球蛋白，容易和帶正電荷的組織相結(jié)合，如膠原纖維。 組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合 內(nèi)源性過氧化物酶背景染色的原因內(nèi)源性HRP:3% H2O2 /甲醇室溫20分鐘內(nèi)源性ALP:左旋米唑第46頁/共99頁 縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 非特異性組分與抗體結(jié)合，延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。必要時也可采用2-5%的BSA封閉，減少非特異性染色。 適當增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要阻斷背景染色第47頁/共99頁 內(nèi)源性過氧化物酶和生

22、物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色； 縮短DAB孵育時間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等； 防止標本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。阻斷背景染色第48頁/共99頁設(shè)立對照組設(shè)立對照組對照的設(shè)置： 免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對照，判斷染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測抗體的質(zhì)量標準，沒有對照的免疫組化結(jié)果是毫無意義的。 陽性對照：應(yīng)呈陽性結(jié)果，說明本次實驗操作無問題。 陰性對照：常用PBS代替一抗，實驗結(jié)果為陰性，用以排除假陽性結(jié)果。第49頁/共99頁空白對照/陰性對照：第一抗體由PBS取代。 替代對照：與第

23、一抗體同種動物的非免疫性的正常血清代替第一抗體結(jié)果為 陰性。如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對照中用非 免疫性的正常IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進行對照 。 陽性對照：用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。 自身對照：在同一切片上，將不同組織成分中的陽性或陰性結(jié)果與檢測的目的物對照比較。如果應(yīng)為陽性的組織是陽性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。 設(shè)立對照組設(shè)立對照組第50頁/共99頁第51頁/共99頁免疫組化結(jié)果分析 陽性著色細胞計數(shù)法：在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組36張不同動物組織切

24、片，然后進行組間比較即可。第52頁/共99頁第53頁/共99頁灰密度分析法：通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用Image pro plus進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。注意： 所有的照片必須以同樣的顯微鏡環(huán)境與拍攝條件來拍攝。在更換視野或切片時，除了對焦距這個操作外，其他所有的操作都不能有變化。強陽性的樣品就是暗的黃的，弱陽性的樣品則亮一些，陰性樣品就是一片白。免疫組化結(jié)果分析第54頁/共99頁 曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應(yīng)該在附近。過低過高都不好。 注意相機白平衡：如果使用的是專業(yè)CCD相機，會有校正白平衡的功能，此時應(yīng)對空視野進行

25、白平衡校正。 很多顯微鏡都是同時有熒光附件的，在拍攝熒光照片時要加上濾光片，注意有時候這些濾光片會忘了移開，結(jié)果拍攝的照片就會嚴重偏色。第55頁/共99頁評分法：通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最終可以分數(shù)相加，再進行比較。免疫組化結(jié)果分析第56頁/共99頁相對定量分析相對定量分析 相同曝光時間、相同顯色時間 大體分為陰性、弱陽性、陽性BDCAEFGHNormal第57頁/共99頁原因 解決辦法抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵

26、育時間：室溫1小時或4過夜 孵育溫度過高，孵育溫度超過37一般室溫20-28 DAB顯色時間過長或DAB濃度過高顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準染色過強免疫組化常見問題第58頁/共99頁 染色弱原因解決辦法抗體濃度過低，孵育時間過短提高抗體濃度，孵育時間不能少于60分鐘試劑超過有效使用期及時更換試劑操作中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）室溫太低，低于15若室溫低于15度，要改放在37孵育箱孵育30-60分鐘（或4冰箱過夜）蛋白封閉過度封閉時間不要超過10分鐘免疫組化常見問題第59頁/共99頁免疫組化常見問題 染色陰性原

27、因解決辦法 操作步驟錯誤重新試驗，設(shè)立陽性對照 組織中無抗原 設(shè)立陽性對照片，以驗證實驗結(jié)果 一抗與二抗種屬連接錯誤仔細確定一抗與二抗種屬無誤 第60頁/共99頁 非特異性背景染色原因解決辦法操作過程中沖洗不充分每步?jīng)_洗35 組織中含過氧化物酶未阻斷可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時間延長 組織中含內(nèi)源性生物素 正常非免疫動物血清再封閉 血清蛋白封閉不充分延長血清蛋白封閉時間 免疫組化常見問題第61頁/共99頁 特異性強。免疫學的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性 敏感性高 定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合。免疫組化特點第62頁/共99頁免疫組化應(yīng)用免疫組化應(yīng)用 用途: 對目的蛋白進行

28、定性、定位和定量分析。 優(yōu)點：能夠明確目的蛋白的細胞定位、亞細胞定 位及多種蛋白之間的相互位置關(guān)系 局限性：敏感性差，蛋白定量效果差。 第63頁/共99頁 1975 年，Southern 建立了將DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC 膜）上，并利用DNARNA 雜交檢測特定的DNA 片段的方法，稱為Southern 印跡法。 人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。免疫印跡技術(shù)（Western blot）第64頁/共99頁免疫印

29、跡技術(shù)（免疫印跡技術(shù)（Western blot） 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryamide gel electrophoresis，簡稱PAGE）分離樣品中不同的蛋白質(zhì)組分，利用電轉(zhuǎn)移法將電泳分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后用免疫學原理來檢測目的蛋白質(zhì)。第65頁/共99頁工作流程工作流程制備蛋白樣品SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜：NC,PVDF免疫學檢測l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色/發(fā)光第66頁/共99頁蛋白樣品的獲得 來源：組織、細胞 注意事項：避免蛋白降解 a. 新鮮組織 b. 低溫下操作 c. 蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑（cocktail) d. -70保存，盡量短

30、期內(nèi)使用第67頁/共99頁蛋白樣品處理 測定樣品濃度 蛋白變性：電泳樣品要經(jīng)過高溫處理，其目的將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。 加入溴酚藍染料，溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當指示劑到達凝膠底部時，即可停止電泳。第68頁/共99頁SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。 PAGE電泳體系中加入SDS-SDS-PAGE第69頁/共99頁 丙烯酰胺(簡稱Acr

31、） N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis） TEMED 過硫酸胺（AP） SDS Tris-甘氨酸電泳緩沖液SDS-PAGE第70頁/共99頁 Acr和Bis單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，但在自由基存在時就會發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有化學和光聚合兩種方法。 1）化學聚合 常用的催化劑系統(tǒng)有： （1）過硫酸胺（AP）TEMED(四甲基乙二胺)； （2）過硫酸胺DMPN(二甲基氨基丙腈)； （3）過硫酸胺三乙醇胺。 2）光聚合 由光敏物質(zhì)核黃素代替過硫酸銨作催化劑。 第71頁/共99頁 SDS 陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)上，使各種蛋白質(zhì)-SDS復

32、合物都帶有相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小。 因此可以利用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。第72頁/共99頁SDS-PAGESDS-PAGE電泳體系電泳體系 電泳體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成。 濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為 pH6.8的Tris-HCl。 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為 pH8.8 Tris-HCl。 電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。 第73頁/共99頁不連續(xù)電泳：不連續(xù)電泳： 作用作用緩沖液緩沖液P

33、HPH凝膠濃度凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值形成了凝 膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性 樣品濃縮的主要因素。 第74頁/共99頁 濃縮膠：大孔膠 在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl-，但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。 效泳動率依次為Cl-蛋白質(zhì)H2NCH2COO- 由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成條狹窄帶。 這種濃縮效應(yīng)可使蛋

34、白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。第75頁/共99頁 分離膠：小孔膠 由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會根據(jù)其各自分子量的大小而被分離第76頁/共99頁凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212第77頁/共99頁Staking gelSeparating gel第78頁/共99頁 濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。轉(zhuǎn)膜第79頁/共99頁半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因為電極板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法又快（15-45 分鐘）又好。第80頁/共99頁 兩種轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中都必須注意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡 小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大分子量（100KD以上）建議濕轉(zhuǎn)。 根據(jù)目的蛋白的分子量決定轉(zhuǎn)膜時間。 半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，濾紙和膜切成與凝膠相同大小很重要，這樣電流必須通過凝膠。否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導致電流短路。注意第81頁/共99頁膜 選擇種類NCPVDF尼龍膜 選擇標準a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能