常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)一

1、第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 電化學(xué)分析電化學(xué)分析第三節(jié)第三節(jié) 干化學(xué)分析技術(shù)干化學(xué)分析技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 電泳技術(shù)電泳技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 層析技術(shù)層析技術(shù)第六節(jié)第六節(jié) 離心技術(shù)離心技術(shù)第七節(jié)第七節(jié) 自動(dòng)生化分析技術(shù)自動(dòng)生化分析技術(shù) n本章內(nèi)容概要本章內(nèi)容概要n教學(xué)目標(biāo)和要求教學(xué)目標(biāo)和要求1 1、掌握掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。掌握電化學(xué)分析方法基本原理掌握電化學(xué)分析方法基本原理2 2、熟悉熟悉分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長(zhǎng)校正、原子分光光度計(jì)的類(lèi)型和影響熒光分析和波長(zhǎng)

2、校正、原子分光光度計(jì)的類(lèi)型和影響熒光分析的因素。的因素。熟悉熟悉離子選擇電極分類(lèi)，離子選擇電極的分離子選擇電極分類(lèi)，離子選擇電極的分析方法析方法 3 3、了解了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。的應(yīng)用。n分光光度技術(shù)的基本原理分光光度技術(shù)的基本原理n分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)n分光光度計(jì)的操作方法分光光度計(jì)的操作方法 n分光光度技術(shù)的定性和定量方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法 一、光譜分析技術(shù)的基本原理：一、光譜分析技術(shù)的基本原理： 利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜

3、譜系的特征，以此來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。征，以此來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。1 1、 光譜分析技術(shù)分類(lèi)：光譜分析技術(shù)分類(lèi)：發(fā)射光譜分析技術(shù)：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術(shù)：吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見(jiàn)光分光光度法，紫外、可見(jiàn)光分光光度法，原子吸收分光光度法和紅外光譜法原子吸收分光光度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術(shù)：散射光譜分析技術(shù)：比濁法比濁法 微粒性微粒性(e=h(e=hv v) ) 波粒二象性波粒二象性波動(dòng)性波動(dòng)性( ( =c/=c/v v) )e=he=hv v =hc=hc/ / -光的能量與光的波

4、長(zhǎng)成反比，與光的能量與光的波長(zhǎng)成反比，與光的頻率成正比光的頻率成正比2 2、光的基本性質(zhì)、光的基本性質(zhì)-高速傳播的電磁波3 3、物質(zhì)對(duì)光吸收的基本原理：、物質(zhì)對(duì)光吸收的基本原理：能量釋放e1e0吸收光譜發(fā)射光譜激發(fā)態(tài)基態(tài)e1 e04. 4. 分類(lèi)分類(lèi) 1 1、定義：、定義： 根據(jù)被測(cè)物質(zhì)對(duì)各種不同波長(zhǎng)光的根據(jù)被測(cè)物質(zhì)對(duì)各種不同波長(zhǎng)光的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的特性鑒定物質(zhì)的方法。特性鑒定物質(zhì)的方法。 屬光譜分析法。屬光譜分析法。二二 分光光度法分光光度法 2 2、特點(diǎn)：、特點(diǎn)：（1 1）定性分析）定性分析 定性鑒定定性鑒定 純度鑒定純度鑒定 結(jié)構(gòu)分

5、析結(jié)構(gòu)分析（2 2）定量分析）定量分析 l1l2入射光透過(guò)光入射光透過(guò)光l2 l1 ，i1 i2i0i1i0i2摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)：當(dāng)溶液層厚度單位為：當(dāng)溶液層厚度單位為cm，濃度單位為，濃度單位為mol/l時(shí)，時(shí)，k即成為摩爾吸光系數(shù)即成為摩爾吸光系數(shù)光源單色器樣品室檢測(cè)器顯示 在整個(gè)紫外光區(qū)或可見(jiàn)光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具在整個(gè)紫外光區(qū)或可見(jiàn)光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。 可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈作可見(jiàn)光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長(zhǎng)范為光源，其輻射波長(zhǎng)范圍在圍在3203202500 nm2500 nm。

6、 紫外區(qū)：氫、氘燈。紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射發(fā)射185185400 nm400 nm的連的連續(xù)光譜。續(xù)光譜。 將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。 入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器； 準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵棱鏡或光柵； 聚焦裝置：透鏡或聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至后所得單色光聚焦至出

7、射狹縫；出射狹縫； 出射狹縫。出射狹縫。 樣品室放置各種類(lèi)型的吸收池樣品室放置各種類(lèi)型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見(jiàn)區(qū)一在紫外區(qū)須采用石英池，可見(jiàn)區(qū)一般用玻璃池。般用玻璃池。 利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)，常用的光信號(hào)變成可測(cè)的電信號(hào)，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。有光電池、光電管或光電倍增管。 檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行檢流計(jì)、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理儀器自動(dòng)控制和結(jié)果處理 簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處

8、測(cè)量吸光度或透光度，簡(jiǎn)單，價(jià)廉，適于在給定波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測(cè)器具有很高的穩(wěn)定性。的穩(wěn)定性。 自動(dòng)記錄，快速全波自動(dòng)記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測(cè)器靈敏度變化等定、檢測(cè)器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價(jià)格較高。格較高。 將不同波長(zhǎng)的兩束單色光將不同波長(zhǎng)的兩束單色光( (1 1、2 2) ) 快束交替通過(guò)同快束交替通過(guò)同一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交流信號(hào)。無(wú)需參比池。一吸收池而后到達(dá)檢測(cè)器。產(chǎn)生交

9、流信號(hào)。無(wú)需參比池。 = =1 12nm2nm。兩波長(zhǎng)同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。兩波長(zhǎng)同時(shí)掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。 可見(jiàn)分光光度計(jì) 紫外紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)分光光度計(jì) beckman 紫外紫外-可見(jiàn)可見(jiàn)分光光度計(jì)分光光度計(jì)eppendorf 紫外紫外-可見(jiàn)可見(jiàn)分光光度計(jì)分光光度計(jì)以以721-a721-a型分光光度計(jì)為例，其基本的操作步驟為：型分光光度計(jì)為例，其基本的操作步驟為：1.1.開(kāi)開(kāi)721-a721-a分光光度計(jì)的開(kāi)關(guān)，將比色池的蓋子打開(kāi)，通電分光光度計(jì)的開(kāi)關(guān)，將比色池的蓋子打開(kāi)，通電2020分鐘使儀分鐘使儀器預(yù)熱。器預(yù)熱。2.2.將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。3.3.將

10、空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。4.4.將開(kāi)關(guān)置于將開(kāi)關(guān)置于t t位，打開(kāi)比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)位，打開(kāi)比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)t t為為0.0,0.0,關(guān)上關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)比色池蓋子，調(diào)節(jié)t t為為100.0100.0。5.5.將開(kāi)關(guān)置于將開(kāi)關(guān)置于a a，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)a a為為0.00.06.6.重復(fù)步驟重復(fù)步驟4 4和和5 57.7.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路，測(cè)量溶液的吸光度（將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路，測(cè)量溶液的吸光度（a a） 鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的

11、吸鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸光度。在光度。在25，將，將4mg鉻酸鉀溶于鉻酸鉀溶于100ml的的0.05mol/l koh中，放入比色池中，在不同波長(zhǎng)中，放入比色池中，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度行比較，可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度。 1.開(kāi)啟電源，指示燈亮，儀器預(yù)熱10分鐘，選擇開(kāi)關(guān)置于“t” 。2.打開(kāi)試樣室蓋（光門(mén)自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)“0%t”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。 3.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。 4.旋動(dòng)波長(zhǎng)手輪，把測(cè)試所需的波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至刻度線處。 6.將參比溶液比色皿置

12、于光路中，將選擇開(kāi)關(guān)置于a，旋動(dòng)吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為.000，然后移入被測(cè)溶液，顯示值即為試樣的吸光度a值。 8全部測(cè)定結(jié)束后，取出比色皿(洗凈)，關(guān)閉開(kāi)關(guān).三、分光光度技術(shù)的定性和定量方法三、分光光度技術(shù)的定性和定量方法u定性依據(jù)：定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)maxmax和摩爾吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù) 2.2.摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)方法方法1.1.最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)maxmax方法方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法 將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過(guò)程將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過(guò)程顯色后，分別測(cè)吸光度顯色后，分別測(cè)吸光度(a)(a)，以，以a a為縱坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)

13、，濃度為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線( (至少要至少要5 5點(diǎn)點(diǎn)) )。在相同條件。在相同條件下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對(duì)應(yīng)的濃度線找出相對(duì)應(yīng)的濃度u方法：方法：axcxa（吸光度）（吸光度）c（濃度）（濃度）u制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：（1 1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng) 重新繪制。重新繪制。（2 2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3 3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超

14、過(guò)線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再 測(cè)定。測(cè)定。（4 4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。2比較法 c cx x=(a=(ax xc cs s)/a)/as s 己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為： 其中其中cxcx和和axax為標(biāo)本

15、管濃度和吸光度，為標(biāo)本管濃度和吸光度，cscs和和asas分別為標(biāo)準(zhǔn)分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。和標(biāo)本管濃度相近。 3其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。摩爾吸光系數(shù)分析等方法。四、其它光譜分析技術(shù)四、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 （三）熒光光度分析法（三）熒光光度分析法1 1基本原理基本原理 2 2組成組成1 1基本原理基本原理 2 2組成組成 3 3原

16、子吸收分光光度法的特點(diǎn)原子吸收分光光度法的特點(diǎn) 3 3熒光光度定量分析法熒光光度定量分析法 4 4 熒光光度分析技術(shù)的應(yīng)用熒光光度分析技術(shù)的應(yīng)用 1 1基本原理基本原理 2 2影響熒光強(qiáng)度的因素影響熒光強(qiáng)度的因素火焰光度法火焰光度法等離子體發(fā)射光譜法等離子體發(fā)射光譜法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法熒光光度法熒光光度法nanodrop nd-3300 fluorospectrometer n電化學(xué)分析方法基本原理電化學(xué)分析方法基本原理n離子選擇電極分類(lèi)離子選擇電極分類(lèi)n離子選擇電極的分析方法離子選擇電極的分析方法 電化學(xué)分析方法電化學(xué)分析方法電位分析法：測(cè)定原電池電動(dòng)勢(shì)以求物質(zhì)含量的分析方

17、法電位分析法：測(cè)定原電池電動(dòng)勢(shì)以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過(guò)電阻測(cè)定以求物質(zhì)含量的分析方法電導(dǎo)法：通過(guò)電阻測(cè)定以求物質(zhì)含量的分析方法電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點(diǎn)的指示電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點(diǎn)的指示一、電化學(xué)分析方法基本原理一、電化學(xué)分析方法基本原理電池電動(dòng)勢(shì)和電極電勢(shì)電池電動(dòng)勢(shì)和電極電勢(shì)電池電動(dòng)勢(shì)：電池電動(dòng)勢(shì)：將電位差計(jì)接在電池的兩個(gè)電極之間而直將電位差計(jì)接在電池的兩個(gè)電極之間而直接測(cè)得的電勢(shì)值習(xí)慣上稱(chēng)之為電池的電動(dòng)勢(shì)接測(cè)得的電勢(shì)值習(xí)慣上稱(chēng)之為電池的電動(dòng)勢(shì)電極電勢(shì)：電極電勢(shì)：當(dāng)采用相對(duì)電勢(shì)法時(shí)，系用一定的參比電極當(dāng)采用相對(duì)電勢(shì)法時(shí)，系用一定的參比電極

18、與研究電極組成電池，與研究電極組成電池， 這一電池的電動(dòng)勢(shì)稱(chēng)為相對(duì)于給定參比這一電池的電動(dòng)勢(shì)稱(chēng)為相對(duì)于給定參比電極而確定的研究電極電勢(shì)。電極而確定的研究電極電勢(shì)。( (金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即為金屬電極和溶液間的電極電勢(shì)為金屬電極和溶液間的電極電勢(shì)) )the absolute potential differenceacross a single electrified interface cannot be measured!it is not necessary to know exact value of it but the difference of

19、 absolute potential difference isimportant for electrochemists!單個(gè)界面上的絕對(duì)電位單個(gè)界面上的絕對(duì)電位是不可測(cè)的，對(duì)于電化是不可測(cè)的，對(duì)于電化學(xué)研究重要的是其差值學(xué)研究重要的是其差值參比電極參比電極顧名思義，參比電極是給出一個(gè)固定的值，其它的電顧名思義，參比電極是給出一個(gè)固定的值，其它的電極電勢(shì)的測(cè)量以此為基礎(chǔ)。一個(gè)好的參比電極應(yīng)該不極電勢(shì)的測(cè)量以此為基礎(chǔ)。一個(gè)好的參比電極應(yīng)該不受溫度、時(shí)間和通過(guò)小電流而變化受溫度、時(shí)間和通過(guò)小電流而變化, 應(yīng)遵守應(yīng)遵守nernst 方方程。程。指示電極指示電極指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指

20、示待測(cè)離子指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指示待測(cè)離子濃度。濃度。二二 離子選擇性電極離子選擇性電極1、定義：2、特點(diǎn)：3、測(cè)定原理：4、離子選擇性電極分類(lèi)按國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（按國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（iupaciupac）建議分類(lèi)）建議分類(lèi)5、離子選擇性電極的基本構(gòu)造（一）非晶膜電極（一）非晶膜電極玻璃電玻璃電極極1 玻璃電極的結(jié)構(gòu)三三 常用的離子選擇性電極常用的離子選擇性電極（2）玻璃電極及膜電位：試試phfrt303. 2k,a lgfrt303. 2khm3.玻璃電極的優(yōu)點(diǎn)（二）氣敏電極（二）氣敏電極該類(lèi)電極其實(shí)是一種復(fù)該類(lèi)電極其實(shí)是一種復(fù)合電極：將合電極：將 ph ph 玻璃電玻璃電極和指示電極插入中介極和指示電極插入中介液中，待測(cè)氣體通過(guò)氣液中，待測(cè)氣體通過(guò)氣體滲透膜與中介液反應(yīng)，體滲透膜與中介液反應(yīng)，并改變其并改變其 ph ph 值，從而值，從而可測(cè)得諸如可測(cè)得諸如coco2 2( (中介液中介液為為nahconahco3 3) )