實驗十七 蛋白質(zhì)分子量測定——凝膠過濾層析法

1、實驗十七 蛋白質(zhì)分子量測定凝膠過濾層析法一、目的：（1）初步掌握利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量的原理。（2）學(xué)習(xí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液制作ve，kav對1gmr的“選擇曲線”以及測定未知蛋白質(zhì)樣品分子量的方法。二、原理：凝膠層析法（即凝膠過濾法，gel filtration）是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法，又叫做分子篩層析法（molecular sieve chromatography），排阻層析法（exclusion chromatography）。凝膠本身是一種分子篩，它可以把分子按大小不同進(jìn)行分離，好象過篩可以把大顆粒與小顆粒分開一樣。但這種“過篩”與普通的過篩不一樣。將凝膠

2、顆粒在適宜溶劑中浸泡，使充分吸液膨脹，然后裝入層析柱中，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫，在洗脫過程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。分離過程中的示意見圖17-1。凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然凝膠還是人工合成凝膠，它們的內(nèi)部都具有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠層析法常用的天然凝膠是瓊脂糖凝膠（agarose gel，商品名sepharose），人工合成凝膠是聚丙烯酰胺凝膠（商品名為bio-gel-p）和葡聚糖（dextran）凝膠，后者的商品名稱為seph

3、adex型的各種交聯(lián)葡聚糖凝膠，它是個有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，不溶于水，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖17-2所示。這種聚合物的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離物質(zhì)分子的大小有相應(yīng)的數(shù)量級。在凝膠充分溶脹后，交聯(lián)度高的，孔隙小，只有相應(yīng)的小分子可以通過，適于分離小分子物質(zhì)。相反，交聯(lián)度低的孔隙大，適于分離大分子物質(zhì)。利用這種性質(zhì)可分離不同分子量的物質(zhì)。為了說明凝膠層析的原理，將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以vt（total volume）表示。實際上vt是由vo，vi與vg三部分組成，即： vt=vo+vi+vgvo稱為“孔隙體積”或“外體積”（outer volume）又稱“外水體積”，

4、即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動相的體積；vi為內(nèi)體積（inner volume），又稱“內(nèi)水體積”，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積，相應(yīng)于一般層析法中的固定相的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水后的重量求得；vg為凝膠本身的體積，因此vtvo等于vi+vg 。它們之間的關(guān)系可用圖17-3表示。洗脫體積（ve，elution volume）與vo及vi之間的關(guān)系可用下式表示： ve=vo+kdvi式中ve為洗脫體積，自加入樣品時算起，到組分最大濃度（峰）出現(xiàn)時所流出的體積；kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配

5、系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小分布有關(guān)，而與柱的長短粗細(xì)無關(guān)，也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理條件無關(guān)。kd可通過實驗求得，上式可改寫成： kd=上式中ve為實際測得的洗脫體積；vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（最好有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍(lán)色葡聚糖-2000等）通過實際測量求出；vi可由g·wr求得（g為干凝膠重，單位為克；wr為凝膠的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，對一層析柱凝膠床來說，只要通過實驗得知某一物質(zhì)的洗脫體積ve，就可算出它的kd值。以上關(guān)系可用圖17-4表示。kd可以有下列幾種情況：1、當(dāng)kd

6、=0時，則ve=vo。即對于根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)（全排阻），洗脫體積等于空隙體積（圖中組分）。2、當(dāng)kd=1時，ve=vo+vi。即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)體積之和（圖中組分）?？梢钥闯觯瑢δ骋荒z介質(zhì)，兩種全排出的分子即kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。同樣兩種分子如都能進(jìn)入內(nèi)部空隙，即kd都等于1，它們既使分子大小有不同，也沒有分離效果。因此不同型號的凝膠介質(zhì)，有它一定的使用范圍。3、當(dāng)0kd1時，ve=vo+kdvi。表示內(nèi)體積只有一部分可被組分利用，擴(kuò)散滲入，ve即在vo+vi之間變化（圖中組分）。4、有時kd1，表示凝膠對組分

7、有吸附作用，此時vevo+vi。例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)超出理論計算的最大值，這些化合物的kd1。如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在sephadex g-25中的kd值分別為1.2，1.4和2.2。在實際工作中，對小分子物質(zhì)也得不到kd=1的數(shù)值，特別是交聯(lián)度大的凝膠差別更大，如用g-10型得kd值0.75左右，用g-25型得0.8左右。這是由于一部分水相與凝膠結(jié)合較牢固，成為凝膠本身的一部分，因而不起作用，小分子不能擴(kuò)散入內(nèi)所致。此時vi即不能以g·wr計算，為此也常有直接用小分子物質(zhì)d2o，nacl等通過凝膠柱而由實驗計算出vi值的。另一個解決的辦法是不使用vi與kd，而用ka

8、v（有效分配系數(shù)）代替kd，其定義如下：已知 kd=，將vtvo代替vi，則： kav=即 ve=vo+kav(vtvo)在這里實際上將原來以水作為固定相（vi）改為水與凝膠顆粒（vivo）作為固定相，而洗脫劑（vevo）作為流動相。kav與kd對交聯(lián)度小的凝膠差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠差別大。在一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用時，當(dāng)流動相流過vt體積后，所有的組分都應(yīng)該被洗出來，這一點(diǎn)為凝膠層析法的特點(diǎn)，與一般層析方法不同。ve與分子量的關(guān)系：對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。ve與分子量的關(guān)系可用下式表示： ve=k

9、1k2logmrk1與k2為常數(shù)，mr為分子量，ve也可用vevo（分離體積），ve/vo（相對保留體積），ve/vt（簡化的洗脫體積，它受柱的填充情況的影響較小）或kav代替，與分子量的關(guān)系同上式，只是常數(shù)不同。通常多以kav對分子量的對數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”，如圖17-5所示。曲線的斜率是說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線愈陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄。凝膠層析主要決定于溶質(zhì)分子的大小，每一類型的化合物如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的分子量，測定時以使用曲線的直線部分為宜。用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量，方法簡單，技術(shù)

10、易掌握，樣品用量少，而且有時不需要純物質(zhì)，用一粗制品即可。例如在一粗酶制劑中，為了測定某一酶組分的分子量，只要測定洗脫液中具有該酶最大活性的部分，然后確定其洗脫體積，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出其分子量。凝膠層析法測定分子量也有一定的局限性，在ph68的范圍內(nèi)，線性關(guān)系比較好，但在極端ph時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時，測得分子量比真實的要大，鐵蛋白則與此相反，測得的分子量比真實的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等會與葡聚糖凝膠形成絡(luò)合物，這種絡(luò)合物與酶-底物絡(luò)合物相似，因此在葡聚糖凝膠上層析時表現(xiàn)異常。用凝膠層析法所測分子量的結(jié)果，要和其它方法的測定相對照，由此才

11、可作出較可靠的結(jié)論。凝膠層析技術(shù)操作方便，設(shè)備簡單，周期短，重復(fù)性能好，而且條件溫和，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化，目前已得到相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，例如可用于脫鹽，濃縮高分子物質(zhì)的溶液，生化物質(zhì)的分離提純，去除熱源物質(zhì)以及用于測定高分子物質(zhì)的分子量。下面實驗是用葡聚糖凝膠層析法測定蛋白質(zhì)的分子量。三、試劑及器材：1、試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液（各23mg·ml-1，用氯化鉀-乙酸溶液配制），牛血清清蛋白（mr67000），雞卵清蛋白（mr43000），胰凝乳蛋白酶原a（mr25000）和結(jié)晶牛胰島素（ph2時為二聚體mr12000）等均需層析純。（2）藍(lán)色葡聚糖-2000（810mg&#

12、183;ml-1），n-乙酰酪氨酸乙酯（或硫酸銨或重鉻酸鉀）（810mg·ml-1）。（3）0.025mo·l-1氯化鉀-0.2mol·l-1乙酸溶液，sephadex g75（或g100），5%ba（ac）2。（4）待測蛋白質(zhì)樣品液。2器材：層析柱：柱管（直徑1.01.3cm；管長90100cm），核酸蛋白檢測儀或紫外分光光度計，自動部分收集器，恒壓瓶，下口瓶。四、操作步驟：1、一般操作方法：（1）凝膠的選擇和處理凝膠顆粒最好大小比較均勻，這樣，流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。如果顆粒大小不勻，用傾瀉法傾去不易沉下的較細(xì)顆粒。將稱好的干粉傾入過量的洗脫液（一般多用水，鹽溶液

13、或緩沖溶液）中，室溫下放置，使之充分溶脹。注意不要過分?jǐn)嚩?，以防顆粒破碎。溶脹時間因凝膠交聯(lián)度不同而異為了縮短溶脹時間，可在沸水浴上加熱將近100，這樣可大大縮短溶脹時間至幾小時，而且還可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排除凝膠內(nèi)氣泡。種類凝膠溶脹時間請查閱葡聚糖凝膠的技術(shù)數(shù)據(jù)表。（2）裝柱裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣。裝柱方法與一般柱層析法相似。層析柱可以自制或外購，目前已有各種規(guī)格層析柱商品（圖17-6）。裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出。關(guān)閉層析柱出水口，并向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約23cm后，打開柱的出口，

14、調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。接著再通過23倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。新裝好的柱要檢驗其均一性，可用帶色的高分子物質(zhì)如藍(lán)色葡聚糖-2000（又稱藍(lán)色右旋糖，商品名為blue dextran-2000）、紅色葡聚糖或細(xì)胞色素c等配成2mg/ml的溶液過柱，看色帶是否均勻下降，或?qū)⒅芟蚬庹辗较蛴醚劬τ^察，看是否均勻，有無“紋路”或氣泡。若層析柱床不均一，必須重新裝柱。（3）加樣要照顧到濃度與粘度兩個方面。分析用量：12ml/100ml

15、柱床容積（12%）；制備用量：2030ml/100ml柱床容積。加樣方法與一般柱層析相同。夾緊上、下進(jìn)、出水口夾子，為防止操作壓改變，可將塑料管下口抬高至離柱上端約50cm處（sephadex g-75，選用50cm液柱操作壓），打開柱上端的塞子或螺絲帽，吸出層析柱中多余液體直至與膠面相切。沿管壁將樣品溶液小心加到凝膠床面上，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開下口夾子，使樣品溶液流入柱內(nèi)，同時收集流出液，當(dāng)樣品溶液流至與膠面相切時,夾緊下口夾子。按加樣操作，用1ml洗脫液沖洗管壁2次。最后加入34ml洗脫液于凝膠上，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒壓瓶，柱出水口與核酸蛋白質(zhì)檢測儀比色池進(jìn)液口相連，比色池

16、出液口再與自動部分收集器相連（如圖17-7）。（4）洗脫洗脫液應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同。洗脫用的液體有水（多用于分離不帶電荷的中性物質(zhì)）及電解質(zhì)溶液（用于分離帶電基團(tuán)的樣品），如酸、堿、鹽的溶液及緩沖液等。對于吸附較強(qiáng)的組分，也有使用水與有機(jī)溶劑的混合液，如水-甲醇、水乙醇、水-丙酮等為洗脫劑，可以減少吸附，將組分洗下。本實驗洗脫用0.025mol·l-1氯化鉀-0.2mol·l-1乙酸溶液。洗脫時，打開上、下進(jìn)出口夾子，用0.025mol·l-1氯化鉀-0.2mol·l-1乙酸溶液，以每管3ml/10min流速洗脫，用自動部分收集器收集流出液。影響洗脫

17、液流速的因素有：洗脫液加在柱上的壓力操作壓（由液面差引起）。一般來說，流速與柱壓力差成正比，但對某些種類凝膠加壓不能超過一個極限值，否則加大壓力，不僅不能增加流速，反而使流速急劇下降，特別是在使用交聯(lián)度?。╳r7.5）的凝膠時要特別注意。為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。凝膠交聯(lián)度；交聯(lián)度大的凝膠（g-10至g-50型）的流速與柱的壓力差成正比，與柱長成反比，與柱的直徑無關(guān)。交聯(lián)度小的凝膠（g-75至g-200型）的流速與柱的直徑有關(guān)，并在一定操作壓差下有最大的流速值，操作壓見圖17-8。凝膠顆粒大?。侯w粒大時，流速較大，但流速大時洗脫峰形常較寬。顆粒小時，流速較慢，分離情況較好。要求

18、在不影響分離效果情況下，盡可能使流速不致太慢，以免用時過長。（5）重裝一般地說，一次裝柱后，可反復(fù)使用，無特殊的“再生”處理，只須在每次層析后用34倍柱床體積的洗脫液過柱。由于使用過程中，顆?？赡苤鸩匠练e壓緊，流速逐漸會減低，使得一次分析用時過多，這時需要將凝膠倒出，重新填裝；或用反沖方法，使凝膠松動沖起，再行沉降。有時流速改變是由于凝膠頂部有雜質(zhì)集聚，則需竟混有臟物的凝膠取出，必要時可將上部凝膠攪松后補(bǔ)充部分新膠，經(jīng)沉集、平衡后即可使用。（6）凝膠的保存方法凝膠用完后，可用以下方法保存。膨脹狀態(tài)：即在水相中保存?？砂醋⒁馐马棧?），加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。半收縮狀態(tài)：用完后用水洗凈

19、，然后再用60%70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫保存。干燥狀態(tài)：用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，則凝膠脫水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽濾至干，于6080干燥后保存。這3種方法中，以干燥狀態(tài)保存為最好。2蛋白質(zhì)分子量測定根據(jù)待測蛋白質(zhì)的分子量范圍選用sephadex g-75或g-100型凝膠，其顆粒在40120m，柱管選用直徑1.01.3cm，柱長90100cm，本實驗選用1.1×100cm商品層析柱。（1）測定vo和vi將0.5ml藍(lán)色葡聚糖-2000和硫酸銨混合液（2mg·ml-1）上柱、洗脫，分別測出ve。藍(lán)色葡聚糖的ve即為該柱

20、的vo，硫酸銨洗脫體積ve減去vo即為柱的vi。藍(lán)色葡聚糖的洗脫峰可根據(jù)顏色判斷，硫酸銨洗脫峰用ba（ac）2生成沉淀判斷（若用重鉻酸鉀，其洗脫峰，可根據(jù)顏色判斷）。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按上述方法將1ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液上柱，然后用0.025mol·l-1氯化鉀-0.2mol·l-1乙酸溶液洗脫。流速3ml/10min，3ml/管。用部分收集器收集，核酸蛋白質(zhì)檢測儀280nm處檢測，記錄洗脫曲線，或收集后用紫外分光光度計280nm處測定每管光吸收值。以管號（或洗脫體積）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作出洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰位置，量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積（ve）。然后，以蛋白質(zhì)分

21、子量的對數(shù)1gmr為縱坐標(biāo)，ve為橫坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖17-9）。為了結(jié)果可靠，應(yīng)以同樣條件重復(fù)12次，取ve的平均值作圖。同時根據(jù)已測出的vo和vi以及通過測量柱的直徑和凝膠柱床高度，計算出的vt，分別求出kd和kav。kd=kav=也可以kd或kav為橫坐標(biāo)，1gmr為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）未知樣品分子量的測定完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作。五、結(jié)果與討論：根據(jù)紫外檢測的洗脫峰位置，量出洗脫體積，重復(fù)測定12次，取其平均值，也可以計算出kav，分別由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的分子量。注 意 事 項（1）根據(jù)層析柱的容積和所選用的凝膠溶脹后柱床容積，計算所需凝膠干粉的重量，以將用作洗脫劑的溶液使

22、其充分溶脹。（2）層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小可根據(jù)實際需要選擇。一般來說，細(xì)長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時，會發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中心部分的組分移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。用于脫鹽的柱一般都是短而粗，柱長（l）/直徑（d）10；對分級分離用的柱，l/d值可以比較大，對很難分離的組分可以達(dá)到l/d=100，一般選用內(nèi)徑為1cm，柱長100cm就夠了。（3）各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)的排氣管應(yīng)無液體，并隨著柱下

23、口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。（4）裝柱要均勻，不過松也不過緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免因此而壓緊凝膠。但也不宜過慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過程中，凝膠床高度下降。（5）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動，導(dǎo)致分離效果變壞，不得不重新裝柱。（6）樣品溶液的濃度和粘度要合適。濃度大，自然粘度增加。一個粘度很大的樣品上柱后，樣品分子因運(yùn)動受限制，影響進(jìn)出凝膠孔隙，洗脫峰形顯得寬而矮，有些可分離的組分也

24、因此重疊。（7）洗脫用的液體應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同，否則，由于更換溶劑引起凝膠容積變化，從而影響分離效果。（8）操作壓過大可使流速變慢，此外還可以導(dǎo)致凝膠膠面下降，柱床容積的改變，相應(yīng)測出vt，vo，ve等也改變，造成實驗結(jié)果的誤差。（9）由于葡聚糖凝膠為糖類化合物，并且一定要在液相中操作，所以有必要注意防止發(fā)霉與生長細(xì)菌。一般可用0.02%的疊氮鈉（nan3）溶液，它極易溶于水，不與蛋白質(zhì)和糖反應(yīng)，也不改變它們的層析效果，也可用0.002%的洗必泰（hibitane）溶液。在弱酸性溶液中，可用0.05%（或0.01%0.02%）三氯丁醇溶液，但它在強(qiáng)堿性溶液或加熱到60以上時就要分解。在弱

25、堿性溶液中也可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑。因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能進(jìn)入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果。（10）使用部分收集器時，將其轉(zhuǎn)盤調(diào)節(jié)到最外圈，從第一管開始，否則會造成轉(zhuǎn)換臂的轉(zhuǎn)動與轉(zhuǎn)盤不同心，以致洗脫液流到管外。凝膠層析中常遇到的故障之原因與排除方法總結(jié)見表17-1。思 考 題1根據(jù)實驗中遇到的各種問題，概述做好本實驗的經(jīng)驗與教訓(xùn)。2概述本法蛋白質(zhì)分子量測定方法的基本理論與依據(jù)。表17-1 凝膠層析中遇到的故障、原因與排除方法故 障產(chǎn) 生 的 原 因排 出 的 方 法恒壓瓶不能恒壓1恒壓瓶上口或下口橡膠塞未塞緊或橡膠塞

26、插玻璃管處漏氣1找出漏氣原因，塞緊橡膠塞層析柱連接后，進(jìn)水口無液體滴出2層析柱進(jìn)水口或出水口的止水夾未打開3進(jìn)水口塑料管中有氣泡2打開止水夾3排除塑料管中的氣泡層析柱出水口無液體流出4出水口的止水夾未打開5層析柱下口螺絲未旋緊，因漏氣而造成出水塑料管中有氣泡6出水口塑料管被凝膠阻塞4打開出水口止水夾并調(diào)節(jié)流速5找出產(chǎn)生氣泡的原因，排除氣泡6將層析柱中的凝膠倒出，沖洗尼龍網(wǎng)排除塑料管中的凝膠，重新裝柱層析過程中流速逐漸減慢7樣品中或洗脫緩沖液中含有不溶顆粒將膠床表面阻塞8操作壓過高，將凝膠膠床壓緊9測定內(nèi)水時硫酸銨濃度太大；凝膠脫水使膠床壓緊10加樣時未注意恒壓，加樣后膠床床面下降11長期使用，

27、微生物生長12裝柱時凝膠未完全溶脹，平衡時流速即逐漸減慢13凝膠顆粒過細(xì)，或由于用暴力攪動凝膠使凝膠顆粒打碎7采用離心或過濾法除去不溶顆粒，用滴管移去柱床表面12cm的凝膠，補(bǔ)加新凝膠至同樣高度8重新裝柱，采用適當(dāng)?shù)牟僮鲏?將凝膠取出用緩沖液反復(fù)洗滌，溶脹重新裝柱。適當(dāng)降低硫酸銨濃度10加樣時應(yīng)根據(jù)操作壓，將塑料管下水口抬高至相應(yīng)的操作壓11層析柱不用時，在平衡緩沖液中加入0.02%疊氮鈉或0.002%洗必泰，并使其充滿柱床體積，以抑制細(xì)菌生長，暫時不用的柱應(yīng)定期用緩沖液過柱沖洗，也可以防止微生物生長12將凝膠取出，待其完全溶脹后重新裝柱13取出層析柱中的凝膠，用漂浮法除去過細(xì)的顆粒，重新裝柱

28、，攪拌凝膠應(yīng)防止暴力層析柱膠床中有氣泡14裝柱前，凝膠未抽氣或煮沸，在凝膠中混入空氣15加樣不當(dāng)使空氣進(jìn)入凝膠膠床16從冰箱中取出凝膠或凝膠緩沖液立即裝柱，或裝柱后被太陽暴曬14在凝膠柱上層的氣泡可用細(xì)頭長滴管或細(xì)塑料管將氣泡取出或趕走，并重新平衡，穩(wěn)定膠床后再使用，若氣泡太多則應(yīng)抽氣或煮沸后自然冷卻后裝柱15小心加樣防止帶進(jìn)氣泡16凝膠或緩沖液應(yīng)放置到室溫后才能裝柱，避免太陽直射層析柱膠床破裂17大量空氣進(jìn)入層析柱18進(jìn)水口流速慢，出水口流速快17找出空氣進(jìn)入層析柱的原因，重新裝柱18找出進(jìn)出水口流速不一致的原因，重新裝柱故 障產(chǎn) 生 的 原 因排 隊 的 方 法樣品進(jìn)入凝膠后條帶扭曲19樣

29、品或緩沖液中有顆粒或不溶物20凝膠表面不平，或膠床不均勻19按方法7處理樣品或緩沖液20將凝膠柱置于垂直位，輕輕攪動膠床表面12cm處的凝膠，使其自然沉降凝膠層析分辨率不高21凝膠層析柱裝得不均勻22凝膠g型選擇不當(dāng)23加樣量太大24柱床太短25樣品濃度高，粘度大而形成拖尾26洗脫時流速太快27分部收集時每管體積過大21將凝膠取出重新裝柱22根據(jù)欲分離物質(zhì)分離的情況，選擇合適的凝膠g型與粒度23為提高分辨率，分析時加樣量一般為柱長的12%，最多不能超過5%24將柱床高度適當(dāng)加長25根據(jù)紫外測定的光吸收值將樣品適當(dāng)稀釋26調(diào)節(jié)洗脫的流速，（本實驗為3ml/10min）27控制每管收集量，為便于紫

30、外測定，每管收集量以2.83ml為宜分部收集時，收集盤轉(zhuǎn)動一次間隔數(shù)只試管或滴管口偏離相應(yīng)的試管28使用前未經(jīng)定位或開始收集后隨便移動轉(zhuǎn)換臂，從而造成收集盤與轉(zhuǎn)換臂轉(zhuǎn)動不同步28將自動收集器換向開關(guān)撥向“順”，連續(xù)按手動開關(guān)，使收集盤與轉(zhuǎn)換臂同時以“順”時針方向轉(zhuǎn)至外圈零位。將換向開關(guān)撥至“逆”，使轉(zhuǎn)換臂的滴管口對準(zhǔn)第一個試管中心，打開自動開關(guān)即可進(jìn)行同步收集實驗十八 瓊脂糖凝膠電泳法分離ldh同工酶及血清ldh總活力的測定一、目的：1學(xué)習(xí)瓊脂糖聚膠電泳的原理和方法；2學(xué)習(xí)酶專一性染色原理及其應(yīng)用；3掌握分離ldh同工酶的方法；4學(xué)習(xí)測定血清ldh總活力的原理與方法。二、原理：能催化同一反應(yīng)而

31、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的酶，稱為同工酶。同工酶的蛋白結(jié)構(gòu)既然有差別，它們的理化性質(zhì)也就有所差異。因此可用電泳或其他方法將它們分離開來。例如乳酸脫氫酶（ldh）同工酶，它們都能催化乳酸脫氫產(chǎn)生丙酮酸，但經(jīng)電泳法分離后，就有5個同工酶區(qū)帶。由于同工酶在不同組織、器官中的分布不同，即具有組織器官特異性。因此已利用同工酶的酶譜作臨床診斷的依據(jù)，也被利用于生物分類及遺傳育種等工作中。本實驗是用瓊脂糖凝膠電泳法分離人血清乳酸脫氫酶五個同工酶（ldh1、ldh2、ldh3、ldh4、ldh5）。血清乳酸脫氫酶的輔酶是nad+。當(dāng)它催化乳酸脫氫時，nad+即被還原成nadh·h+。如果還有氧化型吩嗪二甲酯硫

32、酸鹽（n-methyl-phen-azo-nium-metho sulfate，簡稱pms）和硝基藍(lán)四唑（氮藍(lán)四唑nitroblue tetrazolium，簡稱nbt）存在，則發(fā)生如下反應(yīng)： nadh·h+pms nad+pms·h2 pms·h2+nbt pms+nbt·h2nbt·h2為藍(lán)紫色化合物。當(dāng)ldh同工酶區(qū)帶在瓊脂糖凝膠板上分開后，給予nad+、底物（乳酸）、pms和nbt，同工酶區(qū)帶即呈藍(lán)紫色。乳酸脫氫酶在輔酶i的遞氫作用下，使乳酸脫氫而生成丙酮酸。ldh分子量約14萬。草酸、乙二胺四乙酸對本酶有抑制作用，所以血漿不適宜測定乳

33、酸脫氫酶活力。此外，硼酸、汞離子、對氯汞苯甲酸以及過量的丙酮酸、乳酸也有抑制作用。乳酸脫氫酶催化反應(yīng)是碳水化合物代謝中無氧糖酵解的最終反應(yīng)，廣泛存在于人體各種組織中，按新鮮重量計算，乳酸脫氫酶活力依下列順序降低：腎臟心肌、骨胳肌胰脾肝肺。血清中含量很低，紅細(xì)胞中含量較血清約高100倍，故測定時應(yīng)避免溶血。如不能及時測定，血清應(yīng)及早和血塊分離，避免紅細(xì)胞中乳酸脫氫酶逸入血清中。乳酸脫氫酶測定的方法很多，根據(jù)酶作用的反應(yīng)可分為二大類：一類利用順向反應(yīng)以乳酸為基質(zhì)；另一類利用逆向反應(yīng)，以丙酮酸為基質(zhì)。根據(jù)測定方法不同又可分為紫外分光光度法和可見分光光度法。紫外分光光度法需用紫外分光光度計測定反應(yīng)中輔

34、酶i量的變化?？梢姺止夤舛确ɡ?，4二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕色。目前較多使用以乳酸為基質(zhì)的方法，此法所需的氧化型輔酶i較穩(wěn)定，不似以丙酮酸為基質(zhì)的方法需用的還原型輔酶i很不穩(wěn)定（在-20也不能長期保存）。氧化型輔酶i價格也較低。此外，乳酸鈉基質(zhì)液也比丙酮酸基質(zhì)穩(wěn)定，室溫中可放1個月。近來有人利用順向反應(yīng)形成的還原型輔酶i可以還原某些染料如2，6二氯酚-吲哚酚（2，6-dichlorophenol-indophenol）、氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑（int）建立了另外一種類型呈色反應(yīng)，并以吩嗪二甲酯硫酸鹽（pms）或黃遞酶（

35、diapho-rase）作為還原型輔酶i和染料之間的遞氫體。此法快速，操作簡單，重復(fù)性較好。乳酸脫氫酶同工酶顯色一般也多利用此類還原四唑藍(lán)方法。三、器材及試劑：1器材：人血清濾紙吸管0.2ml(×1)、1ml(×2)、2ml(×1)微量注射器50l（×1）恒溫水浴鍋。載玻片2.5×7.5cm（×2）試管水平臺；水平儀烘箱分光光度計凝膠成像系統(tǒng)坐標(biāo)紙電泳槽；電泳儀小鐵棒（2mm×15mm）、磁鐵2試劑：巴比妥-hcl緩沖液（ph8.4，0.1mol·l-1）：溶17.0g巴比妥鈉于600ml水，加入1mol·

36、;l-1hcl溶液23.5ml，再加蒸餾水至1000ml。0.5mol·l-1乳酸鈉溶液：稱取5.6g乳酸鈉，溶于蒸餾水并稀釋至100ml。0.001mol·l-1 edta·na2（乙二胺四乙酸鈉鹽）溶液：稱取edta·na2·h2o372mg，溶于蒸餾水并稀釋至100ml。0.5%瓊脂糖凝膠：溶50mg瓊脂糖于5ml巴比妥-hcl緩沖液（ph8.4，0.1mol/l），加蒸餾水5ml，待瓊脂糖溶化后，再加0.001mol·l-1 edta·na2溶液0.2ml，冰箱保存?zhèn)溆谩?.80.9%瓊脂糖染色膠：溶8090mg瓊脂

37、糖于5ml巴比妥- hcl緩沖液（ph8.4，0.1mol·l-1），加蒸餾水5ml，待瓊脂糖溶化后，再加0.001mol/l edta·na2溶液0.2ml，冰箱保存?zhèn)溆?。顯色液：現(xiàn)用現(xiàn)配。溶50mgnbt(硝基藍(lán)四唑)于20ml蒸餾水（25ml棕色容量瓶），溶解后，加入nad125mg及pms（吩嗪二甲酯硫酸鹽）12.5mg，再加蒸餾水至25ml。該溶液應(yīng)避光低溫保存，一周內(nèi)有效。如溶液呈綠色，即失效。2%醋酸緩沖液：2ml醋酸（99.5%）加蒸餾水98ml。電泳用緩沖液（ph8.6，0.075mol·l-1）；巴比妥鈉15.45g、巴比妥2.76g溶于蒸餾水

38、，稀釋至1000ml。0.1mol·l-1甘氨酸溶液：稱取甘氨酸7.505g，氯化鈉5.85g，用蒸餾水溶解并稀釋至1000ml。乳酸鈉緩沖基質(zhì)液(ph10.0)：在乳酸鈉溶液（6570%）10ml中加入0.1mol·l-1甘氨酸溶液125ml、0.1mol·l-1氫氧化鈉75ml，混和。輔酶i溶液：溶解輔酶i10mg于蒸餾水2ml中，冰箱保存，約可用6周。2，4二硝基苯肼溶液：稱取2，4二硝基苯肼200mg，先溶于10mol·l-1鹽酸100ml中，再以蒸餾水稀釋至1000ml。0.4mol·l-1氫氧化鈉。丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（1mol·

39、ml-1）：溶解丙酮酸鈉11mg于100ml乳酸鈉緩沖基質(zhì)液中（或取丙酮酸17.6mg，溶于200ml乳酸鈉基質(zhì)緩沖液中），臨用前配制。四、操作步驟：（一）瓊脂糖凝膠電泳法分離ldh同工酶。1瓊脂糖凝膠板的制備和電泳：將0.5%瓊脂糖凝膠水浴加溫熔化。取2ml熔化的凝膠液平澆于一潔凈的載玻片上（載玻片放在水平臺上，載玻片的大小為7.5×2.5cm）。在凝膠半凝固時，用一小鐵棒在1/3處放下，待膠凝固后，用磁鐵吸出小鐵棒，用濾紙片仔細(xì)吸去小槽內(nèi)液體，此小槽為點(diǎn)樣槽（圖18-1）用微量注射器向小槽內(nèi)加入新鮮血清1520l。將凝膠板放在電泳槽內(nèi)，兩端各以浸有電泳緩沖液的濾紙或紗布作鹽橋，點(diǎn)樣端靠近陰極。電泳4060分鐘，電壓約100伏。2顯色：約于電泳終止前10分鐘，將0.80.9%瓊脂糖染色膠在水浴中熔化。取此熔化的凝膠0.67ml與顯色液0.53ml及0.5mol·l-1乳酸鈉溶液0.2ml混勻，立即澆在電泳完畢的凝膠板上，37避光保溫1小時，即顯示出