大腸菌群測定ppt課件

1、1大腸菌群測定大腸菌群測定小組成員小組成員：蔡川川蔡川川 金思利金思利 杜夢嬌杜夢嬌 葉岳成葉岳成 鄭文龍鄭文龍2依據(jù)依據(jù)GB47893-2010，討論若進行，討論若進行食品中大腸菌群的測定，需準備好哪食品中大腸菌群的測定，需準備好哪些材料，且如何進行測定？些材料，且如何進行測定？討論的問題3大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，一般認為該菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，一般認為該菌群細菌可包括菌群細菌可包括大腸桿菌大腸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。、產氣克雷白氏菌和陰溝

2、腸桿菌等。大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌沙門氏

3、菌、志志賀氏菌賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。必須看作對人體健康具有潛在的危險性。大腸菌群的概述大腸菌群的概述4食品中查出大腸菌群超標5由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即需氧及兼性由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即需氧及兼性厭氧、在厭氧、在37能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。因此大腸菌群的檢能分解乳糖產酸產氣的革蘭

4、氏陰性無芽孢桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。測一般都是按照它的定義進行。中國采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制中國采用的進出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標準和原國家商檢局制定的行業(yè)標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。定的行業(yè)標準。兩個標準方法在檢測程序上略有不同。國家標準國家標準 國家標準采用三步法，即國家標準采用三步法，即乳糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)和和證實試驗證實試驗。乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽乳糖發(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。鹽發(fā)酵管。36

5、1培養(yǎng)培養(yǎng)482h，觀察是否產氣。，觀察是否產氣。分離培養(yǎng)：將產氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，分離培養(yǎng)：將產氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，361培養(yǎng)培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。，觀察菌落形態(tài)。證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管酵管361培養(yǎng)培養(yǎng)242h，觀察產氣情況。，觀察產氣情況。報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN最大可能數(shù)表，報告每最大可能數(shù)表，報告每100mL（g）大腸菌群的）大腸菌群的MPN值。具體操作參見值。具體

6、操作參見GB4789.394 中華人民共和中華人民共和國國家標準國國家標準 食品衛(wèi)生微生物學檢驗食品衛(wèi)生微生物學檢驗 大腸菌群測定大腸菌群測定檢驗方法檢驗方法6原國家商檢局制定的行業(yè)標準原國家商檢局制定的行業(yè)標準原國家商檢局制定的行業(yè)標準采用美國原國家商檢局制定的行業(yè)標準采用美國FDA的標準方法，用于對出口的標準方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進行檢測。食品中的大腸桿菌進行檢測。推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管推測試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉肉湯。湯。361培養(yǎng)培養(yǎng)482h，觀察是否產氣。，觀察是否產氣。證實試驗：將產氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳

7、糖膽鹽（證實試驗：將產氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，）肉湯管中，361培養(yǎng)培養(yǎng)482h，觀察是否產氣。以，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查產氣為陽性。查MPN表，報表，報告告1mL(g)樣品中大腸菌群的樣品中大腸菌群的MPN值。值。具體操作參見具體操作參見 SN016992 中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準準 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法檢驗流程檢驗流程7 大腸菌群的測定的原理v大腸菌群大腸菌群之一群能在37經24h能發(fā)酵乳糖，產生氣體，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無

8、芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間結指出食品是否有腸道致病菌污染的可能。v 三步法：（1）發(fā)酵乳糖，產氣產酸發(fā)酵試驗；（2）初發(fā)酵陽性管通過伊紅美蘭平板進行分離；（3）復發(fā)酵對分離菌做證實實驗。 v食品中大腸菌群數(shù)系以每100g（或100ml）檢樣內大腸菌群最近數(shù)(the most probable number 簡稱MPN)表示。最近數(shù)MPN法是一種將樣品“多次（管）稀釋至無菌”的計數(shù)方法。將3個稀釋梯度的待檢驗樣品稀釋液接種于9支或15支試管培養(yǎng)基中，每個稀釋梯度試液接種3或5支。經過培養(yǎng)后

9、，根據(jù)結果查閱MPN檢索表，就可以得到原樣品中微生物的估計數(shù)量。MPN檢測方法尤其適用于帶菌量、其他方法不能檢測的食品，如水、乳制品及其其他食品中大腸菌群的計數(shù)。8材料3.1食品樣品食品樣品：乳、肉、果汁、糕點、發(fā)酵調味品及其他食品。乳、肉、果汁、糕點、發(fā)酵調味品及其他食品。3.2 菌種菌種 陽性對照菌陽性對照菌大腸桿菌大腸桿菌 3.3除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備設備和材料如下：和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、 均質器、振蕩器、無菌吸管或微量移液均質器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿

10、、菌落計數(shù)器等。器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器等。3.43.4培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST LST ）肉湯、）肉湯、 煌綠乳煌綠乳糖膽鹽（糖膽鹽（BGLB BGLB ）肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（）肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ) VRBA ) 、無菌生、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L1mol/L氫氧化鈉（氫氧化鈉（NaOH ) NaOH ) 、 1mol/L 1mol/L 鹽酸鹽酸（HCI ) HCI ) 。 9第一法大腸菌群第一法大腸菌群MPN 計數(shù)計數(shù) 操作步驟操作步驟 6.1、樣品的

11、稀釋、樣品的稀釋6.1.1、 固體和半固體樣品固體和半固體樣品：稱取稱取25g 樣品，放人盛有樣品，放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，的無菌均質杯內，8 00or/min-10 000r/min 均質均質1 min-2 min ，或放人盛有，或放人盛有225ml磷酸磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min-2 min ，制成，制成1:10 的樣品勻液。的樣品勻液。6.1.2、 液體樣品液體樣品：以無菌吸管吸取以無菌吸管吸取25ml樣品，置盛有樣品，置盛有225ml磷酸鹽緩沖

12、液或生理鹽水磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10 的樣品勻的樣品勻液。液。6.1.3、 樣品勻液的樣品勻液的pH 值應在值應在6.5-7.5 之間之間，必要時分別用，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（氫氧化鈉（NaOH ）或或1 mol/L 鹽酸（鹽酸（HCI ）調節(jié)。）調節(jié)。6.1.4、 用用1ml無菌吸管或微量移液器吸取無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液樣品勻液1ml，沿管壁緩緩注人，沿管壁緩緩注人9ml磷酸磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不

13、要觸及稀釋液面），振搖鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用試管或換用1 支支1ml無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。的樣品勻液。106.1.5、 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10 倍遞增系列稀倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用次，換用1 支支1ml無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。6.2、

14、 初發(fā)酵試驗初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇每個樣品，選擇3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種）肉湯，每管接種1ml（如（如接種量超過接種量超過1ml，則用雙料，則用雙料LST肉湯）肉湯）, 361 培養(yǎng)培養(yǎng)24hZh ，觀察倒管內，觀察倒管內是否有氣泡產生，如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至是否有氣泡產生，如未產氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h 。記錄在。記錄在24h 和和48h 內產氣內產氣的的LST 肉湯管數(shù)。未產氣者為大腸菌群陰性，產氣者則

15、進行復發(fā)酵試驗。肉湯管數(shù)。未產氣者為大腸菌群陰性，產氣者則進行復發(fā)酵試驗。6.3、 復發(fā)酵試驗復發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有用接種環(huán)從所有48h2h 內發(fā)酵產氣的內發(fā)酵產氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽于煌綠乳糖膽鹽( BGLB）肉湯管中，）肉湯管中，361 培養(yǎng)培養(yǎng)48h2h ，觀察產氣情，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。6.4、 大腸菌群最可能數(shù)（大腸菌群最可能數(shù)（MPN ）的報告）的報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN 表（見附錄表（見附錄B ) ，報告每克（或毫升）樣品，報

16、告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的中大腸菌群的MPN 值。值。 111213第二法大腸菌群平板計數(shù)第二法大腸菌群平板計數(shù)8、 操作步驟操作步驟 8.1、 樣品的稀釋樣品的稀釋按按6.1 進行。進行。8.2、 平板計數(shù)平板計數(shù)8.2.1、 選取選取2 個個3 個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1ml。同時分別取。同時分別取1ml生理鹽水加人兩個無菌平皿作空白對照。生理鹽水加人兩個無菌平皿作空白對照。8.2.2、 及時將及時將15 mL-20ml冷至冷至46 的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）約傾注于）約

17、傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板，置于覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36l 培養(yǎng)培養(yǎng)18h-24h 。8.3、 平板菌落數(shù)的選擇平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在選取菌落數(shù)在30-150 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大?；蚋?。8.4、 證實試驗證實試驗從從VRBA 平板上挑取平板上挑取10 個不同