獸藥殘留樣品前處理技術(shù)PPT課件

1、目錄contents01020304第1頁/共36頁01PART概述 Introduction第2頁/共36頁030201樣品前處理是指樣品的制備和對樣品中的待測組分進(jìn)行提取、凈化和濃縮的過程。樣品前處理的目的是消除基質(zhì)干擾，保護(hù)儀器，提高檢測方法的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度、精密度。概述第3頁/共36頁基體復(fù)雜各目標(biāo)化合物性質(zhì)差異大殘留濃度低檢測限越來越嚴(yán)格01020304殘留分析特點第4頁/共36頁SAMPLE TYPES獸藥殘留分析中，最常用的生物樣品是組織樣品和禽蛋，其次是奶、血液和尿液樣品。樣品類型第5頁/共36頁 肌肉中水分約占75%，蛋白質(zhì)（肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白）占

2、19%，脂肪（中性脂肪、脂肪酸和磷脂）占2.5%，糖類占1.2%，以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白（肌紅蛋白、糖解酶）可溶于水，肌原蛋白（肌球蛋白、肌動蛋白）溶于濃鹽水，膠原蛋白和彈性蛋白（結(jié)締組織）在上述溶劑中均不溶。動物組織第6頁/共36頁 禽蛋包括蛋黃和蛋清。蛋黃的含水量約50%、蛋白質(zhì)16.5%、脂肪33%、糖類0.2%，以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類（淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過氧化氫酶）。蛋清含水量達(dá)88%，蛋白質(zhì)10.5%和極少量的碳水化合物和脂肪。 與蛋清相比較，蛋黃基本上為疏水性環(huán)境，低極性藥物的殘留較多。如果需要分別測定蛋黃和蛋清中的殘留，最好將剛產(chǎn)出后的蛋分離蛋黃

3、和蛋清，避免藥物由蛋黃向蛋清擴(kuò)散。禽蛋第7頁/共36頁 奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白構(gòu)成的束膠體系，當(dāng)酸化或加熱時，束膠結(jié)構(gòu)解體，蛋白質(zhì)沉淀析出。非解離性的或極性較低的藥物易由血漿向奶中擴(kuò)散，導(dǎo)致奶中殘留。與血漿樣品類似，奶中的藥物可與蛋白結(jié)合。 牛奶的含水量約87%，蛋白質(zhì)（以酪蛋白為主）為3.3%，脂肪（甘油三酯）為3.7%，糖類（乳糖）為4.7%，以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類（過氧化物酶、脂肪酶等）。奶樣第8頁/共36頁 血液由血漿和血清組成。血漿和血清的化學(xué)成分與組織液相近，測定血漿或血清中藥物濃度，比全血更能反映作用部分藥濃的變化，測定方法一般也可互相通用。若血漿中含有抗凝劑對測定

4、有影響，則應(yīng)使用血清樣品。通常藥物在血漿中均與血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白）發(fā)生一定程度的結(jié)合，一些藥物的蛋白結(jié)合率甚至可達(dá)90%以上。因此在萃取之前，必須將結(jié)合態(tài)的藥物分離出來。血樣第9頁/共36頁 尿中藥物大多呈結(jié)合狀態(tài)，主要以葡萄苷酸和硫酸酯結(jié)合物存在，因此無論直接測定或萃取分離之前，都必須將結(jié)合態(tài)的藥物水解，使藥物游離處理。尿液的主要成分是水、尿素及鹽類。在所有體液樣品中，尿樣最容易獲得，并且樣品最多，內(nèi)含藥物（母體藥物及代謝物）濃度高；正常尿液中僅含微量蛋白質(zhì)，不需要去蛋白處理。尿樣第10頁/共36頁02PART樣品預(yù)處理Sample Pretreatment第11頁/共

5、36頁常用的結(jié)合物水解的方法有酸水解和酶水解藥物在體內(nèi)經(jīng)第二相代謝反應(yīng)之后，常形成葡萄糖苷酸、硫酸酯及磷酸酯等結(jié)合物。以結(jié)合狀態(tài)存在的藥物多存在于尿中，但也存在于肝臟、肌肉及血液中。Lorem ipsum dolor sit amet consectetur adipisicing elit 結(jié)合物水解第12頁/共36頁酸水解酸水解有的藥物的結(jié)合物則必須采取較劇烈的條件，如加入3 mol/L鹽酸溶液后還必須煮沸1h，水解后的樣品呈強(qiáng)酸性，必要時可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取。酸水解通常使用無機(jī)酸（鹽酸），至于加入鹽酸的濃度、酸化時間以及是否需要加熱等，隨藥物性質(zhì)而異，但最終應(yīng)通過實驗確定。第13

6、頁/共36頁酶水解酶水解-葡糖苷酸酶可專門水解藥物的葡萄糖醛酸苷，芳基硫酸酯酶和磷酸酯酶分別水解藥物的硫酸酯和磷酸酯。也可用幾種酶的混合物，將生物樣品中藥物的葡萄糖醛酸酐及硫酸酯同時水解。酶水解是專屬性很強(qiáng)的水解結(jié)合物的方法。通常使用的水解酶是-葡糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶、磷酸酯酶等。第14頁/共36頁蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)生物樣品如肝臟、腎臟、血漿等含有大量的蛋白質(zhì)，它們能結(jié)合藥物，因此對于某些藥物檢測，必須先將與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物游離之后再作進(jìn)一步處理。除蛋白質(zhì)第15頁/共36頁除蛋白過程是將蛋白質(zhì)變性處理后，把與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物解離出來，離心分離出去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白樣品中加入適當(dāng)?shù)某恋?/p>

7、劑或變性劑，使蛋白質(zhì)脫水而沉淀（如有機(jī)溶劑、中性鹽），有的是由于和蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而析出（如一些酸類：三氯乙酸、高氯酸、磷酸、苦味酸）去蛋白原理第16頁/共36頁有機(jī)溶劑沉淀劑甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離，得到澄清的上清液；乙腈與蛋白形成致密沉淀，易離心除去，沉淀效率較甲醇高。使用時應(yīng)加入足量的沉淀劑，通常加入量為樣品體積的2倍。第17頁/共36頁常用的酸性沉淀劑有三氯乙酸和高氯酸，其它還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)的陽離子形成不溶性鹽而沉淀，必要的條件是溶液的pH要低于蛋白的等電點。第18頁/共36頁LOREM IPSUM一些無機(jī)鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯

8、化鈉等，能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷，使蛋白質(zhì)失去膠體性而沉淀下來。無機(jī)鹽中以硫酸銨最常用。鹽沉淀劑鹽沉淀劑第19頁/共36頁03PART提取與凈化Extraction & Cleanup第20頁/共36頁提取凈化方法液-液萃取基質(zhì)固相分散技術(shù)超臨界流體萃取固相微萃取免疫親和色譜固相萃取第21頁/共36頁04010203通過萃取可將被測組分自大量內(nèi)源性物質(zhì)中分離出來，減少雜質(zhì)對測定的干擾操作簡單快速、經(jīng)濟(jì)實用可一次進(jìn)行多個樣品的萃取可將萃取液蒸發(fā)，使組分富集液-液萃取經(jīng)典第22頁/共36頁溶劑的極性溶劑的極性1根據(jù)相似相溶原理，極性組分易溶于極性溶劑，反之亦然，應(yīng)根據(jù)被測組分的極性選

9、擇相似極性的溶劑2溶劑的沸點溶劑的沸點 萃取分離后的有機(jī)相通常需要旋蒸至干，因此萃取溶劑的沸點就不應(yīng)接近或高于水的沸點，否則揮發(fā)困難3溶劑的毒性溶劑的毒性使用對人體有害的萃取溶劑時，應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行4與水的互溶性與水的互溶性有的溶劑如乙醚，萃取后可混入大約1.2%的水分，因此伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì) 液-液萃取常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。第23頁/共36頁陽離子藥物配對的離子對試劑則為陰離子，其中以烷基磺酸類（RSO3H）為最常用，實際起配對作用的是其陰離子（RSO3-），R為烷基，其碳鏈越長，生成的離子對絡(luò)合物脂溶性

10、越高。 一些酸性或堿性較強(qiáng)的有機(jī)藥物在體液中呈離解狀態(tài)，成為親水性較強(qiáng)的帶電離子，即使控制pH也不能抑制它們的電離，不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來。陰離子藥物配對的離子對試劑主要為烷基季銨類化合物，可用通式R4N+X-表示，X-可為酸根或氫氧根，R為烷基。烷基碳鏈長度常用C4C12，甚至可選用C20，碳鏈越長，則生成的離子對絡(luò)合物的脂溶性越高。第24頁/共36頁固相萃取是一種基于色譜分離的樣品前處理方法。固相萃取包括固相（具有一定官能團(tuán)的固體吸附劑）和液相（樣品及溶劑）。液體樣品在正壓、負(fù)壓或重力的作用下通過裝有固體吸附劑的固相萃取裝置。由于固體吸附劑具有不同的官能團(tuán)，能將特定的化合物吸附

11、并保留在SPE柱上。固相萃?。⊿PE）吸附目標(biāo)物吸附雜質(zhì)第25頁/共36頁基質(zhì)固相分散技術(shù) 基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD，matrix solid-phase dispersion），其原理是將涂漬有C18等多種聚合物的擔(dān)體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來。其優(yōu)點是濃縮了傳統(tǒng)的樣品前處理中的樣品勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過程，不需要進(jìn)行組織勻漿、沉淀、離心、pH調(diào)節(jié)和樣品轉(zhuǎn)移等操作步驟，避免了樣品的損失。第26頁/共36頁超臨界流體具有類似氣體的較強(qiáng)穿透力和類似于液體的較大密度和溶解度，具有良好的溶劑特性，可

12、作為溶劑進(jìn)行萃取、分離單體。超臨界流體萃取第27頁/共36頁固相微萃取 固相微萃?。⊿PME）與固相萃取原理相似，其基本原則也是“相似相溶原理”，主要依據(jù)分析物質(zhì)的分子量（揮發(fā)性）與極性。纖維頭上的薄膜由極性的聚丙烯酸酯、聚乙二醇，或非極性的聚二甲硅氧烷組成。第28頁/共36頁04PART實例分析Analysis of Example第29頁/共36頁進(jìn)出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法SN/T 1924-2011第30頁/共36頁 -受體激動劑是指含氮激素中的苯乙胺類藥物。苯乙胺類藥物具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核，苯環(huán)上連接有堿性的-羥胺（腫

13、胺）側(cè)鏈。按照苯環(huán)上取代基的差異，可將PEAs分為苯胺型和苯酚型。-受體激動劑藥物R1R2R3R4克侖特羅-Cl-NH2-Cl-C(CH3)3萊克多巴胺-H-OH-H沙丁胺醇-CH2OH-OH-H-C(CH3)3特布他林-OH-H-OH-C(CH3)3第31頁/共36頁稱取5g試樣，添加50L內(nèi)標(biāo)工作液，加入20mL乙酸銨緩沖溶液（），均質(zhì)1min8000r/min離心5min，收集上清液，加入20mL正己烷，振蕩脫脂加入40L-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，混勻，37酶解16h。12000r/min離心5min，下層水相過濾，待凈化01020304提取第32頁/共36頁依次用3 mL甲醇、3mL水和鹽酸水溶液活化依次