免疫組化技術(shù)PPT課件

1、四大常用基本技術(shù)四大常用基本技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫組化）免疫印跡技術(shù)（Western blot）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)局限性 聯(lián)合應(yīng)用第1頁(yè)/共99頁(yè)免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組化 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。抗原（antigen）：蛋白質(zhì)具有抗原性?？贵w（antibody） ：能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白Immunoglobin（Ig）。 第2頁(yè)/共99頁(yè)免疫組化技術(shù)的分類 按標(biāo)記

2、物質(zhì)的種類 如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。按染色步驟 可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。第3頁(yè)/共99頁(yè)基本原理基本原理抗原一抗+ +二抗標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物一抗第4頁(yè)/共99頁(yè) 免疫組化的全過程免疫組化的全過程抗原的提取 與純化免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體及純化標(biāo)記物與抗體集合形成標(biāo)記抗體 標(biāo)本的 處理抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng)顯微鏡下 觀察結(jié)果第5頁(yè)/共99頁(yè)常用標(biāo)本的獲得常用標(biāo)本的獲得 組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類 石

3、蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片 細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片第6頁(yè)/共99頁(yè)免疫組化對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求 ：保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)； 在原位最大程度地保持待測(cè)抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。 各種抗原由于其含量及特性的差異對(duì)標(biāo)本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實(shí)驗(yàn)的最佳方法。 標(biāo)本的處理標(biāo)本的處理第7頁(yè)/共99頁(yè) 標(biāo)本的獲得標(biāo)本的獲得 標(biāo)本新鮮：一般在2h以內(nèi)進(jìn)行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散。 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時(shí)應(yīng)有抗原陽(yáng)性和陰性區(qū)，以形成自身對(duì)照。 避

4、開壞死區(qū)：細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時(shí)應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。 第8頁(yè)/共99頁(yè)標(biāo)本的固定與保存標(biāo)本的固定與保存目的：使組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)； 對(duì)免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免在染色和反復(fù)清洗的過程中抗原失活或彌散。好的固定劑：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散（3）固定后的抗原能被抗體識(shí)別，不影響抗原抗體反應(yīng)第9頁(yè)/共99頁(yè)常用固定劑常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 醇類（常用乙醇）

5、 其它 （丙酮） 第10頁(yè)/共99頁(yè)常用固定劑甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，組織收縮少。 缺點(diǎn)： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。 第11頁(yè)/共99頁(yè)常用固定劑組織塊不宜過厚。縮短固定時(shí)間。降低固定溫度。 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10甲醛固定液，減少固定液pH的變化。 固

6、定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。 切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復(fù))。第12頁(yè)/共99頁(yè)常用固定劑多聚甲醛(常用4%)： 用于免疫熒光染色。 主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。 第13頁(yè)/共99頁(yè)戊二醛： 穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對(duì)抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。常用固定劑第14頁(yè)/共99頁(yè)常用固定劑乙醇（最常用）原理：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存好。 缺點(diǎn)： 脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時(shí)間不宜過長(zhǎng)(2h內(nèi))。 乙

7、醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時(shí)間長(zhǎng)，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。第15頁(yè)/共99頁(yè)常用固定劑丙酮： 對(duì)抗原性的保存好，但脫水性更強(qiáng)，較少 用于組織標(biāo)本。第16頁(yè)/共99頁(yè) 冰凍切片和石蠟切片是免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡(jiǎn)單較好的保存組織的抗原免疫活性，避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮組織學(xué)切片制作第17頁(yè)/共99頁(yè)石蠟切片：觀察組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的理想方法較好的保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)切片有連續(xù)性長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以

8、原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好?？乖谋４媪坎蝗绫鶅銮衅?。組織學(xué)切片制作第18頁(yè)/共99頁(yè)抗原修復(fù)化學(xué)方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶加熱方法 水浴加熱法 微波照射法 高壓加熱法 第19頁(yè)/共99頁(yè)抗原修復(fù)化學(xué)方法 :主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 胰蛋白酶：主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示；-：一般使用濃度為0.050.1，消化時(shí)間為37 度1040min， 胃蛋白酶：主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。一般使用濃度為0.1%0.4，消化時(shí)間為37 度30180min， 例如：Laminin、CollagenIV 第20頁(yè)

9、/共99頁(yè)抗原修復(fù)水浴加熱法 ：將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實(shí)驗(yàn)室， 缺點(diǎn)：對(duì)封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。 第21頁(yè)/共99頁(yè)抗原修復(fù)微波照射法 ：將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95以上，持續(xù)l015分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行。 優(yōu)點(diǎn)：此方法由于微波場(chǎng)內(nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動(dòng)，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，且因分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)熱、效率高、時(shí)間短，對(duì)抗原再現(xiàn)效果好。 第22頁(yè)/共99頁(yè)抗原修復(fù) 高壓加熱法暴露抗原 ：將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓 23min，可取得極好的效果。

10、優(yōu)點(diǎn)：由于高壓下受熱均勻，特別適用于大批量標(biāo)本的染色。 應(yīng)用于一些較難修復(fù)的抗原。 Mart-1抗原修復(fù)前 抗原修復(fù)后第23頁(yè)/共99頁(yè)抗原修復(fù)加熱法的注意事項(xiàng) ：達(dá)到規(guī)定的溫度(9295 C以上) 維持一定的時(shí)間； 避免切片干涸 (抗原可能完全丟失)； 加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻2030分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型； 修復(fù)液：最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液； 第24頁(yè)/共99頁(yè) 抗體的結(jié)構(gòu)：每個(gè)抗體都含有兩個(gè)較小的 蛋白質(zhì) （輕鏈）和兩個(gè)較大的蛋白質(zhì)（重鏈）。組成 抗體 的這四個(gè)蛋白質(zhì)通過二硫鍵（ S-S ）結(jié)合在一起。 Fab（fragment anti

11、gen binding）：該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位 Fc（fragment crystalline）：是免疫球蛋白的羧基端，因其純化時(shí)呈結(jié)晶狀態(tài)而得名，該片斷與特異性的識(shí)別抗原有關(guān)。TissueAgAgFabFc抗體第25頁(yè)/共99頁(yè)抗體的分類多克隆抗體：多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國(guó)外產(chǎn)品目錄上常以RaH（rabbit against human）表示。單克隆抗體：?jiǎn)慰寺】贵w是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。小鼠抗人的抗體常以MaH（m

12、ouse against human）表示。第26頁(yè)/共99頁(yè)抗體的選擇（一抗）單克隆抗體：針對(duì)某一抗原決定簇，由單一淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對(duì)多個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體的特異性更強(qiáng)，多克隆抗體的敏感性更高。如何使用二者完全取決于使用者的目的。弄清一抗的動(dòng)物來(lái)源對(duì)后續(xù)二抗的選擇至關(guān)重要。第27頁(yè)/共99頁(yè)一抗的獲得一抗的獲得 商品化一抗：Millipore、Cell Signaling、 Abcam、Santa Cruz 等。 自己制備或定制 第28頁(yè)/共99頁(yè)抗體的標(biāo)記（二抗）在抗體上用化學(xué)方法連接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到。熒光素-異硫氰

13、酸熒光素（FITC）、羅丹明（TRITC）酶-辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（ALP）重金屬-膠體金第29頁(yè)/共99頁(yè)常用的染色方法根據(jù)標(biāo)記物的不同：免疫熒光法免疫酶標(biāo)法親和組織化學(xué)法以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用（ABC法）?？乖豢苟沟?0頁(yè)/共99頁(yè)常用的染色方法 免疫熒光法:最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。 基本原理：它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受

14、激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。 優(yōu)點(diǎn)：由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。第31頁(yè)/共99頁(yè) 熒光素?zé)晒馑?作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物FluorochromeExcitation (nm) Emission (nm)ColorDAPI365420BlueFluorescein495525GreenHoechts 33258360470BlueR-phycocyanin555, 618634RedB-phycoerythrin5

15、45, 565575Orange, redR-phycoerythrin480, 545, 565578Orange, redRhodamine552570RedTexas red596620Red第32頁(yè)/共99頁(yè)熒光顯微鏡熒光顯微鏡 短波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)出長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光。短波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)出長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光。 紫外線紫外線 藍(lán)光藍(lán)光 藍(lán)光藍(lán)光 綠光綠光 綠光綠光 紅光紅光第33頁(yè)/共99頁(yè)免疫熒光染色免疫熒光染色第34頁(yè)/共99頁(yè)免疫熒光雙標(biāo)染色免疫熒光雙標(biāo)染色第35頁(yè)/共99頁(yè)熒光顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡 熒光顯微鏡：X光片效果 激光共聚焦顯微鏡：CT效果 用于目的蛋

16、白的精確細(xì)胞內(nèi)定位分析第36頁(yè)/共99頁(yè)常用的染色方法 免疫酶標(biāo)方法：繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。 基本原理：先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。 優(yōu)點(diǎn)：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存，適合于光、電鏡研究等。 目前在病理診斷中廣為使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)等。第37頁(yè)/共99頁(yè)常用的標(biāo)記酶及其顯色底物 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)： DAB或AEC顯色系統(tǒng) （結(jié)果染為棕黃色）堿性磷酸酶

17、(alkaline phosphatase, AP)： NBT/BCIP（結(jié)果染為藍(lán)黑色） 第38頁(yè)/共99頁(yè)DAB顯色 辣根過氧化物酶（HRP）+DAB溶液=棕黃色產(chǎn)物第39頁(yè)/共99頁(yè) ABC法（avidin-biotin complex親和素-生物素法）： 組成： 一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素） 生物素(biotin)又稱維生素H，是一種小分子維生素，分子量為244，是轉(zhuǎn)氨甲?；^程中的輔酶。 抗生物素(avidin)，又稱卵白素或親和素，是一種分子量為67000的堿性蛋白，對(duì)生物素具有很強(qiáng)的親和力，比抗原抗體間的親和力要高出100萬(wàn)倍。它由4個(gè)亞基組成，每個(gè)

18、亞基都有生物素的結(jié)合位點(diǎn)。 兩者均可與抗體等大分子生物活性物質(zhì)相偶聯(lián)，又可被酶類等多種示蹤物所標(biāo)記，形成生物素-抗生物素系統(tǒng)。 ABC復(fù)合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將其與過量的抗生物素反應(yīng)而制備的。第40頁(yè)/共99頁(yè) 優(yōu)點(diǎn)： 親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體連接一抗，一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級(jí)放大，從而提高生物反應(yīng)的敏感性和特異性。生物素和親和素有很強(qiáng)的親和力，比抗原-抗體的親和力要高一萬(wàn)倍以上。第41頁(yè)/共99頁(yè)免疫膠體金技術(shù)：以特殊的金屬顆粒膠體金作為標(biāo)記物。 基本原理：膠體金是金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋

19、白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。 優(yōu)點(diǎn)：由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。常用的染色方法第42頁(yè)/共99頁(yè)背景染色背景染色 免疫組化中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱為非特異性染色。 常出現(xiàn)在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處，壞死組織及固定不良的組織中心處。表現(xiàn)為彌漫性，均勻性的背景染色。也可以是隨機(jī)分布的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)、團(tuán)或塊狀。第43頁(yè)/共99頁(yè) Cub ilin

20、分布于近端小管的刷狀緣和近官腔面, 而在遠(yuǎn)端小管和細(xì)段及集合管上無(wú)分布。 遠(yuǎn)端小管有背景, 淡棕黃色( 圖1、2)。 組織上無(wú)背景, 遠(yuǎn)端小管胞質(zhì)為淡藍(lán)色（圖3、4）第44頁(yè)/共99頁(yè) Ig與Fc受體結(jié)合 ：多見于冰凍切片（特別是淋巴造血組織，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，組織細(xì)胞表面多），主要是和二抗反應(yīng)，因?yàn)橐豢挂话阆♂尪染^大，因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體，所以石蠟切片不多見。 二抗與組織中的Ig結(jié)合：如羊抗兔的二抗，二抗可以標(biāo)本中（人）Ig發(fā)生交叉反應(yīng)，科學(xué)上越接近的動(dòng)物，交叉反應(yīng)越明顯，如人與猴，兔與豚鼠。背景染色的原因背景染色的原因第45頁(yè)/共99頁(yè)

21、靜電吸附 抗體是一種帶負(fù)電荷的球蛋白，容易和帶正電荷的組織相結(jié)合，如膠原纖維。 組織中殘存醛基與Ig的結(jié)合 內(nèi)源性過氧化物酶背景染色的原因內(nèi)源性HRP:3% H2O2 /甲醇室溫20分鐘內(nèi)源性ALP:左旋米唑第46頁(yè)/共99頁(yè) 縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 非特異性組分與抗體結(jié)合，延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果。必要時(shí)也可采用2-5%的BSA封閉，減少非特異性染色。 適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要阻斷背景染色第47頁(yè)/共99頁(yè) 內(nèi)源性過氧化物酶和生

22、物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色； 縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等； 防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。阻斷背景染色第48頁(yè)/共99頁(yè)設(shè)立對(duì)照組設(shè)立對(duì)照組對(duì)照的設(shè)置： 免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對(duì)照，判斷染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)，而且也是檢測(cè)抗體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，沒有對(duì)照的免疫組化結(jié)果是毫無(wú)意義的。 陽(yáng)性對(duì)照：應(yīng)呈陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)操作無(wú)問題。 陰性對(duì)照：常用PBS代替一抗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，用以排除假陽(yáng)性結(jié)果。第49頁(yè)/共99頁(yè)空白對(duì)照/陰性對(duì)照：第一抗體由PBS取代。 替代對(duì)照：與第

23、一抗體同種動(dòng)物的非免疫性的正常血清代替第一抗體結(jié)果為 陰性。如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對(duì)照中用非 免疫性的正常IgG血清來(lái)替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對(duì)照 。 陽(yáng)性對(duì)照：用已知含有要檢測(cè)抗原的切片作陽(yáng)性對(duì)照。 自身對(duì)照：在同一切片上，將不同組織成分中的陽(yáng)性或陰性結(jié)果與檢測(cè)的目的物對(duì)照比較。如果應(yīng)為陽(yáng)性的組織是陽(yáng)性，則免疫組化技術(shù)正確，如為陰性，則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量有問題。 設(shè)立對(duì)照組設(shè)立對(duì)照組第50頁(yè)/共99頁(yè)第51頁(yè)/共99頁(yè)免疫組化結(jié)果分析 陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法：在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組36張不同動(dòng)物組織切

24、片，然后進(jìn)行組間比較即可。第52頁(yè)/共99頁(yè)第53頁(yè)/共99頁(yè)灰密度分析法：通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用Image pro plus進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。注意： 所有的照片必須以同樣的顯微鏡環(huán)境與拍攝條件來(lái)拍攝。在更換視野或切片時(shí)，除了對(duì)焦距這個(gè)操作外，其他所有的操作都不能有變化。強(qiáng)陽(yáng)性的樣品就是暗的黃的，弱陽(yáng)性的樣品則亮一些，陰性樣品就是一片白。免疫組化結(jié)果分析第54頁(yè)/共99頁(yè) 曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應(yīng)該在附近。過低過高都不好。 注意相機(jī)白平衡：如果使用的是專業(yè)CCD相機(jī)，會(huì)有校正白平衡的功能，此時(shí)應(yīng)對(duì)空視野進(jìn)行

25、白平衡校正。 很多顯微鏡都是同時(shí)有熒光附件的，在拍攝熒光照片時(shí)要加上濾光片，注意有時(shí)候這些濾光片會(huì)忘了移開，結(jié)果拍攝的照片就會(huì)嚴(yán)重偏色。第55頁(yè)/共99頁(yè)評(píng)分法：通過在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（03分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（14分為025%、2650%、5175%、76100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。免疫組化結(jié)果分析第56頁(yè)/共99頁(yè)相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析 相同曝光時(shí)間、相同顯色時(shí)間 大體分為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性BDCAEFGHNormal第57頁(yè)/共99頁(yè)原因 解決辦法抗體的濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵

26、育時(shí)間：室溫1小時(shí)或4過夜 孵育溫度過高，孵育溫度超過37一般室溫20-28 DAB顯色時(shí)間過長(zhǎng)或DAB濃度過高顯色時(shí)間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)染色過強(qiáng)免疫組化常見問題第58頁(yè)/共99頁(yè) 染色弱原因解決辦法抗體濃度過低，孵育時(shí)間過短提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘試劑超過有效使用期及時(shí)更換試劑操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）室溫太低，低于15若室溫低于15度，要改放在37孵育箱孵育30-60分鐘（或4冰箱過夜）蛋白封閉過度封閉時(shí)間不要超過10分鐘免疫組化常見問題第59頁(yè)/共99頁(yè)免疫組化常見問題 染色陰性原

27、因解決辦法 操作步驟錯(cuò)誤重新試驗(yàn)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照 組織中無(wú)抗原 設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無(wú)誤 第60頁(yè)/共99頁(yè) 非特異性背景染色原因解決辦法操作過程中沖洗不充分每步?jīng)_洗35 組織中含過氧化物酶未阻斷可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時(shí)間延長(zhǎng) 組織中含內(nèi)源性生物素 正常非免疫動(dòng)物血清再封閉 血清蛋白封閉不充分延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間 免疫組化常見問題第61頁(yè)/共99頁(yè) 特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性 敏感性高 定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合。免疫組化特點(diǎn)第62頁(yè)/共99頁(yè)免疫組化應(yīng)用免疫組化應(yīng)用 用途: 對(duì)目的蛋白進(jìn)行

28、定性、定位和定量分析。 優(yōu)點(diǎn)：能夠明確目的蛋白的細(xì)胞定位、亞細(xì)胞定 位及多種蛋白之間的相互位置關(guān)系 局限性：敏感性差，蛋白定量效果差。 第63頁(yè)/共99頁(yè) 1975 年，Southern 建立了將DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC 膜）上，并利用DNARNA 雜交檢測(cè)特定的DNA 片段的方法，稱為Southern 印跡法。 人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。免疫印跡技術(shù)（Western blot）第64頁(yè)/共99頁(yè)免疫印

29、跡技術(shù)（免疫印跡技術(shù)（Western blot） 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE）分離樣品中不同的蛋白質(zhì)組分，利用電轉(zhuǎn)移法將電泳分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，然后用免疫學(xué)原理來(lái)檢測(cè)目的蛋白質(zhì)。第65頁(yè)/共99頁(yè)工作流程工作流程制備蛋白樣品SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜：NC,PVDF免疫學(xué)檢測(cè)l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色/發(fā)光第66頁(yè)/共99頁(yè)蛋白樣品的獲得 來(lái)源：組織、細(xì)胞 注意事項(xiàng)：避免蛋白降解 a. 新鮮組織 b. 低溫下操作 c. 蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制劑（cocktail) d. -70保存，盡量短

30、期內(nèi)使用第67頁(yè)/共99頁(yè)蛋白樣品處理 測(cè)定樣品濃度 蛋白變性：電泳樣品要經(jīng)過高溫處理，其目的將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。 加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí)，即可停止電泳。第68頁(yè)/共99頁(yè)SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。 PAGE電泳體系中加入SDS-SDS-PAGE第69頁(yè)/共99頁(yè) 丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr

31、） N-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis） TEMED 過硫酸胺（AP） SDS Tris-甘氨酸電泳緩沖液SDS-PAGE第70頁(yè)/共99頁(yè) Acr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，但在自由基存在時(shí)就會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)形成凝膠。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有化學(xué)和光聚合兩種方法。 1）化學(xué)聚合 常用的催化劑系統(tǒng)有： （1）過硫酸胺（AP）TEMED(四甲基乙二胺)； （2）過硫酸胺DMPN(二甲基氨基丙腈)； （3）過硫酸胺三乙醇胺。 2）光聚合 由光敏物質(zhì)核黃素代替過硫酸銨作催化劑。 第71頁(yè)/共99頁(yè) SDS 陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)上，使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)

32、合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時(shí)蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小。 因此可以利用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。第72頁(yè)/共99頁(yè)SDS-PAGESDS-PAGE電泳體系電泳體系 電泳體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成。 濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為 pH6.8的Tris-HCl。 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為 pH8.8 Tris-HCl。 電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。 第73頁(yè)/共99頁(yè)不連續(xù)電泳：不連續(xù)電泳： 作用作用緩沖液緩沖液P

33、HPH凝膠濃度凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值形成了凝 膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性 樣品濃縮的主要因素。 第74頁(yè)/共99頁(yè) 濃縮膠：大孔膠 在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl-，但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。 效泳動(dòng)率依次為Cl-蛋白質(zhì)H2NCH2COO- 由于蛋白質(zhì)的有效移動(dòng)率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成條狹窄帶。 這種濃縮效應(yīng)可使蛋

34、白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。第75頁(yè)/共99頁(yè) 分離膠：小孔膠 由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質(zhì)可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質(zhì)則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質(zhì)在電泳過程中就會(huì)根據(jù)其各自分子量的大小而被分離第76頁(yè)/共99頁(yè)凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212第77頁(yè)/共99頁(yè)Staking gelSeparating gel第78頁(yè)/共99頁(yè) 濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。轉(zhuǎn)膜第79頁(yè)/共99頁(yè)半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因?yàn)殡姌O板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場(chǎng)強(qiáng)度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法又快（15-45 分鐘）又好。第80頁(yè)/共99頁(yè) 兩種轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中都必須注意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡 小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大分子量（100KD以上）建議濕轉(zhuǎn)。 根據(jù)目的蛋白的分子量決定轉(zhuǎn)膜時(shí)間。 半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，濾紙和膜切成與凝膠相同大小很重要，這樣電流必須通過凝膠。否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導(dǎo)致電流短路。注意第81頁(yè)/共99頁(yè)膜 選擇種類NCPVDF尼龍膜 選擇標(biāo)準(zhǔn)a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能