食品分析蛋白測(cè)定

1、食品分析食品分析 food analysis食品學(xué)院食品學(xué)院 叢叢 健健tel：61900381email：j第四章第四章 食品的一般成分分析食品的一般成分分析n水分的測(cè)定水分的測(cè)定n灰分的測(cè)定灰分的測(cè)定n脂類的測(cè)定脂類的測(cè)定n碳水化合物的測(cè)定碳水化合物的測(cè)定n蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定n維生素的測(cè)定維生素的測(cè)定n酸性物質(zhì)的測(cè)定酸性物質(zhì)的測(cè)定第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定n蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由要由c、h、o、n、s五種元素組成。某些蛋五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的白質(zhì)中還含有微量的 p

2、、cu、fe、i 等。等。 n在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。氮的色素）。蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定n蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%13%總總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。質(zhì)，只是含量及類型不同。n蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)

3、量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。 一般說來，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物一般說來，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如性食品。例如牛肉牛肉20.0%，豬肉，豬肉 9.5%， 兔肉兔肉 21%， 雞肉雞肉 20%， 牛乳牛乳 3.5%， 帶魚帶魚 18.0%， 大豆大豆 40%， 面粉面粉 9.9%， 菠菜菠菜 2.4%， 黃瓜黃瓜 1.0%，蘋果，蘋果 1.4% 蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定n蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分三大類：蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分三大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射

4、率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量；質(zhì)含量； 另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量 還有一類是使用色譜和質(zhì)譜，通過色譜的分離，和質(zhì)譜的質(zhì)量分析還有一類是使用色譜和質(zhì)譜，通過色譜的分離，和質(zhì)譜的質(zhì)量分析進(jìn)行測(cè)定。進(jìn)行測(cè)定。n食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯

5、等非蛋白氮多的要單測(cè)）。氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測(cè)）。具體測(cè)定方法具體測(cè)定方法n凱氏定氮法凱氏定氮法最常用的，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍。最常用的，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用普遍。n雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法n紅外分析儀、紫外分光光度法紅外分析儀、紫外分光光度法n液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜液相色譜和飛行時(shí)間質(zhì)譜蛋白質(zhì)的定量測(cè)定蛋白質(zhì)的定量測(cè)定n一般情況下，蛋白質(zhì)的含氮量一般為一般情況下，蛋白質(zhì)的含氮量一般為 15% 17.6%，有的，有的上下浮動(dòng)。據(jù)此，可以測(cè)出總氮上下浮動(dòng)。據(jù)此，可以測(cè)出總氮 n，從而推算樣品中蛋白，從而推算樣品中蛋白質(zhì)含量。質(zhì)含量。

6、n此數(shù)值（此數(shù)值（6.256.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，用）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，用f f表示。表示。不同種類不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為雞蛋等為6.256.25，花生為，花生為5.465.46，大米為，大米為5.955.95，大豆及其制，大豆及其制品為品為5.715.71，小麥粉為，小麥粉為5.705.70，牛乳及其制品為，牛乳及其制品為6.386.38。蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量25. 6%16nn凱氏定氮法凱氏定氮法n由由kieldhl于于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀

7、法，半微量法及改良凱氏法。半微量法及改良凱氏法。n是通過測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋是通過測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量。白質(zhì)的含量。n此法的結(jié)果稱為此法的結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量：由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含含量：由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物。蛋白質(zhì)的含氮化合物。n凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之凱氏定氮法是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及

8、各種加工食品的分析，可一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍至今仍 被作為被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。三聚氰胺事件三聚氰胺事件n2007.3，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)在中在中國(guó)出口的寵物食品原料小麥蛋白粉中查出三聚國(guó)出口的寵物食品原料小麥蛋白粉中查出三聚氰胺（氰胺（c3n3h6），被懷疑是寵物中毒死亡的），被懷疑是寵物中毒死亡的元兇。元兇。 n之后，中國(guó)政府開始嚴(yán)打三聚氰胺、蛋白精。之后，中國(guó)政府開始嚴(yán)打三聚氰胺、蛋白精

9、。n飼料級(jí)蛋白精是以工業(yè)氮和異丁醛為原料在酸飼料級(jí)蛋白精是以工業(yè)氮和異丁醛為原料在酸催化劑的情況下，經(jīng)縮合反應(yīng)而生成的，異丁催化劑的情況下，經(jīng)縮合反應(yīng)而生成的，異丁叉二氮英文名：叉二氮英文名：isobuty ildene diurea。（或。（或尿素糊化淀粉，其蛋白高達(dá)尿素糊化淀粉，其蛋白高達(dá)100）常量凱氏定氮法原理常量凱氏定氮法原理n樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合

10、成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。使氨蒸出。用用h3bo3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)hcl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)h2so4或標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)hcl溶液吸收后溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)再以標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定過量的酸。滴定過量的酸。常量凱氏定氮裝置常量凱氏定氮裝置2 nh2-(ch2)2 -cooh + 13h2so4 (nh4)2 so4 + 6co2 + 12so2 + 16h2ov濃硫酸的作用濃硫酸的作用： 脫水作用脫水作用使有機(jī)物脫水并碳化為使有機(jī)物脫水并碳化為c c、h h、n n 氧化作

11、用氧化作用將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫?qū)⒂袡C(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫 酸則被還原成二氧化硫酸則被還原成二氧化硫 2h2h2 2soso4 4 c c 2so2so2 2 2h2h2 2o o coco2 2 二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。v加入硫酸鉀的作用加入硫酸鉀的作用：提高溶液沸點(diǎn)：提高溶液沸點(diǎn)而加快有機(jī)而加快有機(jī)物的分解物的分解（3403400 0c c 400 4000 0c c） k2so4+h2so4=2khso4 2khs

12、o4=k2so4+h2o+so3 但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而度過高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：造成損失： （nhnh4 4）2 2soso4 4=nh=nh3 3+(nh+(nh4 4)hso)hso4 4 2(nh 2(nh4 4)hso)hso4 4=2nh=2nh3 3+2so+2so3 3+2h+2h2 2o o 除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。來提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。v加入硫酸銅的作用加入硫酸銅的作用

13、 催化作用催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解：加速有機(jī)物的氧化分解 c c 2cuso4 cu2cuso4 cu2 2so4 so4 soso2 2 coco2 2 cu2so4 2h2so4 2cuso4 2h2o so2 此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。 消化完全指示消化完全指示：藍(lán)綠色；：藍(lán)綠色； 蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)完全指示蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)完全指示：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀。色沉淀。 在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈在消化完全的樣品溶液

14、中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣 (nh4)2 so4 + 2naoh 2nh3 + na2so4 + 2h2o 滴定滴定 待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定, , 藍(lán)綠色藍(lán)綠色灰紅色灰紅色此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定量測(cè)定儀器、試劑儀器、試劑: : 500ml500ml凱氏燒瓶、凱氏定氮裝置凱氏燒瓶、凱氏定氮裝置 消化用：消化用： 濃硫酸濃硫酸 硫酸鉀硫酸鉀 硫酸銅硫酸銅蒸餾用：蒸餾用： 40% 40%氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液吸收用：吸收用： 4% 4%硼酸硼酸滴定用：滴定

15、用： hcl hcl標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1% 0.1%甲基紅乙醇溶液與甲基紅乙醇溶液與0.1%0.1%溴甲酚綠乙醇溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑溶液混合指示劑計(jì)算計(jì)算式中：式中： ww蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； c c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/lmol/l； v v1 1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mlml； v v2 2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mlml； m m樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量，g g； 0.0140.014氮的毫摩爾質(zhì)量，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mmol； f f蛋白質(zhì)系數(shù)。蛋白質(zhì)系數(shù)。10010010014.

16、 0)(12mfvvcw微量凱氏定氮裝置微量凱氏定氮裝置微量凱氏定氮裝置微量凱氏定氮裝置微量凱氏定氮法操作步驟微量凱氏定氮法操作步驟 樣品消化樣品消化 蒸餾蒸餾 吸收吸收 滴定滴定樣品消化樣品消化 : : 步驟：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，加入步驟：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅硫酸銅0.5g0.5g、硫酸鉀、硫酸鉀10g10g和濃硫酸和濃硫酸20ml20ml、玻璃珠數(shù)、玻璃珠數(shù)粒粒小心移入干燥潔凈的小心移入干燥潔凈的500ml500ml凱氏燒瓶中凱氏燒瓶中( (固體或固體或粉末用紙卷成紙筒送入粉末用紙卷成紙筒送入) )，輕輕搖勻，以，輕輕搖勻，以4545斜支于斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上有小孔的石棉網(wǎng)

17、上用電爐以小火加熱用電爐以小火加熱( (或先燒瓶或先燒瓶放在距電爐較遠(yuǎn)處放在距電爐較遠(yuǎn)處) )，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停，待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后止產(chǎn)生后加大火力加大火力( (或?qū)糠旁陔姞t上或?qū)糠旁陔姞t上) )，保持，保持瓶?jī)?nèi)液體微沸瓶?jī)?nèi)液體微沸至液體變藍(lán)綠色透明后至液體變藍(lán)綠色透明后繼續(xù)加熱繼續(xù)加熱微沸微沸30min30min關(guān)閉電爐，取下燒瓶、冷卻關(guān)閉電爐，取下燒瓶、冷卻轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)移至100ml100ml容量瓶中，加水定容。容量瓶中，加水定容。 蒸餾與吸收：蒸餾與吸收：v 按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至瓶?jī)?nèi)裝水至2/

18、32/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。v在接受瓶中加入在接受瓶中加入10ml 40g/l10ml 40g/l硼酸及硼酸及2 2滴混合指示滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。劑，將冷凝管下端插入液面以下。v準(zhǔn)確吸取消化液準(zhǔn)確吸取消化液10ml10ml于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入入10ml10ml氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水進(jìn)行蒸餾。水

19、進(jìn)行蒸餾。v指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min10min，將冷凝管尖端，將冷凝管尖端提離液面繼續(xù)蒸提離液面繼續(xù)蒸1min1min。 滴定滴定 將接受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用將接受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用0.01mol/l0.01mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。不加樣品，從消化開始操作完全相同）。v注意問題：注意問題： 加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸；加入樣品不要沾附在凱氏燒瓶瓶頸； 消化開始時(shí)不要用強(qiáng)火，要控制好熱源，并注消化開始時(shí)不要用強(qiáng)火，要控制好熱源，并注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝

20、酸液將附意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全；在瓶壁上的固體殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全； 樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應(yīng)加入少樣品中若含脂肪或糖較多，在消化前應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化量辛醇或液體石蠟或硅油作消泡劑，以防消化過程中產(chǎn)生大量泡沫；過程中產(chǎn)生大量泡沫； 消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所消化完全后要冷至室溫才能稀釋或定容。所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 v蒸餾、吸收蒸餾、吸收注意問題：注意問題：（1 1）整套裝置不能漏氣，）整套裝置不能漏氣，要注意各蒸汽控制夾子的要注意各蒸汽控制夾子

21、的操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。操作，以防蒸汽受阻爆炸或吸收液倒吸。（2 2）在蒸汽發(fā)生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性在蒸汽發(fā)生瓶中要加入硫酸和甲基橙使呈酸性以防氨蒸出。以防氨蒸出。（3）加堿量要足，）加堿量要足，應(yīng)使消化液呈深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色應(yīng)使消化液呈深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀。沉淀。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。操作要迅速，漏斗要采用水封防氨逸出。（4 4）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸）冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾；吸收液溫度不應(yīng)超過餾；吸收液溫度不應(yīng)超過4040，若超過時(shí)可置于冷，若超過時(shí)可置于冷水浴中使用；蒸餾完畢后，應(yīng)先將水浴中使用；蒸餾完畢后，應(yīng)先將

22、 冷凝管下端提離液面，再蒸冷凝管下端提離液面，再蒸1 1分鐘，將附著在尖分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。吸收液將發(fā)生倒吸。（5 5） 在每次測(cè)定前及兩次測(cè)定之間，均要洗滌在每次測(cè)定前及兩次測(cè)定之間，均要洗滌反應(yīng)管反應(yīng)管( (倒吸法，在吸收瓶中加入蒸餾水，其余倒吸法，在吸收瓶中加入蒸餾水，其余同測(cè)定時(shí)的做法，在蒸汽發(fā)生器中水劇烈沸騰同測(cè)定時(shí)的做法，在蒸汽發(fā)生器中水劇烈沸騰后，立即移開電爐，水即從吸收瓶中倒吸入反后，立即移開電爐，水即從吸

23、收瓶中倒吸入反應(yīng)管，再倒吸入汽水分離管或蒸汽發(fā)生器中，應(yīng)管，再倒吸入汽水分離管或蒸汽發(fā)生器中，打開夾子，即可放出廢水。打開夾子，即可放出廢水。（6 6）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。 (4) (4) 結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算 式中：式中：ww蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%； c c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/lmol/l； v v1 1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mlml； v v2 2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，mlml； m m

24、樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量，g g； 0.0140.014氮的毫摩爾質(zhì)量，氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mmol； f f蛋白質(zhì)系數(shù)。蛋白質(zhì)系數(shù)。10010010014. 0)(12mfvvcw分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量v原理：試樣與硫酸和催化劑一同加熱消化，使原理：試樣與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后在然后在ph=4.8ph=4.8的乙酸的乙酸- -乙酸鈉緩沖溶液中，銨乙酸鈉緩沖溶液中，銨與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的化合物。在與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的化合物。在波長(zhǎng)波長(zhǎng)400nm400

25、nm處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定處測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。量，結(jié)果乘以蛋白質(zhì)系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量v氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0g/l1.0g/l）：精密稱取經(jīng)）：精密稱取經(jīng)105 105 干燥的硫酸銨干燥的硫酸銨0.4720g0.4720g，用水溶解并定容至，用水溶解并定容至100ml ,100ml ,臨用時(shí)用水稀釋至臨用時(shí)用水稀釋至0.1 g/l0.1 g/l雙縮脲法雙縮脲法雙縮脲的性質(zhì)：當(dāng)脲被小心地加熱至雙縮脲的性質(zhì)：當(dāng)脲被小心地加熱至150150160160時(shí)，可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分

26、子而生成雙縮時(shí)，可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成雙縮脲，其與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的脲，其與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵（與雙縮脲中肽鍵相蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵（與雙縮脲中肽鍵相似），因此有雙縮脲反應(yīng)。似），因此有雙縮脲反應(yīng)。在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，用吸收光度法來測(cè)定蛋白質(zhì)含量，最大吸收波長(zhǎng)用吸收光度法來測(cè)定蛋白質(zhì)含量，最大吸收波長(zhǎng)為為560nm560nm。雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng): :堿性環(huán)境堿性環(huán)境coh2nh2n+coh2nh2n

27、1800ch2ncnhcnh2oo+nh3n多肽及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中均含有許多肽鍵，其多肽及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中均含有許多肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同。因此，結(jié)構(gòu)與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同。因此，在堿性條件下與銅離子也能呈現(xiàn)出類似于雙縮在堿性條件下與銅離子也能呈現(xiàn)出類似于雙縮脲的呈色反應(yīng)。其反應(yīng)過程如下：脲的呈色反應(yīng)。其反應(yīng)過程如下：氨基酸的測(cè)定氨基酸的測(cè)定n雙指示劑甲醛滴定法雙指示劑甲醛滴定法n電位滴定法電位滴定法n茚三酮顯色法茚三酮顯色法n氨基酸的分離及測(cè)定氨基酸的分離及測(cè)定氨基酸的測(cè)定氨基酸的測(cè)定蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物

28、為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的物質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的2020種，種，它們對(duì)人體有著極其重要的生理功能，常會(huì)因它們對(duì)人體有著極其重要的生理功能，常會(huì)因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過補(bǔ)充而增強(qiáng)了其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。新陳代謝作用。氨基酸的測(cè)定氨基酸的測(cè)定n隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及，食物隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的成，愈來愈得到人們的重

29、視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對(duì)食品加工工藝的改革，對(duì)保健食品的開發(fā)及對(duì)食品加工工藝的改革，對(duì)保健食品的開發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。就具有極其重要的意義。氨基酸的測(cè)定氨基酸的測(cè)定n 氨基酸的含量一直是某些發(fā)酵產(chǎn)品如調(diào)味品氨基酸的含量一直是某些發(fā)酵產(chǎn)品如調(diào)味品的質(zhì)量指標(biāo)，也是目前許多保健食品的質(zhì)量指的質(zhì)量指標(biāo)，也是目前許多保健食品的質(zhì)量指標(biāo)之一，其中的含氮量可直接

30、測(cè)定，不同于蛋標(biāo)之一，其中的含氮量可直接測(cè)定，不同于蛋白質(zhì)的氮，故稱為氨基酸態(tài)氮。白質(zhì)的氮，故稱為氨基酸態(tài)氮。氨基酸態(tài)氮反氨基酸態(tài)氮反映的是樣品中游離氨基酸的總量。映的是樣品中游離氨基酸的總量。氨基酸態(tài)氮的測(cè)定氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法電位滴定法雙指示劑甲醛滴定法雙指示劑甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-cooh-cooh基和堿性的基和堿性的-nh-nh2 2基?；Ｋ鼈兿嗷プ饔枚拱被岢蔀橹行缘膬?nèi)鹽。當(dāng)它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，加入甲醛溶液時(shí)，-nh-nh2 2基與甲醛結(jié)合，從而使基與甲醛結(jié)合，從而使其堿

31、性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定定-cooh-cooh基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量?？偭?。方法特點(diǎn)及應(yīng)用方法特點(diǎn)及應(yīng)用此法簡(jiǎn)單易行、快速方便，在發(fā)酵工業(yè)中常用此法簡(jiǎn)單易行、快速方便，在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸含量的變化，以了解此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高;

32、;酪氨酸含有羥基，滴定時(shí)會(huì)消耗堿液使結(jié)果偏酪氨酸含有羥基，滴定時(shí)會(huì)消耗堿液使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果高。使結(jié)果高。 特別適合特別適合淺色樣品的測(cè)定淺色樣品的測(cè)定試劑試劑 40% 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將氫氧化鈉將40%40%甲醛中和至淡藍(lán)色。甲醛中和至淡藍(lán)色。 0.1% 0.1%百里酚酞乙醇溶液百里酚酞乙醇溶液 0.1% 0.1%中性紅中性紅50%50%乙醇溶液乙醇溶液 0.1%mol/l 0.1%mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液操作方法操作方法預(yù)處理：

33、預(yù)處理： 移取含氨基酸約移取含氨基酸約202030mg30mg的樣品溶液的樣品溶液2 2份份中和游離酸（用中性紅作指示劑，先測(cè)定其它中和游離酸（用中性紅作指示劑，先測(cè)定其它游離酸的含量）：游離酸的含量）： 其中其中1 1份加入份加入3 3滴中性紅指示劑，用滴中性紅指示劑，用0.1mol/l0.1mol/l氫氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至由紅紅變?yōu)樽優(yōu)殓晟晟珵榻K點(diǎn)，為終點(diǎn)，記錄記錄v v1 1 滴定氨態(tài)氮（用百里酚酞作指示劑測(cè)定氨基滴定氨態(tài)氮（用百里酚酞作指示劑測(cè)定氨基酸和游離酸的總含量）酸和游離酸的總含量）： 另另1 1份加入份加入3 3滴百里酚酞指示劑及中性甲醛滴百里酚酞

34、指示劑及中性甲醛20ml20ml，搖勻，靜置搖勻，靜置1 1分鐘，用分鐘，用0.1mol/l0.1mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)，記錄溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)，記錄v v2 2計(jì)算計(jì)算%100014. 0)(12mvvcw式中：式中： c c：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/l;mol/l; v v1 1：用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體：用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，積，ml;ml; v v2 2：用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的：用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，體積，ml;

35、ml; m m：測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，：測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g g 0.014 0.014：氮的毫摩爾質(zhì)量，：氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmolg/mmol注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)n此法適用于測(cè)定食品中游離的氨基酸。此法適用于測(cè)定食品中游離的氨基酸。n固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱取后用水萃取，固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱取后用水萃取，萃取可在萃取可在50 50 水浴中進(jìn)行水浴中進(jìn)行0.5h0.5h即可。液體樣品即可。液體樣品可直接進(jìn)行測(cè)定?？芍苯舆M(jìn)行測(cè)定。n若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測(cè)若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測(cè)定，或用電位滴定法進(jìn)行測(cè)定。定，或用電位滴定法進(jìn)行

36、測(cè)定。n與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和滴定法，此法用標(biāo)準(zhǔn)堿完全中和-cooh-cooh時(shí)的時(shí)的phph為為8.58.59.59.5，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示，但分析結(jié)果稍偏低，即雙指示劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。劑法的結(jié)果更準(zhǔn)確。電位滴定法電位滴定法原理原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸

37、度計(jì)指示的用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的phph值判斷和控制滴定終點(diǎn)。值判斷和控制滴定終點(diǎn)。n儀器：儀器：酸度計(jì)、磁力攪拌器、堿式滴定管、刻度吸管酸度計(jì)、磁力攪拌器、堿式滴定管、刻度吸管n試劑試劑 酚酞乙醇指示液：酚酞乙醇指示液：1%1% 甲醛：甲醛：36%-38%36%-38% 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.05mol/l0.05mol/l（標(biāo)定）（標(biāo)定）操作 吸取含氨基酸約吸取含氨基酸約20mg20mg的樣品溶液，置于的樣品溶液，置于100ml100ml容量瓶容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取中，加水至刻度，混勻后吸取20.0ml20.0ml燒杯中，加燒杯中，加60ml6

38、0ml水，開動(dòng)磁力攪拌器，用水，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/l0.05mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示滴定至酸度計(jì)指示ph8.2ph8.2（記下消耗（記下消耗0.05mol/l0.05mol/l氫氧化氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)v v，可計(jì)算總酸含量）。，可計(jì)算總酸含量）。 加入加入10ml10ml甲醛溶液，混勻。再用甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/l0.05mol/l氫氧化鈉氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至ph9.2ph9.2，記下消耗，記下消耗0.05mol/l0.05mol/l氫氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升

39、數(shù)v v1 1。 同時(shí)取同時(shí)取80ml80ml水，先用水，先用0.05mol/l0.05mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至phph為為8.28.2，再加入，再加入10.0ml10.0ml甲醛溶液，用甲醛溶液，用0.05mol/l0.05mol/l氫氧氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至ph9.2ph9.2，做試劑空白試驗(yàn)，記下，做試劑空白試驗(yàn)，記下消耗消耗0.05mol/l0.05mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)v v2 2 。n第一次滴定是除去其它游離酸，所消耗的第一次滴定是除去其它游離酸，所消耗的naohnaoh溶液體積不用于計(jì)算氨基酸態(tài)氮，但可溶

40、液體積不用于計(jì)算氨基酸態(tài)氮，但可計(jì)算總酸含量）。計(jì)算總酸含量）。n第二步滴定才是測(cè)定氨基酸，用消耗的第二步滴定才是測(cè)定氨基酸，用消耗的naohnaoh溶液體積進(jìn)行計(jì)算。溶液體積進(jìn)行計(jì)算。n在測(cè)定過程中為什么要加入中性甲醛的作用是在測(cè)定過程中為什么要加入中性甲醛的作用是什么什么？計(jì)算計(jì)算%10010020014. 0)(12mvvcw式中：式中： ww：氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，：氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，%;%; c c：氫氧化鈉濃度，：氫氧化鈉濃度，mol/lmol/l； v v1 1：加入甲醛后耗：加入甲醛后耗n na aohoh的量，的量，mlml； v v2 2：空白試驗(yàn)加甲醛后耗空白試驗(yàn)加甲醛后

41、耗naohnaoh量，量，mlml； 0.0140.014：氮的毫摩爾質(zhì)量，：氮的毫摩爾質(zhì)量，g/molg/mol； m m：樣品量，：樣品量，g. g.說明說明本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測(cè)定量測(cè)定對(duì)于混濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定。對(duì)于混濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定。結(jié)果要求精密度結(jié)果要求精密度10% 10% ，即在重復(fù)條件下兩次，即在重復(fù)條件下兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過算術(shù)平均值的獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過算術(shù)平均值的10%10%。茚三酮顯色法茚三酮顯色法原理：氨基酸在堿性溶液中與茚三酮作用，生原理：氨基酸在堿性溶液中

42、與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物成藍(lán)紫色化合物( (除脯氨酸外均有此反應(yīng)除脯氨酸外均有此反應(yīng)) )，該，該化合物的顏色深淺與氨基酸的含量成正比。化合物的顏色深淺與氨基酸的含量成正比。在在570nm570nm處測(cè)吸光度，處測(cè)吸光度， 用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品溶液需澄清，通常采用活性炭脫色處理。樣品溶液需澄清，通常采用活性炭脫色處理。cococohoh+ccoohhnh2rcocochoh+rchonh3co2+cocochoh+cococcococo+2nh3nh2cococn+2h2o氨基酸的分離與測(cè)定氨基酸的分離與測(cè)定 一薄層色譜法（薄層層析法（一薄層色

43、譜法（薄層層析法（tlc tlc 法）法）thin layer chromatographythin layer chromatography簡(jiǎn)介：簡(jiǎn)介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)檎归_，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)層析在薄層上進(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分

44、析氨基酸、用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。（一）原理：（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的相同的rf值，不同成分則有不同的值，不同成分則有不同的rf值，因而各種混合物值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨可達(dá)到彼此被分離的目的。然后

45、用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。深淺可以大致確定其含量。 nr rf f = a / b = a / bab樣點(diǎn)樣點(diǎn)溶劑前沿溶劑前沿點(diǎn)樣原點(diǎn)點(diǎn)樣原點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 展開時(shí)間短，一般在展開時(shí)間短，一般在20203030分鐘，展開距離通常分鐘，展開距離通常只需只需10 cm10 cm，且分離效果好。，且分離效果好。 層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。能夠使用多種顯色劑。 點(diǎn)樣量少，靈敏度高。（比紙層析高點(diǎn)樣量少，靈敏度高。（比紙層析高101010

46、0100倍）倍） 精確到精確到0.01ug0.01ug。 也可用于大量分離也可用于大量分離500 mg500 mg，作為樣品制備層析。，作為樣品制備層析。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：r rf f值重現(xiàn)性比紙上層析差。值重現(xiàn)性比紙上層析差。n分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。交換、凝膠等。（三）操作方法：（三）操作方法： 薄層板制備薄層板制備 樣品液制備樣品液制備 點(diǎn)樣：距薄板底端點(diǎn)樣：距薄板底端2cm2cm處，用針畫一標(biāo)記作為處，用針畫一標(biāo)記作為 原點(diǎn)。再以點(diǎn)樣距扳子寬窄可點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)同時(shí)原點(diǎn)。再以點(diǎn)樣距扳子寬窄可點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)同時(shí) 展開，點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔

47、展開，點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔1 12cm2cm。a.a.可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一個(gè)點(diǎn)干了再點(diǎn)另一個(gè)點(diǎn)。意要等一個(gè)點(diǎn)干了再點(diǎn)另一個(gè)點(diǎn)。b.b.用一小直徑用一小直徑3 mm 3 mm 濾紙片，浸入樣液，埋到濾紙片，浸入樣液，埋到 板子上先挖好一個(gè)小洞穴。板子上先挖好一個(gè)小洞穴。 展開：點(diǎn)樣完了，放入密閉容器中（展開槽），展開：點(diǎn)樣完了，放入密閉容器中（展開槽），傾斜一定角度傾斜一定角度10103030，下端浸入展開劑，下端浸入展開劑1cm1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點(diǎn)。到離頂端一部分，千萬別讓溶劑浸過了樣點(diǎn)。到離頂端一部分，取出樣板、晾干、

48、顯色。取出樣板、晾干、顯色。a.a.展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點(diǎn)的展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點(diǎn)的2 23 3種有種有機(jī)溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展機(jī)溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展開劑的選擇，因?yàn)槲絼┰谝欢ㄇ闆r下是恒定的，開劑的選擇，因?yàn)槲絼┰谝欢ㄇ闆r下是恒定的，吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇。b.b.展開劑的選擇方法：展開劑的選擇方法：.微量圓環(huán)法。微量圓環(huán)法。.用小載波片試驗(yàn)，微量展開劑展開用小載波片試驗(yàn)，微量展開劑展開5cm5cm。.圖解法：圖解法：樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低的。樣品極性小，選吸附劑活性高

49、，展開劑極性低的。樣品極性大，選吸附劑活性低，展開劑極性高。樣品極性大，選吸附劑活性低，展開劑極性高。 n有機(jī)溶劑極性由小到大為：有機(jī)溶劑極性由小到大為： 石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有機(jī)酸類等。乙醇、甲醇、水、吡啶、有機(jī)酸類等。c.c.展開的方式：展開的方式：上行法、下行法、雙向展開、單向多次展開、雙向上行法、下行法、雙向展開、單向多次展開、雙向多次展開。多次展開。雙向展開：雙向展開： 顯色：顯色：a.a.噴適當(dāng)?shù)娜?/p>

50、液，使斑點(diǎn)顯色，即噴霧顯色。噴適當(dāng)?shù)娜芤?，使斑點(diǎn)顯色，即噴霧顯色。b.b.噴有熒光反應(yīng)的物質(zhì)，在紫外光下觀察斑點(diǎn)。噴有熒光反應(yīng)的物質(zhì)，在紫外光下觀察斑點(diǎn)。c.c.將涂有熒光指示劑的薄層板放在紫外燈下觀察。將涂有熒光指示劑的薄層板放在紫外燈下觀察。 （涂板時(shí)把（涂板時(shí)把熒光指示劑加入到固體吸附劑中）熒光指示劑加入到固體吸附劑中）定性：在同一塊板上，同等條件下操作，被測(cè)樣與定性：在同一塊板上，同等條件下操作，被測(cè)樣與標(biāo)準(zhǔn)樣同時(shí)展開、顯色，同標(biāo)準(zhǔn)樣同時(shí)展開、顯色，同 r rf f 值即是；值即是； 查手冊(cè)找相同的查手冊(cè)找相同的 r rf f 值。值。定量：定量：a.a.目視定量法：以標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)對(duì)照，相

51、當(dāng)于樣目視定量法：以標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)對(duì)照，相當(dāng)于樣品斑點(diǎn)中含量品斑點(diǎn)中含量ugug數(shù)。數(shù)。 b.b.斑點(diǎn)面積定量法。斑點(diǎn)面積定量法。 c.c.將樣點(diǎn)取下來，定容，離心，比色。將樣點(diǎn)取下來，定容，離心，比色。 d.d.利用薄層色譜掃描儀：利用薄層色譜掃描儀： 例：日本島津例：日本島津 cs-910 cs-910 型雙波長(zhǎng)薄型雙波長(zhǎng)薄 層色譜掃描儀層色譜掃描儀 介紹離心薄層色譜儀：介紹離心薄層色譜儀：1. lbg 1型離心薄層色譜儀型離心薄層色譜儀 北京產(chǎn)北京產(chǎn)2. 7924型離心薄層色譜儀型離心薄層色譜儀 美國(guó)美國(guó)harrison 公司研制公司研制3. clc 5型離心制備液體色譜儀（日本日立公司，型離

52、心制備液體色譜儀（日本日立公司，帶紫外檢測(cè)器、記錄器和自動(dòng)收集器，制備量可達(dá)帶紫外檢測(cè)器、記錄器和自動(dòng)收集器，制備量可達(dá) 10g 。二氨基酸自動(dòng)分析儀法二氨基酸自動(dòng)分析儀法三氣相色譜法三氣相色譜法四高效液相色譜法四高效液相色譜法氨基酸自動(dòng)分析儀氨基酸自動(dòng)分析儀10-3食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定n揮發(fā)性鹽基氮是指動(dòng)物性食品由于酶和細(xì)菌的揮發(fā)性鹽基氮是指動(dòng)物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在腐敗過程中，是蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨作用，在腐敗過程中，是蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)（如伯胺、仲胺及叔以及胺類等堿性含氮物質(zhì)（如伯胺、仲胺及叔胺等胺等 ）。）。n揮發(fā)性鹽基氮屬于蛋白質(zhì)

53、分解產(chǎn)物，這些分解揮發(fā)性鹽基氮屬于蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，這些分解產(chǎn)物的含量與動(dòng)物性食品的新鮮程度有明顯的產(chǎn)物的含量與動(dòng)物性食品的新鮮程度有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。故此指標(biāo)可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物性食品的對(duì)應(yīng)關(guān)系。故此指標(biāo)可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物性食品的新鮮度。新鮮度。 n此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，在堿性溶液中蒸出后，此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，在堿性溶液中蒸出后，用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定計(jì)算含量。用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定計(jì)算含量。揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定半微量定氮法半微量定氮法微量擴(kuò)散法微量擴(kuò)散法蛋白質(zhì)分解后產(chǎn)生的堿性含氮物質(zhì)，在氧化鎂堿性條件下蒸蛋白質(zhì)分解后產(chǎn)生的堿性含氮物質(zhì)，在氧化鎂堿性條件下蒸餾以氨的形式釋效，再用酸滴定以定量，所得結(jié)果為

54、揮發(fā)性餾以氨的形式釋效，再用酸滴定以定量，所得結(jié)果為揮發(fā)性鹽基氮。鹽基氮。半微量定氮法測(cè)揮發(fā)性鹽基氮半微量定氮法測(cè)揮發(fā)性鹽基氮n將樣品除去脂肪、骨及腱后，切碎攪勻，稱取將樣品除去脂肪、骨及腱后，切碎攪勻，稱取10g，置于錐形瓶中，加置于錐形瓶中，加100ml水，不時(shí)振搖，浸漬水，不時(shí)振搖，浸漬30min后過濾，濾液置冰箱備用后過濾，濾液置冰箱備用。n預(yù)先將盛有預(yù)先將盛有10ml吸收液并加有吸收液并加有56滴混合指示液的滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插人錐形瓶?jī)?nèi)吸錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插人錐形瓶?jī)?nèi)吸收液的液面下。收液的液面下。n吸取吸取5.0ml上述樣品濾液于蒸餾器反應(yīng)

55、室內(nèi)，加上述樣品濾液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi)，加5ml 1氧化鎂混懸液，迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通氧化鎂混懸液，迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸氣，待蒸氣充滿蒸餾器內(nèi)時(shí)即關(guān)閉蒸氣出口管，入蒸氣，待蒸氣充滿蒸餾器內(nèi)時(shí)即關(guān)閉蒸氣出口管，由冷凝管出現(xiàn)第一滴冷凝水開始計(jì)時(shí)，蒸餾由冷凝管出現(xiàn)第一滴冷凝水開始計(jì)時(shí)，蒸餾5min即停即停止，吸收液用止，吸收液用0.01moll鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點(diǎn)至鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點(diǎn)至藍(lán)紫色。藍(lán)紫色。n同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。微量擴(kuò)散法測(cè)揮發(fā)性鹽基氮微量擴(kuò)散法測(cè)揮發(fā)性鹽基氮微量擴(kuò)散法測(cè)揮發(fā)性鹽基氮微量擴(kuò)散法測(cè)揮發(fā)性鹽基氮第六節(jié)第六節(jié) 維生素的測(cè)定維生素的測(cè)定n

56、維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類維生素是維持人體正常生命活動(dòng)所必需的一類天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的天然有機(jī)化合物。其種類很多，目前已確認(rèn)的有有30余種，其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)余種，其中被認(rèn)為對(duì)維持人體健康和促進(jìn)發(fā)育至關(guān)重要的有發(fā)育至關(guān)重要的有20余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)余種。這些維生素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，雜，理化性質(zhì)及生理功能各異，有的屬于醇類，有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚有的屬于胺類，有的屬于酯類，還有的屬于酚或醌類化臺(tái)物?；蝓惢_(tái)物。維生素都具有以下共同特點(diǎn)：維生素都具有以下共同特點(diǎn)： 這些化合物或其前體化合物都在天然食

57、物中存這些化合物或其前體化合物都在天然食物中存在；它們不能供給機(jī)體熱能。也不是構(gòu)成組織的基在；它們不能供給機(jī)體熱能。也不是構(gòu)成組織的基本原料，主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝本原料，主要功用是通過作為輔酶的成份調(diào)節(jié)代謝過程，需要量極?。凰鼈円话阍隗w內(nèi)不能合成，或過程，需要量極小；它們一般在體內(nèi)不能合成，或合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝??；合成量不能滿足生理需要，必須經(jīng)常從食物中攝?。婚L(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。長(zhǎng)期缺乏任何一種維生素都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。 我們?cè)谠u(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)利用高含量我們?cè)谠u(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)利用高含量維生素的食品資源，指導(dǎo)人們合理調(diào)

58、整膳食結(jié)構(gòu)，維生素的食品資源，指導(dǎo)人們合理調(diào)整膳食結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)制定加工工藝或貯存條件，最大限量地保留各指導(dǎo)制定加工工藝或貯存條件，最大限量地保留各種維生素，還要控制強(qiáng)化食品中加入量，防中毒，種維生素，還要控制強(qiáng)化食品中加入量，防中毒，都離不開分析檢測(cè)工作。都離不開分析檢測(cè)工作。維生素分類：脂溶性（維生素分類：脂溶性（a、d、e、k） 水溶性兩類（水溶性兩類（b族、族、c）測(cè)定方法測(cè)定方法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)生物鑒定法生物鑒定法不用詳盡分離不用詳盡分離費(fèi)時(shí)（費(fèi)時(shí)（2121天）費(fèi)力（主天）費(fèi)力（主要?jiǎng)游镲暳希┮獎(jiǎng)游镲暳希┪⑸锓ㄎ⑸锓ㄟx擇性高，主要用于水溶選擇性高，主要用于水溶性性v v操作繁瑣，耗時(shí)

59、過長(zhǎng)，操作繁瑣，耗時(shí)過長(zhǎng)，要有專門人員要有專門人員儀器分析（紫外法、儀器分析（紫外法、熒光法）熒光法）靈敏、快速、有較好的選靈敏、快速、有較好的選擇性擇性各種色譜法（柱、各種色譜法（柱、紙、薄層層析）紙、薄層層析）高分離效能，可分離、純高分離效能，可分離、純?nèi)?、定性、定量人、定性、定量脂溶性脂溶性v的測(cè)定的測(cè)定 va、vd、ve、與類脂物一起存于食物中，攝食時(shí)與類脂物一起存于食物中，攝食時(shí)可吸收，可在體內(nèi)積貯?？晌?，可在體內(nèi)積貯。 脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)：脂溶性維生素具有以下理化性質(zhì)： 1溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、溶解性：脂溶性維生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯

60、仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。 2耐酸堿性：維生素耐酸堿性：維生素a、d對(duì)酸不穩(wěn)定，對(duì)酸不穩(wěn)定， 對(duì)堿穩(wěn)對(duì)堿穩(wěn)定，維生素定，維生素e對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰對(duì)堿不穩(wěn)定，但在抗氧化劑存在下或惰性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。性氣體保護(hù)下，也能經(jīng)受堿的煮沸。 3耐熱性、耐氧化性：耐熱性、耐氧化性： 耐熱性耐熱性 氧化性氧化性va 好，能經(jīng)受煮沸好，能經(jīng)受煮沸 易被氧化易被氧化 （光、熱促進(jìn)其氧化）（光、熱促進(jìn)其氧化）v d 好，能經(jīng)受煮沸好，能經(jīng)受煮沸 不易被氧化不易被氧化 v e 好，能經(jīng)受煮沸好，能經(jīng)受煮沸 在空氣中能慢慢被化在空氣中能慢慢被化 （光、