新奧霉素發(fā)酵液理化性質(zhì)和提取方法的研究

1、新奧霉素發(fā)酵液理化性質(zhì)和提取方法的研究摘要：新奧霉素是本實驗室從一株諾爾斯鏈霉菌的發(fā)酵液中，分離得到的新型核苷類農(nóng)用抗生素。本文通過對發(fā)酵液理化性質(zhì)的研究表明，新奧霉素是一種水溶性抗生素，具有較好的紫外和熱穩(wěn)定性，適合在酸性條件下保存。探索了兩種提取新奧霉素的工藝：新奧霉素發(fā)酵液經(jīng)助濾劑過濾預處理后，采用微濾-納濾組合分離法可以獲得活性收率90%以上的新奧霉素濃縮液；采用4倍體積無水乙醇沉淀和兩次正相硅膠柱層析，可以獲得白色或淡黃色新奧霉素粉末。關(guān)鍵詞：新奧霉素 微濾 納濾 提取 硅膠柱層析study on extraction methods and physico-chemical pro

2、perties of fermentation broth of xinaomycinabstract: xinaomycin is a new nucleoside agricultural antibiotics isolated from the fermentation brth of streptomyces noursei by our laboratory. the physico-chemical properties of fermentation broth and the extraction methods of xinaomycin were studied. xin

3、aomycin is water-soluble antibiotics. it was stable to uv and heat. it was fit for storing in acidic conditions. the fermentation broth of pretreatment was obtained through filtration with filtration aid. two extration methods of xinaomycin: the concentrated liquor of xinaomycin was obtained by usin

4、g combination of microfiltration - nanofiltration with activity yield of 90%; the white or light yellow powder of xinaomycin was obtained by ethanol precipitation and silica gel column chromatography.key words: xinaomycin microfiltration nanofiltration extration silica gel column chromatography近年來，農(nóng)

5、用抗生素的篩選和應(yīng)用已成為農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域的研究重點，而利用放線菌產(chǎn)生的抗生素制備的新農(nóng)藥已逐漸成為無公害農(nóng)藥的主體 1。因此從放線菌的發(fā)酵液中尋找新的農(nóng)用抗生素產(chǎn)物成為當前國內(nèi)外的一個研究熱點2。核苷類抗生素由于具有多樣的生物活性3，在醫(yī)療、農(nóng)藥方面都有重要應(yīng)用。由于來源于微生物的核苷類抗生素具有低毒和環(huán)境友好的特點，而且在抗菌、殺蟲和抗病毒等方面具有較強的抗菌殺蟲作用，所以對其研究越來越受到關(guān)注4。本實驗室從攀西地區(qū)土壤中篩選得到一株諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei），該菌產(chǎn)生一種具有高效、廣譜抗菌作用的新型核苷類農(nóng)用抗生素新奧霉素，（專利申請?zhí)枺?0091006012

6、1.4），經(jīng)多輪誘變選育，已具有了工業(yè)開發(fā)價值。本文就新奧霉素發(fā)酵液的理化性質(zhì)及其提取方法進行了研究，為新奧霉素的發(fā)酵生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面提供技術(shù)支持。1 材料與方法1.1 材料和儀器 菌種：由本實驗室從攀西地區(qū)土壤中篩選得到的諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei）xiao-3。生測指示菌：蠟樣芽孢桿菌（bacillus cereus）購自云南省微生物研究所保藏中心。生測培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。發(fā)酵液：諾爾斯鏈霉菌（streptomyces noursei）xiao-3經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵后提供。試劑和儀器： 硅膠g薄層板、硅膠g200300目（青島海洋化工），c18反相硅膠（ym

7、c）；甲醇、氯仿、正丁醇、冰乙酸為分析純，去離子水；微濾裝置（成都連接流體分離科技有限公司） ，納濾膜（ge water&process technologies），buchi-114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,sbs-100型數(shù)控記滴自動分部收集器，高壓液相色譜系統(tǒng)：shimadzu（島津）液相色譜儀系統(tǒng)。1.2 發(fā)酵液的預處理發(fā)酵液中添加珍珠巖助濾劑，經(jīng)過濾去除菌體和培養(yǎng)基殘渣。1.3 發(fā)酵液理化性質(zhì)1.3.1 熱穩(wěn)定性 各取10ml發(fā)酵液于5支試管中，分別置于40 、60 、80和100下靜置30min、60min和90min，定時取出2ml發(fā)酵液留作生測樣品，冷卻至室溫，管碟法測抑菌圈直徑，

8、每個樣品重復3次。1.3.2 ph穩(wěn)定性 將發(fā)酵液用1mol/l hcl和1mol/l naoh分別調(diào)節(jié)ph至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0，靜置24h后，均調(diào)回發(fā)酵液初始ph，以未處理的發(fā)酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。1.3.3 紫外穩(wěn)定性 將等量的發(fā)酵液置于波長為254nm的紫外燈下分別照射15min、30min、45min和60min，以未處理的發(fā)酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。1.4 新奧霉素的提取方法 新奧霉素發(fā)酵液經(jīng)助濾劑過濾后所得濾液，采用膜處理方法獲得新奧霉素濃縮液；采用乙醇沉淀預處理發(fā)酵液，其上清液樣品經(jīng)過兩次

9、正相硅膠柱層析，再經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮，可得白色或淡黃色粉末的新奧霉素。具體提取工藝路線，見圖1。乙醇沉淀上清液沉淀蒸發(fā)濃縮兩次硅膠柱層析新奧霉素粉末蒸發(fā)濃縮發(fā)酵液助濾劑過濾膜分離提取預處理的發(fā)酵液新奧霉素濃縮液圖 1新奧霉素提取工藝1.41 新奧霉素的膜提取方法 采用微濾（mf）-納濾(nf)組合分離法79制備新奧霉素濃縮液，具體工藝流程：將預處理的發(fā)酵液進行微濾，其透過液再經(jīng)納濾，獲得新奧霉素濃縮液，見圖2。新奧霉素濃縮液廢液預處理的發(fā)酵液mfnf圖2微濾-納濾裝置1.4.2 乙醇沉淀 取4份發(fā)酵液，分別加入2、4、6、8倍體積無水乙醇，靜置1h，離心（6000 r/min， 15min），分離

10、上清液和沉淀，以未處理發(fā)酵液為對照，管碟法測抑菌圈直徑，每個樣品重復3次。1.4.3 正相硅膠柱層析 取適量乙醇沉淀上清濃縮液干法上樣，兩次正相硅膠柱層析的上樣量與硅膠裝柱量比例分別為1：5、1：67，采用不同梯度的氯仿/甲醇/水洗脫。1.5 檢測方法1.5.1 抑菌活性的測定 取含菌量為6.410×107個/ml蠟樣芽孢桿菌（bacillus cereus）懸液，以體積比0.5%的比例添加到58左右的生測培養(yǎng)基中，混勻后迅速制成平板培養(yǎng)基，待凝固后將滅菌的牛津杯等距離均勻擺放，每個牛津杯加樣量200l（所有樣品均稀釋30倍），置30恒溫培養(yǎng)17h后，測量抑菌圈直徑。1.5.2 hp

11、lc檢測 色譜柱:agilent hc-c18柱（4.6×250mm），：265nm，流動相：甲醇/水（5/95，加0.05%冰乙酸)，流速：0.5ml/min，柱溫：402 結(jié)果與分析2.1 發(fā)酵液理化性質(zhì)的研究2.1.1 熱穩(wěn)定性 由表1可以看出，新奧霉素具有較好的熱穩(wěn)定性。發(fā)酵液分別在40、60和80條件下，保溫90 min后，新奧霉素活性基本一致；但溫度達到100，保溫90 min后活性有所下降。因此，在分離提取過程中應(yīng)當盡量避免溫度過高，減少對新奧霉素抑菌活性的影響 。表 1發(fā)酵液熱穩(wěn)定性待添加的隱藏文字內(nèi)容1處理溫度不同處理時間樣品的抑菌圈直徑（mm）30min60min

12、90min4026.3725.9425.626026.2825.7725.538026.0025.4825.4510025.0224.6223.732.1.2 ph穩(wěn)定性 新奧霉素發(fā)酵液初始ph為3（ck），發(fā)酵液經(jīng)酸、堿分別處理后，回調(diào)ph至3，生測結(jié)果見圖3。結(jié)果表明用酸對發(fā)酵液處理后，其活性有微小的上升，而用堿處理后，抑菌活性隨著ph的升高，有所下降。圖 3 發(fā)酵液ph的穩(wěn)定性2.1.3 紫外穩(wěn)定性 從圖4可知，新奧霉素發(fā)酵液對紫外照射不敏感。發(fā)酵液經(jīng)過254nm紫外光照射，抑菌活性無明顯變化，說明發(fā)酵液中的新奧霉素具有很好的紫外穩(wěn)定性，無需避光保存。圖4發(fā)酵液紫外穩(wěn)定性2.2 新奧霉素

13、的提取2.2.1 膜分離提取新奧霉素 本實驗采用管式陶瓷膜對發(fā)酵液進行微濾，柱前后壓差1.3kg，溫度25，流速8l/h，透過液澄清且活性基本無變化。微濾透過液進入納濾裝置，柱前后壓差0.7kg，溫度28，流量4l/h，濃縮了5倍，活性回收率達90%以上。納濾可節(jié)省生產(chǎn)消耗成本，其截留濃縮液可以進一步進行納濾濃縮，制備濃度更高的新奧霉素母液。2.2.2 乙醇沉淀發(fā)酵液 采用不同體積倍數(shù)無水乙醇處理發(fā)酵液，去除一些雜蛋白質(zhì)。結(jié)果說明隨著乙醇體積倍數(shù)的增大，析出的固形物增多，上清液的抑菌活性減?。▓D6），而沉淀的抑菌活性增加。當使用8倍體積乙醇沉淀發(fā)酵液時，沉淀的抑菌圈直徑已與上清液的抑菌圈直徑相

14、近，說明此時新奧霉素也被大量沉淀。綜合考慮無水乙醇用量和新奧霉素的活性收率，選擇用4倍體積無水乙醇處理發(fā)酵液，活性收率在90%以上。圖6不同體積倍數(shù)乙醇沉淀發(fā)酵液的影響2.2.3 新奧霉素的柱層析分離 發(fā)酵液醇沉上清濃縮液經(jīng)過第一次正相硅膠柱分離發(fā)現(xiàn)，當采用第一梯度洗脫劑（氯仿/甲醇/水體積比為6.5：3.5：0.7）時，能洗脫大量色素和其它弱極性的物質(zhì)，而在第二梯度洗脫劑（氯仿/甲醇/水體積比4.5：5.5：1.2）中，新奧霉素能夠被集中洗脫下來，在55減壓蒸發(fā)得到棕色膏狀樣品。此樣品經(jīng)第二次硅膠柱分離，合并收集活性部分的洗脫液，濃縮干燥，得到白色或淡黃色新奧霉素粉末，經(jīng)hplc初步檢測新奧

15、霉素峰面積大于97%，見圖7。圖7二次硅膠柱層析得到的新奧霉素hplc圖譜3結(jié)論新奧霉素是一種水溶性抗生素，其發(fā)酵液具有較好的紫外和熱穩(wěn)定性，對酸堿不敏感。通過對新奧霉素發(fā)酵液理化性質(zhì)的研究，可以有效的指導新奧霉素提取工藝條件，獲得較高的活性收率。新奧霉素發(fā)酵液添加珍珠巖助濾劑預處理，過濾得到的濾液，采用微濾-納濾組合分離法可以獲得體積濃縮5倍、活性收率90%以上的新奧霉素濃縮液；采用4倍體積無水乙醇沉淀和兩次正相硅膠柱層析，可以獲得含量大于97%的白色或淡黃色新奧霉素粉末。利用膜工藝技術(shù)制備新奧霉素濃縮液的過程，步驟簡單、耗能小，而且可進一步加工為新奧霉素母液進行工業(yè)化生產(chǎn)；由于本文提取新奧

16、霉素粉末工藝的生產(chǎn)成本較高，所以還有待于進一步改進其提取工藝。參考文獻：1 代鵬等. 一株拮抗放線菌菌株jfa-001的鑒定j. 植物保護學報, 2008, 35(1): 95-96.2 汪江峰, 張玲玲, 黃劍. 放線菌p3-2的抗菌活性篩選幾發(fā)酵液穩(wěn)定性研究j. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2010, 6: 16-19.3 kiyoshi isono. nucleoside antibiotics: strutre, biological activity, and biosynthesis .the journal of antibioticsj, 1988, 12 : 1711-17394 陳文青

17、, 鄧子新. 核苷類抗生素代謝工程的研究現(xiàn)狀及展望j. 中國抗生素雜志, 2009, 34(3): 129-141.5 周德慶. 微生物學實驗手冊m. 上海：上?？茖W技術(shù)出版社，19866 wang x l, ying a l, wang w n, nanofiltration of l-phenylalanine and l-aspartic acid aqueous solutionj. j membr sci, 2002, 196(1): 597 brites alves a m, morao a, cardoso j p, et al. isolation of antibiotics from industr