畢業(yè)論文盤龍參中黃酮類物質(zhì)的提取及工藝優(yōu)化

1、吉林工商學院畢業(yè)論文 盤龍參中黃酮類物質(zhì)的提取及工藝優(yōu)化 學生姓名 所在系部 食品工程分院 專業(yè)名稱 食品營養(yǎng)與檢測 所在班級 08306班 學生學號 指導教師 二 一一年 五 月盤龍參中黃酮類物質(zhì)的提取及工藝優(yōu)化內(nèi) 容 摘 要 對盤龍參中的黃酮類物質(zhì)進行鑒定，采用單因素試驗找出相對合理的提取工藝。方法 采用索氏提取法去除盤龍參中的色素，再采用乙醇提取法提取盤龍參中的總黃酮，在進濃縮提純，計算其回收率。結(jié)果 黃酮類化合物的提取最佳工藝條件是：乙醇濃度70%、料液比120、提取時間1 h。關鍵詞: 盤龍參；黃酮類化合物；索氏提取法；工藝優(yōu)化 目 錄一 、概述1 1.1 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu).21.

2、2 黃酮類物質(zhì)的生理學功效.21.3.1 溶劑提取法.31.3.2 微波提取法.3 1.3.3 超聲波提取法.41.3.4 酶解法.41.3.5 超臨界流體萃取法.51.3.6 雙水相萃取分離法.51.3.7 半仿生提取法.61.4 黃酮類物質(zhì)的應用.61.5 本實驗的目的和意義.72 實驗材料與方法.72.1實驗試劑.82.2試驗設備.82.3試劑的配制.92.4黃酮類化合物標準曲線的制備.92.5盤龍參中總黃酮的提取.102.6盤龍參中黃酮類物質(zhì)的提純.102.7黃酮類物質(zhì)含量測定.112.8盤龍參中黃酮類物質(zhì)提取的工藝優(yōu)化.112.9盤龍參中黃酮類物質(zhì)的鑒定.12三、參考文獻.13 盤龍

3、參中黃酮類物質(zhì)的提取及工藝優(yōu)化一. 概述盤龍參，別名綬草，陸生植物，高15-50cm。莖直立，基部簇生數(shù)條粗厚、肉質(zhì)的根，近基部生2-4枚葉。葉條狀倒披針形或條形，長10-20cm，寬4-10mm?；ㄐ蝽斏?，長10-20cm，具多數(shù)密生的小花，似穗狀；花白色或淡紅色，螺旋狀排列；花苞片卵形，長漸尖；中萼片條形，先端鈍，長約5mm，寬約1.3mm，側(cè)萼片等長，較狹；花瓣和中萼片等長但較薄，先端極鈍，唇瓣近長圓形，長4-5mm，寬約2.5mm，先端極鈍，伸展，基部至中部邊緣全緣，中部以上呈強烈的皺波狀嚙齒，在中部以上的表面具皺波狀長硬毛，基部稍凹陷，呈淺囊狀，囊內(nèi)具2枚突起。黃酮類化合物廣泛存在于

4、生物體內(nèi)，具有多方面的生理活性，是許多中草藥的有效成分之一, 具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保護心血管、免疫調(diào)節(jié)、保肝等等多種功能,在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有著廣闊的應用前景。對黃酮類化合物的研究也引起了國內(nèi)外學者的廣泛重視。1.1 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu) 黃酮類化合物以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素。其中包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物 ，也即以c6-c3-c6為基本碳架的一系列化合物。 1.2 黃酮類物質(zhì)的生理學功效黃酮類化合物廣泛存在于植物中，實際上存在于植物的所有部分，包括根、心材、樹皮、葉、果實和花中，光合作用中約有2%的碳源被轉(zhuǎn)化成類黃酮。早在3

5、0年代人們就發(fā)現(xiàn)了黃酮類化合物具有維生素c樣的活性，曾一度被視為是維生素p。至今法國與俄羅斯仍繼續(xù)將黃酮類化合物視為維生素p。pratt等人研究了黃酮類化合物的抗氧化性質(zhì)，認為黃酮是作為一級抗氧化劑而起作用的，它們具有顯著的抗氧化性。黃酮抗油脂過氧化的作用早在60年代就已經(jīng)被證實了。80年代以來，對黃酮類化合物質(zhì)的研究逐漸轉(zhuǎn)向其清除自由基的能力、抗衰老，及老年人疾病的治療上。黃酮類化合物的生理功能可概括為：調(diào)節(jié)毛細血管的脆性與滲透性。是一種有效的自由基清除劑，其作用僅次于維生素e。具有金屬螯合的能力，可影響酶與膜的活性。對維生素c有增效作用，似乎有穩(wěn)定人體組織內(nèi)維生素c的作用。具有抑制細菌和抗

6、生素的作用，這種作用使普通食物抵抗傳染病的能力相當高。在兩方面表現(xiàn)有抗癌作用，一方面是對惡性細胞的抑制（即停止或抑制細胞的增長），另一方面是從生化方面保護細胞免受致癌物的損害。1.3 黃酮類物質(zhì)的提取1.3.1 溶劑提取法水提法熱水僅限于提取甙類,例如自槐花米中提取蘆丁。由于熱水浸提時易溶于水的雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、淀粉、多糖類化合物等)較多,后處理較復雜,提取效率也不高,故不常使用。有機溶劑提取法黃酮類化合物的提取,主要是根據(jù)被提取物的性質(zhì)及伴隨的雜質(zhì)來選擇適合的提取溶劑,甙類和極性較大的甙元,一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些極性較大的混合溶劑進行提取。大多的甙元宜用極性較小的溶

7、劑,如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等來提取,多甲氧基黃酮類甙元,甚至可用苯來提取。乙醇和甲醇是最常用的黃酮類化合物提取溶劑,高濃度的醇(如90% 95% )宜于提取甙元,60%左右濃度的乙醇或甲醇水溶液適宜于提取甙類物質(zhì)。如采用70%乙醇提取蘆筍中蘆丁,浸提5h,條件為最優(yōu)。提取過程中常用冷浸法或回流法,提取次數(shù)一般為2-4次。兩種方法各有優(yōu)缺點前者無需加熱,有利于保持提取物的成分,但提取時間長,效率低，后者效率高,但需加熱,因此成分不穩(wěn)定的原料(如一些中藥藥材)不宜用此法。一般來說,醇提法的對總黃酮的提取效果要好于水提法。堿溶酸沉法由于黃酮類成分大多具有酚輕基,具有易溶于堿性水而難溶于酸性水的性質(zhì),

8、可用堿性水(如碳酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣水溶液)或堿性稀醇(如50%乙醇)浸出,在提取液中,加酸酸化,黃酮類化合物即可沉淀析出。用堿性溶劑提取時，所用的堿濃度不宜過高,以免在強堿下加熱時破壞黃酮類化合物母核,當有鄰二酚輕基時,應加硼酸保護。常用飽和石灰水溶液、稀氫氧化鈉溶液或5%碳酸鈉水溶液提取。氫氧化鈉水溶液的浸出能力高,但雜質(zhì)較多不利于純化；石灰水可以使一些鞣質(zhì)或水溶性雜質(zhì)沉淀成鈣鹽沉淀,有利于浸液純化,但是浸出效果不如氫氧化鈉水溶液效果好,同時有些黃酮類化合物能與鈣結(jié)合成不溶性物質(zhì),不被溶出。例如從菊花中提取黃酮類物質(zhì)時,用ph=10 的氫氧化鈉溶液浸出效果較好；從槐米中提取蘆丁,則應用

9、堿性較強的飽和石灰水作溶劑,這樣則有利于蘆丁成鹽溶解；選用硼砂緩沖飽和石灰水的堿性可保護蘆丁的黃酮母核不受破壞,用亞硫酸氫鈉為抗氧劑可保護蘆丁的鄰二酚羥基。堿溶酸沉法在實際生產(chǎn)中應用較廣泛,具有經(jīng)濟安全方便等優(yōu)點。1.3.2 微波提取法微波是一種非電離的電磁輻射, 被輻射物質(zhì)的極性分子在微波電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列,從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦引起發(fā)熱,同時可以保證能量的快速傳遞和充分利用。微波提取技術的研究表明,微波技術應用與天然產(chǎn)物的提取具有選擇性高、操作時間短、溶劑耗量少、有效成分得率高的特點。浸出過程中材料細粉不凝聚、不糊化,克服了熱水提取法易凝聚、易糊化的缺點。1.3.3 超聲波提取法超

10、聲波提取黃酮類物質(zhì),是目前比較新的方法。超聲提取原理是利用超聲波在液體中產(chǎn)生“空穴作用”,破壞植物細胞和細胞膜結(jié)構(gòu),從而增加細胞內(nèi)容物通過細胞膜的穿透能力,有助于黃酮類化合物的釋放與溶出；超聲波使提取液不斷震蕩,有助于溶質(zhì)擴散,同時超聲波的熱效應使水溫基本在57,對原料有水浴作用,縮短了提取時間,提高了有效成分的提出率和原料的利用率。超聲波提取操作簡便快捷、無需加熱、提出率高、速度快、提取物的結(jié)構(gòu)未被破壞、效果好,顯示出明顯的優(yōu)勢。1.3.4 酶解法對于一些黃酮類化合物被細胞壁包圍不易提取的原料,傳統(tǒng)的熱水、堿、有機溶劑提取法,受細胞壁主要成分纖維素的阻礙,往往提取效率較低。恰當?shù)乩妹柑幚磉@

11、些植物材料, 可改變細胞壁的通透性,提高有效成分的提取率。根據(jù)傳質(zhì)理論,溶劑向固體表面擴散,滲透固體表面,進入固體內(nèi)部及固體內(nèi)部微孔隙內(nèi),溶解黃酮類化合物,通過固體微孔隙向固體表面擴散,在表面與溶劑主體間,由于濃度差作用力,黃酮類化合物向溶劑主體擴散,完成提取傳質(zhì)過程。采用酶解法卻能使細胞壁疏松、破裂,減小傳質(zhì)阻力,從而提高提取效率。1.3.5 超臨界流體萃取法超臨界流體萃取( sfe) 它具有傳質(zhì)速度快、溶解能力強、低溫操作、節(jié)能等優(yōu)點, 引起國內(nèi)外有關專家及學者的普遍關注,特別是用該技術提取天然產(chǎn)物有效成分成為人們研究的熱點。超臨界流體有近液體的溶解力,有氣體那樣向固體和高粘度物質(zhì)較強的滲

12、透性。且超臨界流體的密度當溫度或壓力有微小變化時,它能有較大的變化,這樣超臨界流體提取,就是依據(jù)它的這個特性,利用密度的變化對物質(zhì)溶解力的差異,實現(xiàn)分離混合物的。一般多采用co2為超臨界溶劑,co2具有性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、且不燃不爆、臨界壓力不高、操作溫度低、價廉易得等特點。超臨界co2是非極性溶劑,對非極性和分子量很低的極性物質(zhì)表現(xiàn)出很好的溶解性,但對極性較強的物質(zhì)溶解能力不足,雖然增大密度能使其溶解能力提高,但增大密度需提高萃取壓力,這將使萃取設備的費用顯著增加, 不適于大規(guī)模生產(chǎn)。1.3.6 雙水相萃取分離法雙水相體系是由兩種水溶性高分子化合物或一種高分子化合物與一種鹽類在水中所形成的互不相

13、溶的兩相體系,由于被分離物在兩相中分配不同, 便可實現(xiàn)分離。與傳統(tǒng)的油- 水溶劑萃取體系相比,排除了使用有毒、易燃的有機溶劑,能夠提供溫和的水環(huán)境, 避免了被萃成分的脫水變性,目前一般用于生物物質(zhì)如蛋白質(zhì)類的分離研究,在植物黃酮提取方面的研究還比較少。如采用雙水相萃取法對銀杏葉浸出液中黃酮類化合物進行萃取,具有萃取溫度低,時間短,且分相速度快,萃取效率可達98% ,高于溶劑萃取的萃取率。估計在未來,雙水相萃取分離法將為黃酮類化合物的提取分離提供一種新型有效方法。1.3.7 半仿生提取法半仿生提取法是近幾年提出的新方法。它是從生物藥劑學的角度,將整體藥物研究法與分子藥物研究法相結(jié)合,模擬口服藥物

14、經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運吸收的環(huán)境,采用活性指導下的導向分離方法,具有有效成分損失少、成本低、生產(chǎn)周期短的特點。在操作中,根據(jù)仿生學原理,人體胃、小腸、大腸的體液酸度最佳ph 分別為2.10,7.15,8.13,先將原料用一定ph的酸水提取,繼以一定ph的堿水提取,提取液分別過濾、濃縮。1.4 黃酮類物質(zhì)的應用黃酮類化合物中含有消炎、抑制異常的毛細血管通透性增加及阻力下降、擴張冠狀動脈、增加冠脈流量、影響血壓、改變體內(nèi)酶活性、改善微循環(huán)、解痙、抑菌、抗肝炎病毒、抗腫瘤等具有重要生物活性的化合物，有很高的藥用價值。中草藥含黃酮類化合物的很多，已經(jīng)證明類黃酮是許多中草藥的有效成分。例如滿山紅中的杜鵑素、小葉枇

15、杷中的小葉枇杷素、矮地茶中的槲皮苷、鐵包金中的蘆丁、白毛夏枯草和青蘭中的木犀草素、紅管藥中的槲皮素、葛根中的黃豆苷與葛根素、毛冬青與銀杏葉中的黃酮醇苷、黃芩中的抗菌成分黃芩素和解熱有效成分黃芩苷等。此外，還有很多中草藥富含黃酮類成分，如槐米、陳皮、射干、紅花、甘草、蒲黃、枳實、芫花、金銀花、菊花、山楂、淫羊藿、桎木和地錦等。除了藥用價值外，其中的部分黃酮類化合物（特別是來源自藥食兩用的中草藥）顯然可應用在功能性食品。1.5 本實驗的目的和意義黃酮類化合物廣泛存在于生物體內(nèi)，具有多方面的生理活性，是許多中草藥的有效成分之一,具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保護心血管、免疫調(diào)節(jié)

16、、保肝等等多種功能,在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有著廣闊的應用前景，對黃酮類化合物的研究也引起了國內(nèi)外學者的廣泛重視。 2 實驗材料與方法2.1實驗試劑名稱 純度 廠商無水乙醇 （2500 ml，分析純） (安徽安特生物化學有限公司)蘆丁標準品 （1 g，生化試劑） （國藥集團化學試劑有限公司）石油醚 （500 ml，分析純） （ 天津市光復科技發(fā)展有限公司）乙酸乙酯 （500 ml，分析純） （天津市富宇精細化工有限公司）亞硝酸鈉 （500 g，分析純） （天津市大茂化學試劑廠）硝酸鋁 （500 g，分析純） （天津市光復精細化工研究所）氫氧化鈉 （500 g，分析純） （天津市科密歐化學試

17、劑公司）氯仿 （500 ml，分析純） （湖南匯虹試劑有限公司）甲醇 （500 ml，分析純） (汕頭市面隴化工廠有限公司)薄層層析硅膠 （500 g，化學純） (青島海浪硅膠干燥劑廠)羧甲基纖維素鈉 （500 g，分析純） （天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心）2.2試驗設備名稱 廠商re-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市英峪予華儀器廠shz-d真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠al-104電子分析天平 梅特勒托利多儀器（上海）有限公司gzx-9100me恒溫干燥箱 上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠wfz.uv-2100型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司超純水儀 廣大力德高端水處理設備kq-c玻璃儀器氣流

18、烘干機 鞏義市英峪予華儀器廠2.3試劑的配制蘆丁標準品的配制：10 mg蘆丁標準品（蕓香葉苷，三水）加入幾滴乙醇溶解，加入60%乙醇定容至100 ml，搖勻，即得標準品。5%亞硝酸溶液：精密稱取10.00 g亞硝酸鈉，溶解，定容至200 ml，即得。10%硝酸鋁溶液：精密稱取35.21 g九水硝酸鋁，溶解，定容至200 ml，即得。4%氫氧化鈉溶液：精密稱取8 g氫氧化鈉，溶解，定容至200 ml，即得。1%alcl3乙醇溶液：精密稱取2 g氯化鋁，定容至200 ml，即得。展開劑的配制：分別精密量取氯仿，甲醇，水，65 ml，45 ml，12 ml，混合即得。70%乙醇：精確量取700 ml

19、無水乙醇，定容至1000 ml。60%乙醇：精確量取600 ml無水乙醇，定容至1000 ml。2.4黃酮類化合物標準曲線的制備由于蘆丁和黃酮類化合物均是以2-苯基色原酮為母核結(jié)構(gòu)，具有相同的吸光度測試性質(zhì)，故用蘆丁制作標準曲線。精密稱取蘆丁對照品5 mg置于50 ml容量瓶中，加入幾滴無水乙醇使其溶解，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得標準溶液。精密量取上述標準溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分別置于10ml容量瓶中，加入蒸餾水使成5 ml，精密加5%亞硝酸溶液0.3 ml，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液

20、2 ml，各用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置10 min，以第一管為空白，在510 nm處測定光密度值。2.5盤龍參中總黃酮的提取取5 g粉碎好的經(jīng)索氏提取去除色素的盤龍參于50 ml圓底燒瓶中，加入50 ml70%無水乙醇回流1.5 h，提取23次，合并提取液。2.6盤龍參中黃酮類物質(zhì)的提純將回流液濃縮至30 ml左右，加入幾滴稀鹽酸進行酸化，搖勻。放置5 min，加入等體積的乙酸乙酯進行混合，萃取23次，合并萃取液。濃縮（精提液），即得黃酮類粗提物，平行三次。2.7黃酮類物質(zhì)含量測定2.7.1粗提物中黃酮的含量測定樣品液5 ml于50 ml燒杯中，加入25 ml蒸餾水稀釋，再加5%亞硝酸溶液

21、1.5 ml，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.5 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 ml，放置10 min，定容，測定吸光度。2.7.2濃縮液中黃酮的含量測定將濃縮液定容至25 ml,取濃縮液1 ml于50 ml燒杯中，加入25 ml蒸餾水稀釋，再加5%亞硝酸溶液1.5 ml，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.5 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 ml，放置10 min，定容測定吸光度。2.8盤龍參中黃酮類物質(zhì)提取的工藝優(yōu)化2.8.1乙醇濃度對提取率的影響 稱取5.0 g粉碎過篩好的經(jīng)索氏提取去除色素的盤龍參3份，分別置于50 ml

22、圓底燒瓶中，分別編號a、b、c。分別加入125 ml70%、75%、80%無水乙醇回流1.5 h提取，得粗提液，使其體積為125 ml，量取5 ml，定容置25 ml，測定其吸光度。將回流液濃縮至50 ml左右，加入幾滴稀鹽酸進行酸化，搖勻。放置5 min，加入等體積的乙酸乙酯進行混合，萃取23次，合并萃取液。濃縮，定容至25 ml，量取1 ml，定容至25 ml，測定其吸光度，平行三次。2.8.2盤龍參的質(zhì)量與乙醇的體積的比值（料液比）對提取率的影響稱取5.0 g粉碎過篩好的經(jīng)索氏提取去除色素的盤龍參3份，分別置于50 ml圓底燒瓶中，分別編號a、b、c。分別加入75 ml、100 ml 、

23、125 ml65%無水乙醇回流1 h提取，得粗提液，使其體積為75 ml、100 ml 、125 ml，分別量取5 ml，定容置25 ml，測定其吸光度。將回流液濃縮至50 ml左右，加入幾滴稀鹽酸進行酸化，搖勻。放置5 min，加入等體積的乙酸乙酯進行混合，萃取23次，合并萃取液。濃縮，定容至25 ml，量取1 ml，定容至25 ml，測定其吸光度，平行三次。2.8.3提取時間對提取率的影響稱取5.0 g粉碎過篩好的經(jīng)索氏提取去除色素的盤龍參3份，分別置于50 ml圓底燒瓶中，分別編號a、b、c。分別加入100 ml70%無水乙醇回流1h、1.5 h、2.0 h提取，得粗提液，使其體積為10

24、0 ml，量取5 ml，定容置25 ml，測定其吸光度。將回流液濃縮至50 ml左右，加入幾滴稀鹽酸進行酸化，搖勻。放置5 min，加入等體積的乙酸乙酯進行混合，萃取23次，合并萃取液。濃縮，定容至25 ml，量取1 ml，定容至25 ml，測定其吸光度，平行三次。2.9盤龍參中黃酮類物質(zhì)的鑒定2.9.1鹽酸-鎂粉反應在樣品液中加入少量鎂粉，在滴加1-2滴濃鹽酸，在沸水中加熱3 min中，觀察反應結(jié)果。2.9.2堿性試劑顯色反應樣品液2-3 ml于50 ml燒杯中，加入25 ml蒸餾水稀釋，再加5%亞硝酸溶液1.5 ml，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.5 ml，搖勻，放置6 m

25、in，加4%氫氧化鈉試液10 ml，觀察結(jié)果。2.9.3 薄層層析對比取活化好的薄層板3塊，每塊薄層板分別點3個樣，1 蘆丁標準品；2 黃酮類粗取物（未脫色）；3黃酮類粗提物（脫色）。使用氯仿-甲醇-水=65：45：12為展開劑，用三氯化鋁-乙醇=1：99顯色。觀察區(qū)別。結(jié)論 本論文只是初步對盤龍參中的總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，黃酮類物質(zhì)是以c6-c3-c6為基本碳架的一系列化合物。主要包括黃酮和黃酮醇；黃烷酮（又稱二氫黃酮）和黃烷酮醇（又稱二氫黃酮醇）；異黃酮；異黃烷酮（又稱二氫異黃酮）；查耳酮；二氫查耳酮；橙酮（又稱澳咔）；黃烷和黃烷醇；黃烷二醇（3，4）（又稱白花色苷元）；花（色）又稱2-

26、苯基苯并吡（喃）。黃酮類化合物均有不同的脂溶性和水溶性，本論文中所使用的有機溶劑乙酸乙酯對粗提液中的黃酮類化合物進行精提，主要是提取脂溶性的黃酮類化合物。采用此方法的原因是因為盤龍參中脂溶性的黃酮類類物質(zhì)含量較高。本論文使用的盤龍參進行回流提取前均采用索氏提取法去除色素，目的是是防止色素在吸光度的測定是產(chǎn)生干擾，保證實驗的精確性。 本論文初步確定了盤龍參中黃酮類物質(zhì)提取的最佳工藝條件：乙醇濃度70%、料液比120、提取時間1 h，有較好的應用價值。 本論文也存在不足，比如提取溫度的優(yōu)化，由于設備的原因無法完成，黃酮初提液中含有大量的植物多糖，具有一系列的藥理學功效和保健功能，具有優(yōu)良的應用前景，也是個好的研究方向。  參考文獻1李東菊,林陽.山桔總黃酮的提取及鑒定j.