第七章動物染色體工程

1、第七章第七章 動物染色體工程動物染色體工程（chromosome engineering）7 動物染色體工程 染色體工程：按設計、有計劃地消減、添加或代換同種與異種染色體以及染色體內(nèi)部部分遺傳操作的技術(shù)。 可用于：遺傳等基礎研究、多倍體育種、人工誘導雌雄核發(fā)育、性別控制等。7.1 人工誘導多倍體人工誘導多倍體 多倍體：？植物多、動物少。 多倍體的優(yōu)點：生長快、成活率高、抗病能力強、經(jīng)濟效益高等。 如美洲角蛙（4n）、銀鯽（天然3n）。 20世紀30年代以來，陸續(xù)人工誘導成功多倍體動物?，F(xiàn)今已成為低等經(jīng)濟動物育種的主要技術(shù)，且社會和經(jīng)濟效益明顯。7.1.1 人工誘導多倍體動物的方法人工誘導多倍體

2、動物的方法 原理： 染色體加倍多倍體； 3n抑制受精卵第二極體放出； 4n 抑制第一次卵裂。 （受精？極體？卵子？卵裂？）7.1.1 人工誘導多倍體動物的方法人工誘導多倍體動物的方法 1、生物學方法：雜交（特別是種間雜交，第二極體不排出）產(chǎn)生異源多倍體。 雌草魚（2n=48） 雄三角魴3n雜種（3n=72）； 異育銀鯽與興國紅鯉雜種受精卵融合復合四倍體。7.1.1 人工誘導多倍體動物的方法人工誘導多倍體動物的方法 2、物理學方法：溫度休克、水靜壓、高鹽高堿。 （1）溫度休克法：略高、低于致死溫度（冷05，熱30 ）處理阻止第二極體排除（或第二次減分）3n或4n. 廉價、易操作。 冷水性魚：熱休

3、克；溫水性魚：冷休克。7.1.1 人工誘導多倍體動物的方法人工誘導多倍體動物的方法 （2）水靜壓法： 65/2，35min，抑制第二極體排出或第一次卵裂。 優(yōu)點：成功率高（95100%）、處理時間短、受精卵損傷小、成活率高。 缺點：設備成本高。7.1.1 人工誘導多倍體動物的方法人工誘導多倍體動物的方法 3、化學方法： 細胞松弛素b、秋水仙素類4n； 麻醉劑（n2o、chclf2、peg）3n。 缺點：化學品價貴、有毒性、發(fā)育成沒價值的嵌合體、推廣難。7.1.2 多倍體倍性鑒定多倍體倍性鑒定 各處理后：有多倍體、二倍體、嵌合體。 直接和間接鑒定染色體倍性。 1、核體積測量：多倍體核大于二倍體核

4、。如魚類紅細胞核2n : 3n : 4n = 1 : 1.5 : 1.74。 2、蛋白質(zhì)電泳：有差異，但要慎用。 3、生化分析：如關(guān)東銀鯽的3n：紅細胞少、大，血紅蛋白高，丙酮酸激酶高。 染色體計數(shù)：直接但費時。7.1.2 多倍體倍性鑒定多倍體倍性鑒定 5、dna含量測定：流式細胞儀測定單細胞dna含量、顯微光密度測定dna組織切片。7.1.3 多倍體動物的應用多倍體動物的應用 1、生活和生長能力： 低等動物種間雜種生長快，但成活率低。 人工誘導的3n種間雜種多數(shù)成活率高，生長快。 2、性腺發(fā)育與應用： 3n不育，能耗下降，避免繁殖、肉質(zhì)下降、上市延遲，價格好，生長不停滯、不死亡、養(yǎng)殖成本下降

5、，經(jīng)濟效益高。（4n與2n雜交獲3n） 3、其他經(jīng)濟形狀：多倍體肉質(zhì)美、耐低氧、抗病強、對光和聲感覺遲鈍。7.2 人工誘導雌、雄核發(fā)育人工誘導雌、雄核發(fā)育 7.2.1 人工誘導雌核發(fā)育（gynogenesis）： 雌核發(fā)育：核失活或消失的精子與正常卵子受精，胚胎發(fā)育僅由母體基因（卵子）控制個體發(fā)育現(xiàn)象?？勺匀话l(fā)生和人工誘導。 1、精子遺傳物質(zhì)的失活： （1）輻射： r射線（60co、173cs、） x射線：穿通力強、處理大體積的精子；染色體斷裂；精子存活有影響；少量精子染色體片段可能有作用。7.2.1 人工誘導雌核發(fā)育 紫外線：穿透力低，但安全；胸腺嘧啶二聚化，可見光下可修補復活，處理效果不很

6、好。 （2）化學物質(zhì)： 甲苯胺藍、乙烯尿素、二甲基硫酸等。 （3）顯微手術(shù)：除去受精卵的雄原核。7.2.1 人工誘導雌核發(fā)育 2、二倍體化： （1）溫度和壓力：第二極體、卵裂。 （2）化學制劑：？ 3、雌核發(fā)育的意義： （1）產(chǎn)生單性種群：同型雌配子的品種：全為雌性（xx）后代；異型雌配子的品種（x或y）：后代為雌性（xx）或雄性（yy）。 （2）同源型二倍體克?。?選擇育種；基礎生物學研究。7.2.2 人工誘導雄核發(fā)育人工誘導雄核發(fā)育 雄核發(fā)育（androgenesis）：？ 二倍體雄核生殖的個體生存率很低：精子基因的純合性、卵子的損傷、阻止第一次卵裂的損傷。 意義：遺傳學基礎理論、育種應用

7、、核質(zhì)雜種、性別控制（yy雄性）7.3 動物的性別控制動物的性別控制 意義：畜牧業(yè)、家禽、水產(chǎn)、蠶絲等。 畜牧業(yè)：母畜經(jīng)濟價值高。奶牛、奶羊、母雞等；雄性肉牛、綿羊、豬生長快，肉質(zhì)美，價值高。7.3.1 動物的性別決定動物的性別決定 1、遺傳決定 雄性異配子型： xo、xy 雌性異配子型：zo（昆蟲）、zw（鳥） 雌性單倍性型：孤雌生殖（1n）雄體，受精（2n）雌體。膜翅目：蜜蜂、馬蜂、螞蟻。 2、環(huán)境決定：無性染色體，雌雄同體分化出兩種性器官。位置、內(nèi)環(huán)境決定。 外環(huán)竟決定：蛙：雌體為xx，雄體為xy。蝌蚪在20時，雌雄各半；30 時全為雄體。7.3.2 動物性別控制的途徑與方法動物性別控制

8、的途徑與方法 1、分離x、y精子：直接、經(jīng)濟。 （1）x、y精子的差異：x精子的 dna含量多；x精子的頭部較大；x精子重密度大； x精子膜負電荷較多；y精子速度快；y精子上有特異dna。 （2）精子分離：都不很成熟。離心法；免疫法（y精子有h-y抗原）；流式細胞分類器（dna含量）。7.3.2 動物性別控制的途徑與方法動物性別控制的途徑與方法 2、鑒定胚胎性別： 核型分析（100%準） 生化微量分析（x、y相連的酶活力） 免疫學方法（h-y抗原與其單抗） 分子生物學方法（y染色體的特異標記的dna序列探針與胚胎細胞dna雜交）7.3 動物性別控制的途徑與方法動物性別控制的途徑與方法 3、控制

9、發(fā)育條件： （1）溫度： 鱷魚（無性染色體）：30時全為雌體；32時有雌雄體；34 以上全為雄體。 （2）性激素： 如魚類，甲基睪丸酮使（遺傳）雌體發(fā)育為雄體；雌二醇使（遺傳）雄體發(fā)育為雌體。7.3 動物性別控制的途徑與方法動物性別控制的途徑與方法 4、受精條件： （1）ph 動物陰道ph 影響x、y精子的移動速度。ph偏酸時， y精子的速度慢，x精子的速度快先達卵子而受精。如用凝膠ph劑人為改變動物陰道ph,可控制性別。 （2）激素 在精液中加入生物組織（睪丸、胎盤、腦垂體）制劑或激素，控制性別。 5、性反轉(zhuǎn)法：性激素；性激素+交配技術(shù)篩選（性反轉(zhuǎn)的假雄性（xx ）與雌體交配全為雌魚）。 6

10、、雌、雄核發(fā)育。7.4 動物染色體結(jié)構(gòu)的改造動物染色體結(jié)構(gòu)的改造 7.4.1 染色體片段的刪除和重組 使動物攜帶特定染色體區(qū)片段的缺失突變，利于系統(tǒng)的基因定位和功能分析。 1、放射線誘導染色體缺失突變： 放射線處理es細胞，使染色體產(chǎn)生缺失、易位、倒位、復制與基因內(nèi)的點突變，再植入囊胚內(nèi)，產(chǎn)生帶突變的個體，進行功能的研究。已成為功能基因組學的研究熱點。 2、cre 2 loxp介導染色體重組： cre 2 loxp（源于cause recombination,重組酶）介導兩個loxp間（的序列刪除）重組，導致染色體倒位、刪除、易位，實現(xiàn)染色體的定點操作。7.4.2 染色體的易位染色體的易位 1

11、、雄性（zz）家蠶出絲率高于雌蠶(zw)20%。 2、輻射誘導發(fā)生第10號染色體向w染色體易位，產(chǎn)生兩個易位品系：一個片段有基因w2,另一個有基因 w3。w2、 w3為隱性基因，純合體的卵為（淡）杏黃褐色，同時存在時為黑卵。 3、兩個品系互交：黑雄卵、杏（淡）黃卵雌卵。光電選卵機選雌卵孵化，降低成本。7.5 人工染色體人工染色體 染色體的三個關(guān)鍵（基本）序列：自主復制序列（ars）復制起點確保自我復制；端粒序列（tel）端粒結(jié)束復制、確保獨立和穩(wěn)定性；著絲粒序列（cen）確保平均分配。 人造微小染色體（artificial minichromosome ）：染色體的三個關(guān)鍵序列拼接而成的小染色

12、體。廣泛應用于大片段dna分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療、染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等方面。 如酵母人工染色體（yac）、細菌人工染色體（bac）、哺乳動物人工染色體7.5.1 酵母人工染色體酵母人工染色體 1983年首次構(gòu)建 yac (含染色體三要素和外源dna，55kb)； 1987年構(gòu)建并證明載體yac：能克隆大片段人體dna分子，可用于構(gòu)建高等生物的完整基因組文庫，載體容量提高10倍，達1051010bp。 在人類基因組計劃研究中發(fā)揮了重要作用。7.5.1 酵母人工染色體酵母人工染色體 1、大片段dna的獲?。禾崛∪旧wdna、酶切、電泳、切割回收電泳條帶。 2、yac重組體的構(gòu)建：提取yac質(zhì)粒、酶解、獲取yac載體左右臂（帶選擇標記）、與大片段dna連接yac重組體。 3、yac重組體對酵母的轉(zhuǎn)化： 4、 yac基因庫的鑒定：探針雜交、southern轉(zhuǎn)移 5、目的基因yac克隆的篩選鑒定：pcr 6、目的基因yac克隆的鑒定：探針目的基因某段序列。7.5.2 細菌人工染色體 bac載體：環(huán)狀質(zhì)粒。 yac（容量最大的）載體的缺點：插入的片段大，穩(wěn)定性差；易缺失，文庫不穩(wěn)定；易重排