受體配體簡ppt課件

1、第八節(jié)第八節(jié)受體的放射性配體結(jié)合分析受體的放射性配體結(jié)合分析（radioligand binding assay of receptors, RBA） 岳岳 凌凌1;.2一、總一、總 論論 受體受體（receptor，R） 細胞膜上或細胞內(nèi)能識別生物活性物質(zhì)并與之結(jié)合，進而引起生物學(xué)效應(yīng)的生物大細胞膜上或細胞內(nèi)能識別生物活性物質(zhì)并與之結(jié)合，進而引起生物學(xué)效應(yīng)的生物大分子。分子。 3 配體配體（ligand，L） 能與受體特異性結(jié)合的生物活性分子。能與受體特異性結(jié)合的生物活性分子。 配體配體 內(nèi)源性配體內(nèi)源性配體外源性配體外源性配體4 RBA 原理是基于放射性核素標記的配體與特異受體的理化結(jié)合反

2、應(yīng)。原理是基于放射性核素標記的配體與特異受體的理化結(jié)合反應(yīng)。 應(yīng)用放射性標記配體和組織、細胞或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配體充分應(yīng)用放射性標記配體和組織、細胞或含有受體的制劑一起溫育，使受體和配體充分結(jié)合，形成受體結(jié)合，形成受體-配體復(fù)合物，終止反應(yīng)后，用過濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標配體復(fù)合物，終止反應(yīng)后，用過濾或離心的方法除去未被結(jié)合的標記物，測定受體記物，測定受體-配體復(fù)合物的放射性，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，可求得受體對配體的親和力配體復(fù)合物的放射性，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，可求得受體對配體的親和力和受體的最大結(jié)合容量。和受體的最大結(jié)合容量。 5 RBA的分類的分類 定量定量RBA 可以測定靶組織或

3、靶細胞中能與配體結(jié)合的受體數(shù)（以結(jié)合位點數(shù)表示）及可以測定靶組織或靶細胞中能與配體結(jié)合的受體數(shù)（以結(jié)合位點數(shù)表示）及研究受體的親和力（常以平衡解離常數(shù)表示）。研究受體的親和力（常以平衡解離常數(shù)表示）。 定性定性RBA 發(fā)現(xiàn)和確定新的受體和受體亞型，及在分子水平研發(fā)現(xiàn)和確定新的受體和受體亞型，及在分子水平研 究受體究受體-配體的相互作用等。配體的相互作用等。 6 RBA的應(yīng)用的應(yīng)用 神經(jīng)遞質(zhì)神經(jīng)遞質(zhì) 激素和藥物等的作用機制激素和藥物等的作用機制 疾病的病因和發(fā)病機制疾病的病因和發(fā)病機制 新藥設(shè)計和藥物篩選新藥設(shè)計和藥物篩選 受體顯像與受體介導(dǎo)治療受體顯像與受體介導(dǎo)治療 7二、概二、概 述述1.

4、受體的分類受體的分類 類(class) 膜受體 核受體 亞類（subclass） 型 (type) 亞型 (subtype) 82. 受體與配體結(jié)合的基本特點受體與配體結(jié)合的基本特點1）可飽和性）可飽和性(saturability) 2）特異性）特異性(specificity) 3）適度的親和力（）適度的親和力（affinity） 4）可逆性）可逆性(reversibility) 5）識別能力）識別能力(recognition)和生物效應(yīng)的一致性和生物效應(yīng)的一致性9受體與配體特異性結(jié)合的特點：受體與配體特異性結(jié)合的特點：親和力高，結(jié)合容量小。親和力高，結(jié)合容量小。親和力：受體與配體的結(jié)合能力。

5、親和力：受體與配體的結(jié)合能力。平衡解離常數(shù)（平衡解離常數(shù)（equilibrium dissociation constant，KD） 指占據(jù)半數(shù)受體所需的配體濃度。指占據(jù)半數(shù)受體所需的配體濃度。 KD值愈小，表明親和力愈高；值愈小，表明親和力愈高；KD值愈大，親和力愈低。值愈大，親和力愈低。10三、單位點系統(tǒng)三、單位點系統(tǒng)RBA的基本規(guī)律的基本規(guī)律（一）簡單單位點系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應(yīng)的基本規(guī)律（一）簡單單位點系統(tǒng)受體和配體結(jié)合反應(yīng)的基本規(guī)律 1. 質(zhì)量作用定律質(zhì)量作用定律 k1,v1 R + L RL k2,v2 根據(jù)質(zhì)量作用定律根據(jù)質(zhì)量作用定律： v1 = k1 R L v2 = k2 R

6、L 11 當反應(yīng)達到平衡后，當反應(yīng)達到平衡后， v1 = v2 即：即： k1 RL = k2 RL 則平衡解離常數(shù)（則平衡解離常數(shù)（KD）的數(shù)學(xué)表達式（）的數(shù)學(xué)表達式（1.1）為）為： KD k2 RL k1 RL122. 飽和曲線飽和曲線(saturation curve)1）飽和曲線）飽和曲線 當配體的濃度從零開始上升時，形成的復(fù)合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，當配體的濃度從零開始上升時，形成的復(fù)合物也逐漸增多。但由于受體數(shù)量有限，又是可逆反應(yīng)，因此又是可逆反應(yīng)，因此RL的增加不是直線上升，而是一條上升先快后慢的曲線，最后的增加不是直線上升，而是一條上升先快后慢的曲線，最后絕大部分受

7、體與配體結(jié)合時，絕大部分受體與配體結(jié)合時，RL的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，的增加就非常緩慢，漸趨水平，即受體已經(jīng)飽和了，此即飽和曲線此即飽和曲線 。132）設(shè)）設(shè)LT為配體的初始濃度，為配體的初始濃度，RT為受體的為受體的 初始濃度，則有：初始濃度，則有： L = LT RL R = RT RL 將上式代入將上式代入(1.1)式，經(jīng)整理得式，經(jīng)整理得： RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0 14 飽和曲線的形狀和飽和曲線的形狀和KD有關(guān)（如圖有關(guān)（如圖1）。圖圖1 KD對飽和曲線的影響對飽和曲線的影響 15飽和曲線曲線的高度取決于飽和曲線曲線的高度取決于RT（如圖（如圖

8、2）。）。 圖圖2 RT對飽和曲線影響對飽和曲線影響163. Scatchard作圖作圖由式（由式（1.1）整理可得）整理可得： KD RT-RLL RL 將上式整理可得將上式整理可得： RL = RT 1_ RL L KD KD 17 以復(fù)合物濃度以復(fù)合物濃度RL為橫坐標，以復(fù)合物濃度和游離配體的濃度比值為橫坐標，以復(fù)合物濃度和游離配體的濃度比值RL/L為縱坐標作圖，為縱坐標作圖，即為即為Scatchard作圖。作圖。 簡單單位點系統(tǒng)簡單單位點系統(tǒng)Scatchard作圖為一條直線，斜率為作圖為一條直線，斜率為 -（1/KD），橫軸截距為），橫軸截距為RT，縱軸，縱軸截距為截距為RT/ KD（

9、見圖（見圖3）。）。18圖圖3 簡單單位點系統(tǒng)簡單單位點系統(tǒng)RBA的的Scatchard作圖作圖19（二）非特異性結(jié)合（二）非特異性結(jié)合(non-specific binding，NSB)NSB 在在RBA系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還可與其他成分（如非特異蛋白、系統(tǒng)中，放射性配體除與受體特異性結(jié)合外，還可與其他成分（如非特異蛋白、反應(yīng)容器、分離材料等）結(jié)合。反應(yīng)容器、分離材料等）結(jié)合。NSB的特點的特點 親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)配體濃度增加而線性增大，而且這親和力小而結(jié)合容量大，不易被飽和，隨反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)配體濃度增加而線性增大，而且這種結(jié)合與生物效應(yīng)無關(guān)（見圖

10、種結(jié)合與生物效應(yīng)無關(guān)（見圖4）。）。20圖圖4 飽和曲線實驗中飽和曲線實驗中TB、SB和和NSB的關(guān)系的關(guān)系21在在RBA的數(shù)據(jù)處理時，測得的總結(jié)合的放射性的數(shù)據(jù)處理時，測得的總結(jié)合的放射性(total binding，TB)，必須減去，必須減去NSB，才能，才能得到特異性結(jié)合得到特異性結(jié)合(specific binding，SB)的數(shù)據(jù)。的數(shù)據(jù)。22四、四、RBA的基本方法的基本方法 離體離體RBA的基本方法可概述如下：的基本方法可概述如下： 1. 制備待測受體的離體標本（組織切片、細胞懸液、細胞組分的分離制備等）制備待測受體的離體標本（組織切片、細胞懸液、細胞組分的分離制備等） 2. 加樣

11、（標本、放射性標記配基、緩沖液、非標記配基等）加樣（標本、放射性標記配基、緩沖液、非標記配基等） 3. 溫育溫育 4. 分離結(jié)合和游離的放射性標記配體分離結(jié)合和游離的放射性標記配體 5. 測定結(jié)合部分的放射性測定結(jié)合部分的放射性 6. 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理23 標記配體的基本要求標記配體的基本要求 1）高比活度）高比活度 2）親和力高）親和力高 3）特異性強）特異性強 4）放射化學(xué)純度高）放射化學(xué)純度高24五、定量五、定量RBA的數(shù)據(jù)處理的數(shù)據(jù)處理定量定量RBA主要是通過已知標記配體的量和比活度，以及測得的樣本的數(shù)據(jù)，應(yīng)用主要是通過已知標記配體的量和比活度，以及測得的樣本的數(shù)據(jù)，應(yīng)用數(shù)學(xué)模型求出受

12、體的有關(guān)參數(shù)如受體密度數(shù)學(xué)模型求出受體的有關(guān)參數(shù)如受體密度RT、KD等。等。251. 單點法實驗的數(shù)據(jù)處理單點法實驗的數(shù)據(jù)處理通常是計算飽和區(qū)的受體密度，即受體最大結(jié)合容量（通常是計算飽和區(qū)的受體密度，即受體最大結(jié)合容量（maximum binding capacity，Rmax）。）。受體密度的表示方式有以下幾種：受體密度的表示方式有以下幾種： 胞漿胞膜等的受體含量：胞漿胞膜等的受體含量：fmol/mg蛋白；蛋白； 胞核的受體含量：胞核的受體含量：fmol/mgDNA； 完整細胞受體的含量：結(jié)合位點完整細胞受體的含量：結(jié)合位點/cell（site/cell）或）或 fmol/106細胞。細胞

13、。26單點法實驗只適用于簡單單位點系統(tǒng)，其計算公式如下：單點法實驗只適用于簡單單位點系統(tǒng)，其計算公式如下： RT = _RL的cpm_ 探測效率（）配體比活度標本的蛋白量（DNA量）或細胞數(shù)272. 簡單單位點簡單單位點RBA的多點法實驗的多點法實驗多點法實驗可分為簡單單位點和雙位點多點法實驗可分為簡單單位點和雙位點(多位點多位點)兩方面，它們又可各自分為飽和曲線實兩方面，它們又可各自分為飽和曲線實驗和競爭結(jié)合實驗兩類。驗和競爭結(jié)合實驗兩類。 28簡單單位點飽和曲線的數(shù)據(jù)處理簡單單位點飽和曲線的數(shù)據(jù)處理1. Scatchard模型模型 以復(fù)合物濃度以復(fù)合物濃度RL為橫坐標，以復(fù)合物濃度和游離配

14、體的濃度比值為橫坐標，以復(fù)合物濃度和游離配體的濃度比值RL/L為縱坐標作為縱坐標作圖，實際應(yīng)用時，圖，實際應(yīng)用時，RL/L的濃度比值由放射性的比值的濃度比值由放射性的比值B/F代表。代表。29具體公式如下具體公式如下： ： RL = B = RT 1_ RL L F KD KD 以以B/F對對RL作圖應(yīng)為一條直線，斜率為作圖應(yīng)為一條直線，斜率為-(1/KD)，直線與橫軸的交點為，直線與橫軸的交點為RT值，與縱軸交值，與縱軸交點為點為RT/KD。302. 計算機曲線擬合計算機曲線擬合飽和曲線的直接表達式為：飽和曲線的直接表達式為： RL2-RLRT+LT+KD+RTLT=0其中，其中，LT是自變量（橫坐標），是自變量（橫坐標），RL是因變量（縱坐標），是因變量（縱坐標），RT和和KD是固定值。應(yīng)用是固定值。應(yīng)用計算機以最小二乘法或穩(wěn)健回歸法進行曲線擬合，可以得到計算機以最小二乘法或穩(wěn)健回歸法進行曲線擬合，可以得到RT和和KD的值。的值。31應(yīng)應(yīng) 用用1. 放射受體顯像：放射受體顯像： 放射性配體與靶細胞上受體結(jié)合，顯像。放射性配體與靶細胞上受體結(jié)合，顯像。323334352. 受體介導(dǎo)的靶向治療受體介導(dǎo)的靶向治療 放射性配體注入體內(nèi)，到相應(yīng)受體高密度的靶器官，形成放