第五章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與生物反應(yīng)器OK

1、將克隆的外源基因注射到一個(gè)受精卵的細(xì)胞核中；將克隆的外源基因注射到一個(gè)受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長(zhǎng)為后代，其中的部分后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn)移植后的受精卵發(fā)育生長(zhǎng)為后代，其中的部分后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn) 入的外源基因；入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物作為種畜或種禽，培育新的純合系。利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物作為種畜或種禽，培育新的純合系。 將特定的目的基因從某一生物體分離出來，進(jìn)行擴(kuò)增和將特定的目的基因從某一生物體分離出來，進(jìn)行擴(kuò)增和加工，再導(dǎo)入另一動(dòng)物的早

2、期胚胎細(xì)胞中，使其整合到宿主動(dòng)加工，再導(dǎo)入另一動(dòng)物的早期胚胎細(xì)胞中，使其整合到宿主動(dòng)物的染色體上，在動(dòng)物的發(fā)育過程中表達(dá)，并通過生殖細(xì)胞傳物的染色體上，在動(dòng)物的發(fā)育過程中表達(dá)，并通過生殖細(xì)胞傳給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導(dǎo)入外源基因的動(dòng)物給后代。這種在基因組中穩(wěn)定整合有人工導(dǎo)入外源基因的動(dòng)物稱為稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenetic animal）。）。外源目的基因的制備外源目的基因的制備外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇獲得攜有目的基因的細(xì)胞選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)

3、和宿主動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系第一節(jié)第一節(jié) 目的基因的制備目的基因的制備一、目的基因的來源一、目的基因的來源 采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因； 通過通過mRNA合成合成cDNA； 人工合成的人工合成的DNA片段；片段； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段。）擴(kuò)增特定基因片段。二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆 通過載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺⊥ㄟ^載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺∵x擇載體目的基因與載體的連接重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 通過通過PCR反應(yīng)克隆目的基因反

4、應(yīng)克隆目的基因三、目的基因的轉(zhuǎn)移三、目的基因的轉(zhuǎn)移u電穿孔法電穿孔法u顯微注射法顯微注射法u裸露裸露DNA直接注射直接注射u磷酸鈣磷酸鈣DNA共沉淀法共沉淀法u脂質(zhì)載體包埋法脂質(zhì)載體包埋法u病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法電穿孔法實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移電穿孔法實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)磷酸鈣磷酸鈣DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)載體包埋法脂質(zhì)載體包埋法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法第二節(jié)第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法反轉(zhuǎn)錄病毒法反轉(zhuǎn)錄病毒法基因顯微注射法基因顯微注射法胚胎干細(xì)胞移植法胚胎干細(xì)胞移植法一、基因的顯微注射法一、基

5、因的顯微注射法何為顯微注射？何為顯微注射？ 顯微注射就是借助光學(xué)顯微鏡的放大作用，利用顯微操顯微注射就是借助光學(xué)顯微鏡的放大作用，利用顯微操作儀，直接把作儀，直接把DNA注射到動(dòng)物早期胚胎、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)注射到動(dòng)物早期胚胎、胚胎干細(xì)胞、體細(xì)胞或卵母細(xì)胞中，然后生產(chǎn)動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。經(jīng)過顯微注射胞或卵母細(xì)胞中，然后生產(chǎn)動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)。經(jīng)過顯微注射DNA發(fā)育而成的動(dòng)物中，有少數(shù)整合了被注射的發(fā)育而成的動(dòng)物中，有少數(shù)整合了被注射的DNA分子，分子，成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過激素療法使小鼠超數(shù)排卵，開始時(shí)注射雌性妊娠血清，48小時(shí)后再注 射人絨毛膜促進(jìn)腺激素，這時(shí)小鼠便會(huì)超數(shù)排卵，一般情況下

6、5-10個(gè)，超 數(shù)排卵為35個(gè)；與雄性小鼠交配，然后殺掉小鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi) ；將25-40個(gè)注射了轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入代孕小鼠體內(nèi) ；受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代 ；從小鼠子代體內(nèi)取出DNA樣品，進(jìn)行雜交，鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位 點(diǎn) ；子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達(dá) 。 DNADNA顯微注射法的基本程序顯微注射法的基本程序通過通過DNA顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠示圖顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠示圖（一）顯微注射（一）顯微注射DNA的制備與純化的制備與純化uDNA構(gòu)型和末端結(jié)構(gòu)u載體uDNA的長(zhǎng)度與濃度u

7、溶解DNA的緩沖液uDNA的純度（二）鼠的準(zhǔn)備與要求（二）鼠的準(zhǔn)備與要求轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)所用各類鼠轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)所用各類鼠（三）超排卵與取卵（三）超排卵與取卵孕馬血清（孕馬血清（PMS）其有效成分為卵泡刺激素（）其有效成分為卵泡刺激素（FSH）。）。人絨毛膜促性腺激素（人絨毛膜促性腺激素（hGG）雌鼠的排卵時(shí)間：PM10.0012.00雄鼠的排精時(shí)間：PM10.0012.00受精一般發(fā)生在：AM1.001 超排卵超排卵制定排卵程序：制定排卵程序：(1) 于第一日中午先向小鼠腹腔內(nèi)注入5一l 0單位的PMS；(2) 過48小時(shí)(第三天中午)腹腔內(nèi)注入510單位的人hCG(注射后1113 小時(shí) 后排卵)

8、；(3) 令雌雄動(dòng)物一對(duì)一的合籠交配；動(dòng)物半夜交尾，如未發(fā)生交配，兩周后可再 重用，但成功率下降；(4) 檢查陰栓(第四日晨)；檢查陰栓可判定是否受精；如已受精則出現(xiàn)陰栓。2 受精卵的收集受精卵的收集(1)檢查陰栓：有白色陰栓的小鼠可用，引頸處死動(dòng)物：(2)取輸卵管：剖開腹腔，取出輸卵管，置入含有3ml培養(yǎng)液的60mm直徑的瓶皿中；(3)取卵子；在20或50解剖鏡下找到輸卵管，在卵管膨大的壺腹部(于卵管開口近 處)隱約可見內(nèi)含的胚卵，把胚卵團(tuán)用尖攝輕輕壓擠出，用吸管移入含有400l分離 液的表玻皿中；(4)另準(zhǔn)備45個(gè)瓶皿，每皿內(nèi)均充有胚胎培養(yǎng)基400 l并覆蓋有厚8mm硅烷油或液 體石蠟層(

9、Fisher產(chǎn)，研究用)，硅烷油和石蠟巳預(yù)先在5%CO2中置371時(shí)做平衡 處理，覆硅烷油或石蠟層的目的是為防止培養(yǎng)液蒸發(fā)、散熱和pH改變；(5)向含卵團(tuán)表玻皿的分離液中加5 l新制備的透明質(zhì)酸酶(透明質(zhì)酸酶10mg1ml分 離液，Sigma產(chǎn))，把胚卵團(tuán)消化分散開；(6)當(dāng)卵團(tuán)散開后，立即把分散游離的卵細(xì)胞用吸管轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中，通過硅油層接 種入任一培養(yǎng)液小滴中)，以清除酶的繼續(xù)作用；(7)再依次通過皿內(nèi)其余培養(yǎng)液小滴，以繼續(xù)除掉酶和擺脫碎片(碎片能堵塞吸管口)， 此時(shí)的卵己可用作DNA注射之用。（四）（四） DNA顯微注射顯微注射 制備持卵管與注射針制備持卵管與注射針u 持卵管制備：持卵管

10、制備：在火焰燈上將微玻璃管拉成中間較細(xì)的約在火焰燈上將微玻璃管拉成中間較細(xì)的約510cm長(zhǎng)的長(zhǎng)的一段，其口徑約一段，其口徑約80120 m，用玻璃刀將其在離頸部，用玻璃刀將其在離頸部2cm處切斷，再處切斷，再把切口燒成如圖形狀，口徑約把切口燒成如圖形狀，口徑約15 m。將尖部移近火焰噴燈略加熱，。將尖部移近火焰噴燈略加熱，用鑷子輕觸尖部適宜位置，使變成如圖所示角度。用鑷子輕觸尖部適宜位置，使變成如圖所示角度。u 注射針的制備：注射針的制備：由拉針器制成，針的口徑應(yīng)低于由拉針器制成，針的口徑應(yīng)低于1 m。（1）硅烷油注入：取培養(yǎng)皿或表玻皿，注入已經(jīng)過平衡處理過的液體硅烷油或石蠟 （厚約5mm）；

11、（2）加培養(yǎng)基：通過硅烷油或石蠟層向培養(yǎng)皿底接種培養(yǎng)液，以100l為單元的小滴 數(shù)個(gè)，各滴間相距1一2cm(視小滴多少而定)；（3）胚卵接種：吸取待受注射胚卵數(shù)個(gè)，通過油層分別接種入培養(yǎng)液小滴中；（4）DNA準(zhǔn)備：從Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥， 重懸于注射緩沖液中(含1mgDNAml)，使其最終濃度為：0.050.5mg/ml；（5）于臨注射前把DNA樣品在Eppendorf 管中再離心一次(1200rpm，10分鐘)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口；（6）把待注射用的DNA裝入注射管中；2 DNA注射注射（7）在顯微鏡下把支持吸管轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液小滴

12、中，選一健康胚卵；先吸少量培養(yǎng) 液， 僅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持負(fù)壓狀態(tài)下吸住胚卵，繼 之把支持管調(diào)至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；（8）調(diào)注射針至胚卵近處，先調(diào)顯微鏡焦點(diǎn)看清針尖，然后通過透明帶刺入胚卵 細(xì)胞膜內(nèi)(小鼠胚卵直徑約10m)，進(jìn)而繼續(xù)進(jìn)針再刺入任一原核內(nèi)（雄性原 核多位于周邊部，體積較大，為主要注射對(duì)象）。注射針刺入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行注 射時(shí)，如細(xì)胞核微微發(fā)生膨脹，證明DNA已被注入，反之需重新進(jìn)行注射； 注射細(xì)胞數(shù)量越多越好； （9）用支持吸管把已注射細(xì)胞移入另一培養(yǎng)小滴中，使之與未注射細(xì)胞分開；待 注射結(jié)束后，把所有細(xì)胞均移入培養(yǎng)液中，置入溫箱培養(yǎng)30分種；（10）鏡下觀察

13、細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有溶解死亡崩潰者棄掉。（五）體內(nèi)接種（五）體內(nèi)接種（1）在手術(shù)前夜令受體母鼠與已結(jié)扎輸精管雄性小鼠合籠，次日晨取出雌鼠備用；（2）取注射吸管兩支，分別作為向兩側(cè)輸卵管注入胚卵之用；先吸入少許培養(yǎng)液，排出后留少許液體并保留一兩個(gè)氣泡，繼之吸入胚卵數(shù)個(gè)(在管腔內(nèi)成串)； 最后仍保留一個(gè)氣泡，以使管內(nèi)胚卵限制于氣泡之間不易移動(dòng)并利于識(shí)別；（3） 麻醉小鼠，深度適當(dāng)，置動(dòng)物于小手術(shù)平臺(tái)上，呈腹臥位(背朝上)；（4） 剪出背腎部?jī)蓚?cè)毛，碘酒酒精消毒；（5） 使動(dòng)物軀干部一側(cè)斜向上，在髂骨和腎臟下方間剪一縱切口，長(zhǎng)2cm；（6） 輕輕牽出輸卵管，找尋輸卵管口(剛排卵動(dòng)物輸卵管壺腹部微膨脹，內(nèi)可見

14、 成團(tuán)未受精卵子)一手用鑷子輕輕持住輸卵管系膜，另一只手持一個(gè)含有胚 卵的注入管，伸入輸卵管口內(nèi)，把吸管內(nèi)已含有外源DNA的胚卵全部注入 輸卵管內(nèi)；（7） 把輸卵管及周圍組織送回腹腔內(nèi)；（8） 仔細(xì)緊密縫合創(chuàng)口，（9） 再令動(dòng)物倒向另側(cè)；按同樣操作方法向該側(cè)輸卵管內(nèi)輸入同等量的胚卵。（六）顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率（六）顯微注射法獲得轉(zhuǎn)基因鼠的成活率優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 轉(zhuǎn)基因范圍廣，轉(zhuǎn)移基因大，可達(dá)數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何 病毒基因組片段，絕對(duì)安全 。整合機(jī)制不明確，無規(guī)律隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不 表達(dá)；整合位點(diǎn)隨機(jī)會(huì)造成轉(zhuǎn)動(dòng)物基因組的重排、突變、易位缺 失等；需顯微操作儀，技術(shù)性要求

15、強(qiáng)。 二、胚胎干細(xì)胞方法二、胚胎干細(xì)胞方法胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細(xì)胞。它是一種含正常二倍體染色體的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。可以在體外進(jìn)行人工培養(yǎng)，擴(kuò)增，并能以克隆的形式保存。（一）ES細(xì)胞的建立與維持動(dòng)物的準(zhǔn)備：動(dòng)物的準(zhǔn)備：取受精之后3.5天的母鼠分離鼠胚。胚胎的分離和初培養(yǎng)：胚胎的分離和初培養(yǎng)：3.5天孕鼠 鼠斷頸處死 解剖小鼠取出胚胎 體外培養(yǎng)胚胎 46天后，離散ICM。ICM的離散與的離散與ES的分離：的分離：分離ICM 酶解細(xì)胞團(tuán) 培養(yǎng)離散細(xì)胞 ES細(xì)胞集落ES細(xì)

16、胞的擴(kuò)增：細(xì)胞的擴(kuò)增：離散ES細(xì)胞 置四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng) ES細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)：細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)：ES細(xì)胞由四孔板轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（二）ES細(xì)胞的基因組操作 將外源基因移入到ES細(xì)胞基因組后，既能高效穩(wěn)定表達(dá)，又不影響ES細(xì)胞的各種功能。 這就要求目的基因必須要定點(diǎn)參入，并且參入整合后，對(duì)原有基因結(jié)構(gòu)及功能沒有影響或影響最小。與整合位點(diǎn)兩端區(qū)域同源的兩段DNA序列（HB1和HB2）轉(zhuǎn)入的目的基因（TG）編碼抗G418的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（neor）兩個(gè)不的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2）（三）轉(zhuǎn)基因（三）轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的篩選細(xì)胞的篩選正負(fù)選擇法正負(fù)選擇法 正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整

17、合型正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細(xì)胞：細(xì)胞： 通過物理方法將重組DNA分子導(dǎo)入ES細(xì)胞，在含有抗菌素G418的培養(yǎng)基中，沒有整合外源基因的細(xì)胞將全部死亡，只有整合了外源基因的細(xì)胞才可以存活下來。負(fù)選擇法篩選出特異整合型負(fù)選擇法篩選出特異整合型ES細(xì)胞：細(xì)胞： 如果非特異性整合發(fā)生，則兩個(gè)tk基因或其中一個(gè)基因很大可能與TG和neor一起整合，這時(shí)用GCV篩選， tk基因表達(dá)的胸苷激酶能反GCV轉(zhuǎn)化成有毒的化合物，使細(xì)胞死亡。這是負(fù)選反擇。（四）轉(zhuǎn)基因（四）轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的檢測(cè)細(xì)胞的檢測(cè)（五）轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育（五）轉(zhuǎn)基因小鼠的繁育 正確整合的轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后就可以移入胚正確整合的轉(zhuǎn)基因

18、胚胎干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后就可以移入胚泡期的供體胚胎了。將這些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子泡期的供體胚胎了。將這些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內(nèi)，繁育轉(zhuǎn)基因小鼠。宮內(nèi)，繁育轉(zhuǎn)基因小鼠。（六）獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠優(yōu)點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移效率大大提高，且能進(jìn)行定位基因轉(zhuǎn)移。缺點(diǎn)：需要多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這對(duì)飼養(yǎng)成本高，產(chǎn) 仔數(shù)較少的大型哺乳類動(dòng)物來說，要獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一件 需要大量資金投入的事情。三、反轉(zhuǎn)錄病毒法（一）反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的原理（一）反轉(zhuǎn)錄病毒感染法的原理反轉(zhuǎn)錄病毒單鏈RNA分子；病毒進(jìn)入細(xì)胞后，RNA編碼出反轉(zhuǎn)錄酶；病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈分子；DNA整合到宿主細(xì)胞DNA中。（二）反轉(zhuǎn)錄病毒感染

19、法的載體的構(gòu)建提取病毒未整合的環(huán)狀形式DNA；將環(huán)狀DNA克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中；選擇適當(dāng)?shù)拿笇⒉《窘Y(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)切除；將外源目的基因克隆到載體中（三）通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：反轉(zhuǎn)錄病毒載體的工作原理：寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒寄生在受體細(xì)胞中的重組病毒由于沒有包裝信號(hào)，能生產(chǎn)病病毒有包裝信號(hào)，能生產(chǎn)病病毒RNA和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒和所有蛋白質(zhì)，但不能包裝成病毒顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的包裝信號(hào)將使包裝蛋白顆粒；病毒載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞后，載體上的包裝信號(hào)將使包裝蛋白把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。把載體包裝成為侵染生的病毒顆粒。

20、四、重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎四、重組反轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能有效地將轉(zhuǎn)基因整合入受體細(xì)胞的基因組內(nèi)，單拷貝整合型；轉(zhuǎn) 基因整合后能穩(wěn)定地遺傳；整合機(jī)制相應(yīng)明確，在TR區(qū)域內(nèi)進(jìn) 行，不會(huì)破壞轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu) 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：載量較小，一般只有8kb，可能會(huì)因缺少必須的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn) 基因表達(dá)；盡管病毒載體被設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型的，但在包裝細(xì)胞的 包裝過程中，若與整合型輔助表達(dá)基因組發(fā)生同源重組，就有可能 組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此在構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物時(shí)，一般使用受到限制。操作繁瑣。 第三節(jié)第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)uDNA的提取的提取u斑點(diǎn)雜交和斑點(diǎn)雜交和PCR

21、擴(kuò)增擴(kuò)增uSouthern雜交雜交uNorthern雜交雜交u表達(dá)產(chǎn)的檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)的檢測(cè)第四節(jié)第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究現(xiàn)狀一、轉(zhuǎn)基因牛一、轉(zhuǎn)基因牛從屠宰場(chǎng)殺掉的奶牛體內(nèi)收集從屠宰場(chǎng)殺掉的奶牛體內(nèi)收集 卵母細(xì)胞，并使之在體外成熟卵母細(xì)胞，并使之在體外成熟用公牛精液對(duì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)用公牛精液對(duì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn) 行體外受精；行體外受精；受精卵離心，濃縮卵黃；受精卵離心，濃縮卵黃；將欲導(dǎo)入的將欲導(dǎo)入的DNA微注射到桔前微注射到桔前 核當(dāng)中；核當(dāng)中；對(duì)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)；對(duì)胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)；利用非外科移植術(shù)將一個(gè)胚胎利用非外科移植術(shù)將一個(gè)胚胎 植入發(fā)情的代孕母牛子宮內(nèi)；植入發(fā)情的代孕母牛子宮內(nèi)

22、；對(duì)于代進(jìn)行州對(duì)于代進(jìn)行州A檢測(cè)，確定是檢測(cè)，確定是 否存在轉(zhuǎn)人基因。否存在轉(zhuǎn)人基因。二、轉(zhuǎn)基因綿羊、山羊和豬二、轉(zhuǎn)基因綿羊、山羊和豬在山羊奶中生產(chǎn)在山羊奶中生產(chǎn)ATT三、轉(zhuǎn)基因禽類三、轉(zhuǎn)基因禽類四、轉(zhuǎn)基因魚四、轉(zhuǎn)基因魚第五節(jié)第五節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的組織特異性表達(dá)研究基因的組織特異性表達(dá)研究發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控研究發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控克隆在發(fā)育中起重要作用的基因克隆在發(fā)育中起重要作用的基因基因多級(jí)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究基因多級(jí)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究細(xì)胞功能研

23、究細(xì)胞功能研究基因敲除（基因敲除（gene knock out），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功，是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分部分觀察整體觀察整體推測(cè)功能的三部曲思想相似。推測(cè)功能的三部曲思想相似。 基因敲除的技術(shù)路線如下：基因敲除的技術(shù)路線如下：（1）構(gòu)建重組基因載體（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DN

24、A轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。 二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究病毒性疾病研究病毒性疾病研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因治療轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基因治療生產(chǎn)天然活性藥物蛋白生產(chǎn)天然活性藥物蛋白第六節(jié)第六節(jié) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)問題轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)問題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問

25、題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型與預(yù)期不符問題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型與預(yù)期不符問題乳腺生物反應(yīng)器的問題乳腺生物反應(yīng)器的問題社會(huì)問題社會(huì)問題第七節(jié) 動(dòng)物生物反應(yīng)器 一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（叫動(dòng)物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器應(yīng)器, ,動(dòng)

26、物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。一一、動(dòng)物血液生物反應(yīng)器動(dòng)物血液生物反應(yīng)器 外源基因在血液中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫血液生外源基因在血液中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫血液生物反應(yīng)器。物反應(yīng)器。大家畜的血液容量較大大家畜的血液容量較大,利用動(dòng)物血液生產(chǎn)某些利用動(dòng)物血液生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)或多肽等藥物己取得了一定進(jìn)展。外源基因編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)或多肽等藥物己取得了一定進(jìn)展。外源基因編碼產(chǎn)物可直接從血清中分離出來可直接從血清中分離出來,血細(xì)胞組分可通過裂解細(xì)胞獲得。血細(xì)胞組分可通過裂解細(xì)胞獲得。 二、動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器二、動(dòng)物

27、膀胱生物反應(yīng)器 外源基因在膀胱中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器外源基因在膀胱中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器,叫動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器。叫動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器。膀胱尿乳頭頂端表面可表達(dá)一組尿血小板溶素的膜蛋白,這種蛋白在膀胱中表達(dá)具有專一性,而且它的基因是高度保守的,將外源基因插入5端調(diào)控序列中,就可以指導(dǎo)外源基因在尿中表達(dá)。 三、動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器三、動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器 動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物動(dòng)子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物, 指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá)指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá), 并從轉(zhuǎn)并從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳液中獲取重組蛋白。基因動(dòng)物的乳液中獲取重組蛋白。1. 動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的制備動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的制備（1）表達(dá)載體的構(gòu)建 目前用于表達(dá)載體的啟動(dòng)子調(diào)控元件選用動(dòng)物乳蛋白基因啟動(dòng)子元件，主要有四類乳腺定位表達(dá)調(diào)控元件：第一類是B2乳球蛋白(BL G)，第二類是