體外培養(yǎng)細胞的細胞生物學特點課堂PPT

1、優(yōu)秀精品課件文檔資料生物學特點生物學特點體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點總的：總的：與體內(nèi)仍有相似與體內(nèi)仍有相似- 體外培養(yǎng)的細胞體外培養(yǎng)的細胞仍存在細胞和細胞、仍存在細胞和細胞、 細胞和基質(zhì)的相互關系細胞和基質(zhì)的相互關系但有不同但有不同 相對相對孤立孤立、相對單一、相對單一 失去原有組織結(jié)構和細胞形態(tài)失去原有組織結(jié)構和細胞形態(tài) 分化減弱或不顯分化減弱或不顯 體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點 與體內(nèi)仍有相似與體內(nèi)仍有相似-體外培養(yǎng)的細胞體外培養(yǎng)的細胞 仍存在仍存在細胞和細胞細胞和細胞、細胞和基質(zhì)細胞和基質(zhì) 的的相互關系相互關系 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 單個細胞

2、也能生存和增殖單個細胞也能生存和增殖 但但單個細胞不是細胞永久存在單個細胞不是細胞永久存在的形式的形式, 培養(yǎng)的培養(yǎng)的細胞之間細胞之間仍有在仍有在形態(tài)形態(tài)和和機能上機能上的的 相互依存關系相互依存關系 1.培養(yǎng)的培養(yǎng)的細胞之間細胞之間 仍有在形態(tài)和機能上的仍有在形態(tài)和機能上的相互依存關系相互依存關系。 在在結(jié)構上結(jié)構上，如：，如： 上皮細胞仍見有橋粒上皮細胞仍見有橋粒 在在生理活動上生理活動上， 單個細胞雖能生長繁殖單個細胞雖能生長繁殖, 但但不如群體細胞能力強不如群體細胞能力強， 當相鄰細胞接觸，便導致運動停止當相鄰細胞接觸，便導致運動停止 細胞相互溝通生物信息細胞相互溝通生物信息的結(jié)果的結(jié)

3、果 2.培養(yǎng)的細胞和培養(yǎng)的細胞和基質(zhì)之間基質(zhì)之間 對細胞外基質(zhì)仍有依存性對細胞外基質(zhì)仍有依存性 但有不同但有不同 人工所模擬的條件人工所模擬的條件與與體內(nèi)體內(nèi)實際情況實際情況 仍仍不完全不完全 相同相同 當細胞被置于當細胞被置于體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)后后 久了久了,必然必然發(fā)生變化發(fā)生變化與體內(nèi)主要不同與體內(nèi)主要不同 相對相對孤立孤立、相對單一、相對單一 缺乏體內(nèi)的缺乏體內(nèi)的一些一些影響影響 主要表現(xiàn)主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構和細胞形態(tài)失去原有組織結(jié)構和細胞形態(tài) 如：肌肉細胞如：肌肉細胞纖維化纖維化 分化減弱或不顯分化減弱或不顯 出現(xiàn)類似出現(xiàn)類似“返祖返祖”現(xiàn)象：細胞趨向單一化現(xiàn)象：細胞趨向單一化

4、或獲得不死性或獲得不死性 或變成具有惡性性狀的細胞群或變成具有惡性性狀的細胞群 因此因此要正確認識要正確認識體外培養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)細胞 是一種特定條件下生長的細胞群體是一種特定條件下生長的細胞群體培養(yǎng)細胞培養(yǎng)細胞的主要的生物學特點 1.去分化去分化2. 貼壁和鋪展貼壁和鋪展3. 接觸抑制接觸抑制和和密度依賴性密度依賴性去分化去分化 體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點 體外培養(yǎng)生長生物學特征具有體外培養(yǎng)生長生物學特征具有兩重性兩重性 基本生物學特征基本生物學特征 仍仍與體內(nèi)的細胞相似與體內(nèi)的細胞相似 培養(yǎng)物培養(yǎng)物在體外在體外條件下生長，條件下生長， 許多生長生物學行為許多生長生物

5、學行為發(fā)生改變發(fā)生改變 培養(yǎng)細胞分化狀態(tài)的變化培養(yǎng)細胞分化狀態(tài)的變化 體內(nèi)體內(nèi)細胞細胞-三方面三方面的影響與調(diào)節(jié)的影響與調(diào)節(jié): 體外環(huán)境體外環(huán)境的影響的影響 體內(nèi)神經(jīng)體內(nèi)神經(jīng)體液因素體液因素 的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 細胞與局部微環(huán)境細胞與局部微環(huán)境的相互作用的相互作用 控制控制- 維持著細胞的維持著細胞的分化特征分化特征。體外體外培養(yǎng)時，培養(yǎng)時， 失去了失去了- 分化特征分化特征逐漸逐漸減弱減弱 去分化去分化(脫分化):各種分化細胞，逐漸各種分化細胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能失去各自的形態(tài)與功能“個性個性”，表現(xiàn)出某，表現(xiàn)出某種種趨同性趨同性 如如: 培養(yǎng)的培養(yǎng)的成纖維細胞成纖維細胞 在在適當刺激適當刺

6、激下，可下，可分化分化為為 其它結(jié)締組織細胞其它結(jié)締組織細胞和和肌組織細胞肌組織細胞， 表現(xiàn)出表現(xiàn)出類似未分化類似未分化的間充質(zhì)細胞的特性，的間充質(zhì)細胞的特性，返祖返祖 有有2點點 1.但但,去分化去分化并不并不意味著意味著完全返回完全返回胚胎時期的原始細胞狀態(tài)胚胎時期的原始細胞狀態(tài)如如:高度分化高度分化的的神經(jīng)細胞神經(jīng)細胞和和心肌細胞心肌細胞 已經(jīng)喪失的已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復增生活性不可能恢復 但已經(jīng)具備的但已經(jīng)具備的生物電活動特性生物電活動特性 不會完全失去不會完全失去 2. 可可重新表現(xiàn)重新表現(xiàn)出出分化特點分化特點 如：如：把把表皮細胞表皮細胞放在放在氣液界面上氣液界面上培養(yǎng)，可培

7、養(yǎng)，可分化分化成成 含大量角蛋白絲的含大量角蛋白絲的角質(zhì)細胞角質(zhì)細胞 內(nèi)皮細胞內(nèi)皮細胞-但，這種但，這種能力能力會會隨著培養(yǎng)時間延長隨著培養(yǎng)時間延長 逐漸喪失逐漸喪失總之，休外培養(yǎng)總之，休外培養(yǎng),使細胞使細胞 結(jié)構結(jié)構與與功能上功能上的的“可塑性可塑性”增大增大 防止去分化防止去分化貼附和鋪展貼附和鋪展貼附貼附(粘附粘附)和附著和附著 粘附粘附于固相表面是錨定依賴性細胞于固相表面是錨定依賴性細胞生命活動的基本要求生命活動的基本要求細胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后細胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后首先要發(fā)生粘附首先要發(fā)生粘附(adherence)， 是細胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步是細胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步

8、.細胞懸液后細胞懸液后 耽擱得越久，越容易發(fā)生退化耽擱得越久，越容易發(fā)生退化提供什么樣的提供什么樣的生長表面生長表面 是是細胞能否成功粘附的主要因素細胞能否成功粘附的主要因素。 不同細胞不同細胞的的粘附能力不同粘附能力不同 如如巨噬細胞、成纖維細胞巨噬細胞、成纖維細胞等等粘附能力強粘附能力強 能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面 如如神經(jīng)元細胞、羊水細胞，粘附能力弱神經(jīng)元細胞、羊水細胞，粘附能力弱 需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面 粘附能力強的細胞粘附能力強的細胞- 粘附能力弱的細胞粘附能力弱的細胞- 可可

9、利用利用此特點（粘附：快、牢；慢、弱）此特點（粘附：快、牢；慢、弱） 分離分離、純化細胞純化細胞 細胞形態(tài)細胞形態(tài)因因是否貼附于底物是否貼附于底物而而不同不同懸浮懸浮的細胞的細胞: 基本基本圓形圓形粘附粘附和貼壁的細胞和貼壁的細胞: 扁平圓形扁平圓形 相差顯微鏡相差顯微鏡 “亮圈亮圈” 很快很快過渡過渡-貼附過程貼附過程 ：3步步貼附因子粘附貼附因子粘附細胞開始附著細胞開始附著細胞進一步細胞進一步牢固附著牢固附著伸展伸展影響因素影響因素 各種細胞不同各種細胞不同 如接種如接種30后后第二瓶第二瓶30 (附著最強附著最強)巨噬細胞一成纖維細胞巨噬細胞一成纖維細胞 上皮細胞上皮細胞血細胞血細胞(最

10、弱最弱) 生物因素生物因素 血清、培養(yǎng)液中的促附著因子血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機械機械，物理等物理等其他因素因素其他因素因素 離心：促進附著離心：促進附著 流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著 低溫：可抑制附著低溫：可抑制附著措施措施（因素）（因素）1.包被包被對對分化程度高、生長能力差分化程度高、生長能力差的細胞的細胞 可在可在培養(yǎng)瓶皿表面包被培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細胞粘附和有利于細胞粘附和 生長的生長的生物活性物質(zhì)生物活性物質(zhì) 如如:- 通過其所帶電荷先吸附通過其所帶電荷先吸附-, 培養(yǎng)的細胞再與其結(jié)培養(yǎng)的細胞再與其結(jié)合。合。 血清內(nèi)血清內(nèi)含有多種能夠含有多種能

11、夠 促進細胞粘附促進細胞粘附的的成分成分 細胞細胞本身也可能本身也可能產(chǎn)生產(chǎn)生一些一些粘附分子粘附分子 措施措施2.減少接種減少接種時細胞懸液的時細胞懸液的量量待細胞粘附和貼壁之后，再補充足夠的培養(yǎng)液待細胞粘附和貼壁之后，再補充足夠的培養(yǎng)液3.減少減少培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中血清的含量血清的含量 使培養(yǎng)液使培養(yǎng)液黏度降低黏度降低4.培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中離子成分及其濃度離子成分及其濃度 如，培養(yǎng)液中的如，培養(yǎng)液中的ca含量過低時不利于含量過低時不利于 細胞的粘附、貼壁和鋪展細胞的粘附、貼壁和鋪展5.培養(yǎng)液的溫度培養(yǎng)液的溫度 低溫會減低細胞的活動，妨礙黏附和貼壁低溫會減低細胞的活動，妨礙黏附和貼壁 促進細胞粘

12、附的成分促進細胞粘附的成分鋪展鋪展 鋪展鋪展（伸展）（伸展） (spread) 進行進行生命活動生命活動的一種的一種基本的生長特點基本的生長特點或生長行為或生長行為 鋪展狀況制約鋪展狀況制約細胞的細胞的分裂增殖分裂增殖活動活動過程過程，細胞先由圓形變?yōu)?，細胞先由圓形變?yōu)?圓餅形圓餅形(放射狀鋪展細胞放射狀鋪展細胞) 逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細胞逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細胞 極性細胞極性細胞就是各種有機體細胞就是各種有機體細胞 在體外在體外的的特征性特征性 細胞形態(tài)細胞形態(tài)鋪展狀況鋪展狀況 是調(diào)節(jié)細胞形狀的主要方面是調(diào)節(jié)細胞形狀的主要方面 鋪展得越好，細胞越扁鋪展得越好，細胞越扁 意味著細胞

13、與生長基質(zhì)表面接觸面越大意味著細胞與生長基質(zhì)表面接觸面越大鋪展狀況鋪展狀況 與與細胞的生長細胞的生長有密切關系有密切關系 只有當只有當細胞鋪展細胞鋪展到到合適合適的的程度程度 dna合成合成才開始才開始進行進行 通過比較貼壁依賴性細胞通過比較貼壁依賴性細胞 不同鋪展程度與不同鋪展程度與dna合成率之間的關系合成率之間的關系 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)細胞越扁細胞越扁(厚度越小厚度越小) dna合成率越高合成率越高 細胞形狀細胞形狀(伸展伸展) 與細胞的生長與細胞的生長 合適的合適的細胞細胞形狀形狀-伸展伸展 對正常細胞的對正常細胞的dna合成合成重要重要 對其對其生長生長重要重要 伸展的意義伸展的意義實驗一實驗

14、一 成纖維細胞成纖維細胞1. 附著附著于玻璃或塑料底物于玻璃或塑料底物: 細胞增殖細胞增殖2. 懸浮懸浮培養(yǎng)培養(yǎng): 細胞細胞不增殖不增殖3. a. 培養(yǎng)在培養(yǎng)在懸浮的玻璃纖維懸浮的玻璃纖維上上: 若若夠長夠長: 細胞可細胞可增殖增殖 若若短短于于20um, 細胞可附著細胞可附著, 但增殖很慢但增殖很慢 或或不增殖不增殖 b. 在在某些塑料某些塑料上上: 有些細胞可附著有些細胞可附著, 但但增殖很慢增殖很慢或不增殖或不增殖 伸展的意義伸展的意義原因原因分析分析在在1. 附著附著培養(yǎng)物上培養(yǎng)物上: 細胞很扁平細胞很扁平, 很伸展很伸展在在2. 懸浮懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)中: 細胞圓球形細胞圓球形, 未伸展

15、未伸展在在3. 培養(yǎng)中培養(yǎng)中: 細胞維持介于細胞維持介于扁平與圓球之間扁平與圓球之間因此因此, 細胞形狀細胞形狀, 至關重要至關重要伸展伸展至至原來的形態(tài)原來的形態(tài), 才能才能增殖增殖 伸展的意義伸展的意義-實驗伸展的意義伸展的意義-實驗二實驗二 polyhema 35-0.0035 um 高濃度（厚）高濃度（厚） 低濃度低濃度（?。ū。┘毎毎?圓圓 扁扁 （附著最差）（附著最差）獲得細胞構型（模型）獲得細胞構型（模型） 不同伸展程度的細胞不同伸展程度的細胞polyhema 細胞細胞厚厚 厚厚（2122 um）（伸展差伸展差）（10+-2）薄薄 薄?。? um） （伸展好伸展好）（46+-

16、13） polyhema cell height (um) h3 (c.p.m). 1.00 22 7+-5 4 x 10-2 15 50+-5 4 x 10-3 6 250+-15 細胞細胞懸浮懸浮在培養(yǎng)液中時，近似在培養(yǎng)液中時，近似球體球體形狀形狀 當當接觸堅硬平面接觸堅硬平面 即即鋪展于底物上鋪展于底物上，扁平狀扁平狀 與底物形成很多接觸點與底物形成很多接觸點 伸展過程伸展過程(1)開始開始階段階段 開始附著鋪開開始附著鋪開 細胞細胞附著于底物附著于底物 球形的細胞，下方表面與底物接觸成扁球形的細胞，下方表面與底物接觸成扁 但尚未形成新的偽足但尚未形成新的偽足 伸展分幾個階段伸展分幾個階

17、段(2) 放射狀鋪展放射狀鋪展階段階段在球形細胞體的在球形細胞體的周圍周圍形成很多形成很多偽足隆起偽足隆起偽足形狀偽足形狀 主要主要 柱形絲狀柱形絲狀: 直徑直徑0.2-0.5um 長長10-20 扁平片狀扁平片狀: 厚厚0.1-0.5 寬寬2-5 尚有尚有: 小泡狀葉狀小泡狀葉狀: 直徑直徑1-2 開始時開始時: 絲狀多絲狀多 以后以后 片狀增加片狀增加 許多許多偽足偽足 形成薄的形成薄的胞質(zhì)小片牢固貼于底物胞質(zhì)小片牢固貼于底物 胞體胞體中央部分中央部分 扁扁 整亇整亇細胞扁平細胞扁平(3) 極化階段極化階段細胞細胞最后最后伸展伸展附著的情況附著的情況 實驗：用多種細胞，實驗：用多種細胞，

18、以顯微操作及縮時電影以顯微操作及縮時電影 定位細胞附著于玻璃和聚苯乙烯情況定位細胞附著于玻璃和聚苯乙烯情況 檢測檢測-顯微針頭顯微針頭 結(jié)果：附著結(jié)果：附著規(guī)律規(guī)律附著點附著點： 附著附著規(guī)律規(guī)律幾乎幾乎未見于細胞的中央?yún)^(qū)未見于細胞的中央?yún)^(qū) (如不在核之下如不在核之下) 總在邊緣總在邊緣，邊緣邊緣”擺動擺動”活動的部位活動的部位 凸的邊緣凸的邊緣 在薄的邊緣在薄的邊緣 附著區(qū)：附著區(qū)： 約為細胞下面表面的約為細胞下面表面的15-35附著、伸展的條件附著、伸展的條件底物底物 細胞能在很多固體表面附著細胞能在很多固體表面附著 最終鋪展的程度，取決于底物的性質(zhì)最終鋪展的程度，取決于底物的性質(zhì)影響因素

19、影響因素： 活性物質(zhì)活性物質(zhì)(貼附貼附、伸展因子伸展因子):血清、培養(yǎng)液中，血清、培養(yǎng)液中， 或細胞分泌的生物活性物質(zhì)被底物吸附后可利于細胞的鋪展或細胞分泌的生物活性物質(zhì)被底物吸附后可利于細胞的鋪展 細胞借助這些分子細胞借助這些分子,可附著于各種可附著于各種”非特異性非特異性”的底物上的底物上 如如fn，膠原，聚賴氨酸，膠原，聚賴氨酸 機械機械，物理因素物理因素 接觸抑制接觸抑制和和密度依賴性密度依賴性接觸抑制接觸抑制和密度依賴性生長仰制密度依賴性生長仰制 運動的接觸抑制運動的接觸抑制密度依賴性生長仰制密度依賴性生長仰制增殖的密度抑制增殖的密度抑制實驗實驗方 法方 法 ： 3 t 3 細 胞 ， 接 種細 胞 ， 接 種 1 05于于 6 c m 培 養(yǎng) 皿 ，培 養(yǎng) 皿 ， 5d細胞計數(shù)細胞計數(shù) 于 加 入于 加 入 1 0 、 2 0 、 3 0 牛 血 清 的牛 血 清 的 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中，結(jié)果結(jié)果： 增殖的密