HD交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用

1、h/d 交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用#袁航，劉艷，陳培燕，林東海，趙玉芬*5101520（廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005）摘要：氫氘交換和質(zhì)譜相結(jié)合的分析方法廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象及其動(dòng)力學(xué)研究，其具有樣品用量少、快速、靈敏、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。本論文著重從氫氘交換的原理及相關(guān)機(jī)制；影響氫氘交換的各個(gè)因素；氫氘交換質(zhì)譜法中常用質(zhì)譜檢測(cè)儀器，以及質(zhì)譜檢測(cè)分析法等四個(gè)方面進(jìn)行概述。關(guān)鍵詞：生物有機(jī)質(zhì)譜；氫氘交換；結(jié)構(gòu)生物學(xué)；綜述h/d exchange and mass spectrometry in structural biology

2、yuan hang, liu yan, chen peiyan, lin donghai, zhao yufen(key laboratory for chemical biology of fujian province, department of chemical biology,department of chemistry, college of chemistry and chemical engineering, xiamen university,fujian xiamen 361005)abstract: the combination of h/d exchange (hd

3、x) and mass spectrometry technology is widelyapplied to the kinetic and conformational studies of proteins. the hdx-ms method has someadvantages, such as fewer samples, fast detection and more sensitive than the traditional methods.in this review, we discussed four main contents in details, containi

4、ng the principle and themechanism of the exchange, the effects on the hdx, the application of the equipments, and thespecific hdx-ms methods.keywords: bioorganic mass spectrometry; h/d exchange; structural biology; review250 引言目前，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究方法主要包括 x-ray1，nmr2和 ms3等技術(shù)。x-ray 能夠獲得詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息，然而衍射效果好的蛋白質(zhì)晶體不容易得

5、到，耗時(shí)長(zhǎng)，往往事倍功半，因此這種方法具有很大的局限性4-7。nmr 和 ms 是研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)最常用的兩種工具，但303540是 nmr 對(duì)濃度的要求要高于質(zhì)譜 2 個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)核磁的檢測(cè)受到蛋白質(zhì)大小的限制，在30kda 的條件下才能夠準(zhǔn)確測(cè)定。此外，nmr 的靈敏度、蛋白質(zhì)的溶解度、分析時(shí)間的長(zhǎng)短、獨(dú)立氨基質(zhì)子的分配等也是 nmr 技術(shù)的障礙8。ms 可以在 fmol 水平上準(zhǔn)確分析分子量高達(dá)幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)的生物大分子，具有樣品消耗量少、分辨率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，并且能夠和其他的技術(shù)如液相色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行復(fù)雜樣品的分離分析9。從而通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)主鏈的氫氘交換

6、來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度。1993 年，zhang11等人將氫氘交換和 ms 聯(lián)用能夠在不改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的情況來(lái)探測(cè)蛋白質(zhì)的溶解度。nmr 和 h/d交換聯(lián)用可以測(cè)得蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)的氫氘交換率，但是有些氨基上的氫原子交換速率太快，對(duì)于絕大部分的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用的研究，采用 nmr 技術(shù)還是無(wú)法做到的12-14基金項(xiàng)目：教育部新教師基金（200803841009）作者簡(jiǎn)介：袁航，（1987-），女，研究生，主要研究方向：生物有機(jī)質(zhì)譜。通信聯(lián)系人：劉艷，(1976-)，女，副教授，主要研究方向:生物有機(jī)質(zhì)譜. e-mail: stacyliu-1-最初在 1954 年 havidt

7、10 等人發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)主鏈氨基上的氫原子能夠和溶液中的 d 交換，。mandell15等人將 maldi-tof ms 和 h/d 交換聯(lián)合起來(lái)并將其作為研究蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)配體相互作用的最佳手段。近年來(lái)，氫氘交換（hdx）質(zhì)譜分析法被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)配體相互作用16-17、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表征18、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)19-20、抗原決定部位的標(biāo)記21和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性22等研究領(lǐng)域，受到人們的廣泛關(guān)注。因此，本論文著重從氫氘交換45的原理及相關(guān)機(jī)制；影響氫氘交換的各個(gè)因素；氫氘交換質(zhì)譜法中常用質(zhì)譜檢測(cè)儀器，以及質(zhì)譜檢測(cè)分析法等四個(gè)方面作了簡(jiǎn)要的論述。1 氫氘交換原理及其相關(guān)機(jī)制1.1氫氘交換原理氫氘交換是

8、指蛋白質(zhì)、多肽鏈中支鏈上與雜原子（n,o,s）相連的極性氫原子、氮端和505560碳端的氫原子以及主鏈酰胺鍵中氨基氫原子與氘原子的交換。在中性條件下，支鏈上的極性氫原子交換時(shí)間是主鏈氨基氫原子的 103106 倍，其交換時(shí)間太快而無(wú)法測(cè)定，所以通常所說(shuō)的氫氘交換是指主鏈氨基上的氫與氘的交換。蛋白質(zhì)、多肽鏈中氫可分為三類(lèi)，如圖 1所示。圖.1 多肽鏈上的氫的種類(lèi)fig. 1 the types of hydrogen in the polypeptide chain圖 1 中，側(cè)鏈極性氫（type i，藍(lán)色）的交換速率非常快，影響其交換速率的因素有 ph和溫度；主鏈氨基氫（type ii，紅色）

9、的交換受溶液條件影響很大，ph 和溫度的降低通常會(huì)導(dǎo)致交換速率的降低，該類(lèi)氫常用于研究主鏈折疊和去折疊動(dòng)力學(xué)；直接與碳相連的氫（type iii，綠色）不會(huì)發(fā)生交換，因此可以忽略。1.2氫氘交換的相關(guān)機(jī)制氫氘交換機(jī)制有 ex1、ex2、exx、絡(luò)合陽(yáng)離子機(jī)制、延遲機(jī)制、鹽橋機(jī)制和觸發(fā)機(jī)制等，其中液相中最主要的是 ex1，ex2 機(jī)制，而氣相中氫氘交換比較復(fù)雜。651.2.1ex1，ex2 機(jī)制氫氘交換的位點(diǎn)會(huì)受到溶劑的屏蔽作用影響，穩(wěn)定氫鍵的存在會(huì)使交換過(guò)程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生波動(dòng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)交換動(dòng)力學(xué)和多肽鏈的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)相關(guān)23-25。在液相中，蛋白質(zhì)氨基的氫氘交換涉及兩種不同的反應(yīng)：1）蛋白質(zhì)

10、的折疊反應(yīng)，其可逆性會(huì)對(duì)氫鍵網(wǎng)絡(luò)造成擾動(dòng)；2）活潑氨基的同位素離子交換。因此整個(gè)的氫氘交換也受這兩個(gè)反應(yīng)的制約。通常是70考慮兩種極端的情況，也就是 ex1，ex2 交換機(jī)制，如圖 2 所示26：-2-圖.2 hdx 交換機(jī)制示意圖。a 為 ex1 機(jī)制，b 為 ex2 機(jī)制。fig. 2 the h/ d exchange mechanism. a: ex1; b: ex275ex1 機(jī)制（圖.2 a）中，氫氘交換速率 k2 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于重新折疊的速率；而 ex2 機(jī)制（圖.2b）中，重新折疊和內(nèi)在的氫氘交換反應(yīng)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，只有在發(fā)生了一部分重新折疊反應(yīng)后，氫氘交換才能進(jìn)行完全。ex 機(jī)制用公式表

11、示如下式 1 所示27：x hclosedkopx hopenkchexchangekcl808590其中，kop 和 kcl 分別是特定交換位點(diǎn)的開(kāi)關(guān)速率常數(shù)，kch 為化學(xué)交換速率常數(shù)，可以表征完全未被保護(hù)的氫的交換動(dòng)力學(xué)，對(duì)于氨基上的氫，某位點(diǎn)上 kch 值取決于其相鄰的氨基酸側(cè)鏈和 pd 值 (pd=ph+0.4)28。在 ph4 時(shí)，化學(xué)交換速率受堿催化的影響，因此 kex隨著 ph 的增加而增大，因此可以依據(jù) kex 隨 ph 的變化來(lái)判斷 ex1 和 ex223。從二肽模型化合物中獲得的參考數(shù)據(jù)對(duì)于任意溶劑條件下的 kch 值的評(píng)估很有參考價(jià)值29-31。在 ex2 機(jī)制中，kc

12、l>>kch，整體的交換速率常數(shù)為 kex 。kex = kop·kch，則 kop=kop/kcl是特定位點(diǎn)打開(kāi)反應(yīng)的速率常數(shù)，在 ex2 條件下，在交換反應(yīng)未發(fā)生之前許多的位點(diǎn)處于打開(kāi)的構(gòu)象狀態(tài)。相反的，在 ex1 條件下，kch>>kcl，在蛋白質(zhì)的開(kāi)放區(qū)域?qū)?huì)發(fā)生完全的氘標(biāo)記，此時(shí) kex=kop32在自然狀態(tài)下，氨基 hdx 會(huì)遵循 ex2 機(jī)制，但是在蛋白質(zhì)失活的條件下，交換更傾向于 ex133-37。如果某種蛋白質(zhì)有兩種構(gòu)象，當(dāng)交換速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于構(gòu)象轉(zhuǎn)換速率時(shí)，質(zhì)譜會(huì)檢測(cè)到雙峰（ex1）；如果結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于交換速率時(shí)，只可能檢測(cè)到單峰，此時(shí)采

13、用的是 ex2 機(jī)制，如圖 3 所示：從圖 3 可以看出 hmb 在標(biāo)記時(shí)間達(dá) 2.1s 時(shí)出現(xiàn)雙峰，這是由于 ex2 機(jī)制下其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，并且質(zhì)量大的碎片峰逐漸升高，質(zhì)量小的逐漸消失，這是由于 ex1 機(jī)制的作用。-3-95100圖.3 特定時(shí)間的 amb（apomyoglobin）（a-d）和 hmb（holomyoglobin）(e-h)的同位素交換圖（灰線代表儀器的干擾線，黑線是動(dòng)力學(xué)模型線）32fig.3 isotope exchange behavior diagrams observed for ions amb4+（apomyoglobin）（a-d）and hmb8+（h

14、olomyoglobin）(e-h). the gray lines represent experimental noise, and smooth black lines are stimulated peakshapes, calculated from a kinetic model.1.2.2氣相條件下的氫氘交換機(jī)制相比之下，氣相條件下的氫氘交換機(jī)制則要復(fù)雜得多，campbell 教授38就曾提出了一些機(jī)制。對(duì)于蛋白質(zhì)氣象條件下的 hdx，由液相中的氫氘交換類(lèi)推，開(kāi)放的去折疊部分的105110氘代量比折疊部分的氘代量大。雖然折疊部分和氘代量之間的關(guān)系未知，但是如果交換率和交換量不同，

15、那么可以推斷構(gòu)象也不同，但是如果交換率和交換量相似，則可以說(shuō)明構(gòu)象也是相似的。2 影響氫氘交換的因素n-h,o-h 和 s-h 中的活潑氫原子可以和 d2o 中的 d 交換，反應(yīng)非常劇烈，但是其交換速度受到底物蛋白中活潑氫原子的化學(xué)環(huán)境影響，包括蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)、氫鍵和溶劑的屏蔽效應(yīng)。同時(shí)也包括溶液的 ph、溫度及溶劑的極性，這些因素為質(zhì)譜檢測(cè)條件的改進(jìn)提供了一個(gè)依據(jù)。多肽氨基質(zhì)子同位素交換率依賴(lài)于其是否參與分子內(nèi)氫鍵和溶劑的屏蔽程度。因?yàn)榉肿觾?nèi)氫鍵和溶劑的屏蔽作用會(huì)直接關(guān)系到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，利用氨基化合物的氫交換率可以進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的快速探測(cè)。1152.1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)主鏈氨基上的氫原子交換速率

16、則主要受蛋白質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的影響。一般暴露在溶劑中的氨基氫可以和溶劑快速交換，因此在 折疊和 螺旋中，當(dāng)有穩(wěn)定的氫鍵存在時(shí)，氫氘交換的速率降低39。如果主鏈氨基難以接近溶劑或存在于一個(gè)穩(wěn)定的氫鍵中，就需要通過(guò)瞬時(shí)性的結(jié)構(gòu)改變并伴隨更慢的動(dòng)力學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)交換40。1202.2ph 值蛋白質(zhì)的 n,o,s 上的氫很容易和氘發(fā)生反應(yīng)，并且受到水合氫離子和氫氧根離子的催化，因此，氫氘交換率很容易受到 ph 的影響41。通過(guò)對(duì)不同的 ph 條件下氨基酸氫氘交換率的比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)處于生理?xiàng)l件下，氫氘交換率最高，但是當(dāng) ph 條件處于 23 之間時(shí)，交換率達(dá)到最低，并可以以此作為蛋白質(zhì)猝滅的條件之一 (圖.4)。多肽

17、周?chē)娜芤?ph 對(duì)于-4-125130氫氘反交換（back change）影響最大。因此，在發(fā)生猝滅反應(yīng)后，流動(dòng)相的 ph 也是必須注意的。氫氘反交換的程度和流動(dòng)相的 ph 有關(guān)，因?yàn)榉唇粨Q的量隨著流動(dòng)相中酸 pka 的增加而降低。但是質(zhì)譜信號(hào)卻是會(huì)隨著酸增強(qiáng)而降低。有時(shí)候?yàn)榱双@得比較好的信號(hào)，通常會(huì)提高流動(dòng)相的 ph 或者是少用酸42 。圖 4. 多肽主鏈氨基的氫氘交換速率常數(shù)隨 ph 的變化圖fig.4 the exchange rate of h and d in the backbone chain of polypeptide2.3溫度43在進(jìn)行氫氘交換反應(yīng)之前，各種質(zhì)譜條件需要進(jìn)

18、行優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)最佳的信噪比（s/n）和135140高氘代量，同時(shí)也要保證在分離過(guò)程中的反交換量最低。這里所說(shuō)的溫度包括猝滅溶液溫度、水浴溫度以及毛細(xì)管的溫度。其中猝滅溶液的溫度在實(shí)驗(yàn)允許的誤差范圍內(nèi)對(duì)于氫氘交換的進(jìn)行無(wú)影響；水浴的溫度在某種程度上會(huì)對(duì)反交換的程度造成很大的影響；流動(dòng)相的溫度從0到 1，反交換的量也會(huì)隨之降低。在通常情況下，毛細(xì)管的溫度越低，氘代量就越大。溫度的改變對(duì)于那些質(zhì)荷比較小的碎片離子影響不大。毛細(xì)管溫度越低，對(duì)于那些電荷量較低，但是質(zhì)荷比較高的離子來(lái)說(shuō)，氘代的量越大。但是這種關(guān)系并不是絕對(duì)的，因?yàn)榈侥壳盀橹惯€無(wú)法給出氘代量和毛細(xì)管溫度的完整解釋?zhuān)⑶覝囟仍礁?，儀器的信噪比

19、越大，這就需要尋找一種兼顧的方法來(lái)獲得最佳的溫度條件。2.4溶劑氨基酸殘基的氫氘交換率也和試劑有關(guān)，常用的氘代試劑有 d2o，cd3od，cd3co2d，145150155nd3 等。在堿性條件下，d2o<cd3od<cd3co2d<nd3。d2o 能夠有力的判斷出氫氘交換是否發(fā)生，nd3 可以和多肽鏈上所有的活潑氫發(fā)生交換。在 nd3 中，氮端氫交換并伴隨著絡(luò)合陽(yáng)離子的形成，同時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)換，氮端的氫轉(zhuǎn)移到?；?，方向與氨基質(zhì)子和溶劑的交換方向一致。碳端的氫則通過(guò)鹽橋進(jìn)行質(zhì)子交換，在電荷中心產(chǎn)生穩(wěn)定的離子對(duì)。隨著溶劑堿性的減弱，碳端的交換率降低，所采用的機(jī)制為多電荷中心觸發(fā)

20、機(jī)制。對(duì)于 d2o，由于不能吸收足夠的能量克服質(zhì)子親和力，因此氨基質(zhì)子的交換要低于氮端氫離子44。orit geller45等人對(duì) l-精氨酸的氣相氫氘交換在 nd3 和 ch3od 的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比時(shí)發(fā)現(xiàn)，ch3od 的反應(yīng)速率明顯低于 nd3，這是因?yàn)?ch3od 的質(zhì)子親和力（protein affinity）(pa=180.3kcal/mol)低于 nd3(pa=204kcal/mol)，并由此推斷氫氘交換在兩種溶劑中的機(jī)理可能會(huì)有所不同。nd3 堿性強(qiáng)極易被大多數(shù)的氨基酸和多肽質(zhì)子化，然而 ch3od 則不那么容易使它們?nèi)ベ|(zhì)子化，推測(cè)其可能是通過(guò)延遲機(jī)制進(jìn)行反應(yīng)46-47。-5-3 質(zhì)

21、譜檢測(cè)儀器3.1esi-ms電噴霧質(zhì)譜是在毛細(xì)管的出口處施加一個(gè)高電壓，將從毛細(xì)管中流出的溶液霧化為帶電160165170小液滴，隨著溶劑的蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后隨著液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍。它可以方便的與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如 lc-ms 用來(lái)分離檢測(cè)大分子物質(zhì)。esi 在正離子模式下會(huì)產(chǎn)生完整的多電荷的氣相蛋白質(zhì)離子，這種質(zhì)子化反應(yīng)使得多肽的結(jié)構(gòu)變得敏感。在液相條件下，去折疊狀態(tài)的構(gòu)象會(huì)比折疊構(gòu)象的蛋白質(zhì)帶上更多的電荷4

22、8-50溶液中的共存構(gòu)象51-53。 通常情況下 esi 能夠使完整的非共價(jià)化合物轉(zhuǎn)換成氣相，使之易于檢測(cè)54-58。esi-ms 的優(yōu)勢(shì)在于能夠監(jiān)測(cè)液相中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)提供金屬離子，輔基或其他蛋白質(zhì)的非共價(jià)作用信息59-61。當(dāng) esi-ms 和在線氫氘交換相聯(lián)系，能夠獲得額外的結(jié)構(gòu)尺寸信息62-63。3.2maldi-ms基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜技術(shù)（maldi-ms）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收輻射能量迅速升高并快速產(chǎn)熱使基質(zhì)晶體升華，基質(zhì)和分析物由此進(jìn)入氣相，maldi 所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中175180185

23、的離子，多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。maldi 產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)，適合于蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子的研究64。采用 maldi-tof 來(lái)檢測(cè)氫氘交換時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)樣品中有殘余的 hod，這些 hod 會(huì)和部分側(cè)鏈上的 nh 和 oh 發(fā)生快速交換65，但是主鏈氨基交換速率不大，并且在猝滅條件下輕微可逆。由于側(cè)鏈上的 nh 和 oh 也會(huì)發(fā)生氘化作用，因此需要用氫氘交換的總量去除側(cè)鏈部分的交換量（或比例）即可獲得主鏈氨基交換量（或比例）。但是，esi-ms 中，則檢測(cè)不到 hod 的殘留。因此可以通過(guò)消除這種交換來(lái)精確的測(cè)定主鏈氨基交換的數(shù)量和比例，而 esi-m

24、s 卻無(wú)法做到66。各種氨基酸側(cè)鏈氫氘交換數(shù)量總結(jié)于表 1，由于 maldi-ms 所獲得的多肽片段均帶一個(gè)電荷，通常測(cè)得結(jié)果是碳端含有一個(gè)質(zhì)子，即為 cooh，而氮端獲得一個(gè)質(zhì)子成為 nh3+。特定多肽的快速氫交換的總數(shù)就是每個(gè)多肽側(cè)鏈數(shù)與碳端、氮端的四個(gè)快速交換氫數(shù)目之和。表 1. z=+1, ph=2.5 時(shí)，每種氨基酸殘基的快速氫交換數(shù)目table 1. the number of fast-exchanging hydrogen of each amino acids residue type with z=+1, ph=2.5 by ms各種氨基酸的快速氫交換數(shù)目a=0g=0m=0

25、s=1c=1h=1n=2t=1d=1i=0p=0v=0e=1k=2q=2w=1f=0l=0r=4y=11904 質(zhì)譜檢測(cè)方法4.1蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜檢測(cè)法以蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶( ptp)為例，其每個(gè)肽段通常會(huì)產(chǎn)生 515 個(gè)殘基，通過(guò)控制 ph-6-。 在溫和的氘代條件下，esi 的電荷分布通常會(huì)出現(xiàn)多重峰的狀態(tài)，這樣就可以解釋和降低溫度使得主鏈氨基的交換速度達(dá)到最低，但在此條件下，其他部分的氫氘交換速率卻增大，在分析過(guò)程中可以通過(guò)液相色譜將這部分洗脫出去。195200205210215220225當(dāng)折疊蛋白質(zhì)在理想的 pd 下溶于 d2o 緩沖液中，不斷地降低 pd 直至 2.4，溫度降至 0時(shí)，

26、肽鍵氨基同位素交換停止，在此條件下肽鍵氨基的同位素半衰期是 30120 分鐘，為了降低人為的同位素交換，同位素的分析檢測(cè)必須在幾分鐘內(nèi)完成。為了將同位素交換控制在小的特定區(qū)域內(nèi)，酸性蛋白酶可以用來(lái)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為多肽。同位素的猝滅條件可以通過(guò)酶解來(lái)控，為了降低酶解時(shí)間（< 10min），通常使用大量的胃蛋白酶（培養(yǎng)基: 酶=1:1）。然后通過(guò) hplc-ms 來(lái)檢測(cè)胃蛋白酶酶解的碎片分子質(zhì)量，從而獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)碎片的氘代情況。蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜檢測(cè)法的氫氘交換流程如圖 5 所示。圖 5. 氫氘交換流程圖（ptp: protein tyrosine phosphatase）40fig.5 the

27、 flow chart of hdx (ptp: protein tyrosine phosphatase)在 hplc 的質(zhì)子流動(dòng)相中，氘標(biāo)記位點(diǎn)快速改變，比如支鏈或者氮端氫被取代，因此分子質(zhì)量增加。由于胃蛋白酶對(duì)于肽鍵的酶解并沒(méi)有特異性，因此不能單獨(dú)通過(guò)多肽碎片的質(zhì)量變化來(lái)鑒定。雖然蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜法能夠克服蛋白質(zhì)濃度、尺寸、純度和復(fù)雜性的問(wèn)題，但是實(shí)際上這些優(yōu)勢(shì)會(huì)因?yàn)闃悠废♂尪档?。該方法多用于蛋白質(zhì)折疊、構(gòu)象分析，配體誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化及配體結(jié)合熱力學(xué)等研究。用于 hdx-ms 的酸性蛋白酶靈敏度低，并且得到大量非特異性的肽段，這些產(chǎn)物峰低于同等條件下胰蛋白酶的酶解產(chǎn)物。由于 hdx-ms 在

28、>90% d2o 中進(jìn)行，稀釋了蛋白質(zhì)樣品，減弱了信號(hào)強(qiáng)度，使得肽段的質(zhì)譜信號(hào)峰變寬67 。hdx-lc/ms 的局限性在于氫氘反交換的發(fā)生68，并且只能夠檢測(cè)到 510 個(gè)殘余物，這是由蛋白質(zhì)水解所得的碎片尺寸有關(guān)69。因此，人們采用 top-down 方法來(lái)取代酶解技術(shù)，將完整的氣相蛋白質(zhì)離子碎片導(dǎo)入質(zhì)譜儀真空管中70-71。通常采用的 top-down 方法包括ecd（electron capture disociation）72-73，cid 及 etd（elctron transfer dissociation）74-75。最早人們多采用 cid 技術(shù)，但是 cid 技術(shù)會(huì)發(fā)生

29、分子內(nèi) h/d 轉(zhuǎn)移76-80，然而 etd 和 ecd技術(shù)因?yàn)椴粫?huì)在樣品界面產(chǎn)生碰撞熱而檢測(cè)不到明顯的分子內(nèi)氫氘轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。ecd-hdx-ms 將主鏈裂解，形成大量 c 和 z 碎片離子81，并且在分裂過(guò)程能夠保持液相條件下的多肽形式82-85。etd-hdx-ms 也可以進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)78-79。酶解質(zhì)譜法和 top-down質(zhì)譜法的流程比較如圖 6 所示。用 “top-down”取代酶解步驟，在氣相中將蛋白質(zhì)分解成完整的離子碎片83。這種方法具有以下優(yōu)勢(shì)：1）在慢交換的條件下避免反交換的進(jìn)行；2）能夠獲得天然86或非天然狀態(tài)87-88下的蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)信息，同時(shí)能夠得到蛋白質(zhì)配位鍵

30、89在蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)上所起的作用；3）最大的優(yōu)勢(shì)在于能夠在離子被活化之前采用質(zhì)量選擇方法將參與同位素交-7-換的部分和特定的蛋白質(zhì)構(gòu)象聯(lián)系起來(lái)，從而獲得來(lái)自于特定構(gòu)象下的特定蛋白質(zhì)的氘代碎片。其劣勢(shì)在于氣相中質(zhì)子同蛋白質(zhì)碎片離子的隨機(jī)結(jié)合。事實(shí)上，已有報(bào)道顯示氣相中質(zhì)230235子的流動(dòng)性缺失會(huì)對(duì) hdx-cad-ms 氣相中短肽鏈的測(cè)定造成影響90。 ecd 和 etd 技術(shù)能夠提供完全的序列，尤其是大分子量的多肽，但是這兩種蛋白質(zhì)離子的活化方法需要更高的分辨率才能夠探測(cè)到蛋白質(zhì)的構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)信息。 總之 top-down 技術(shù)的硬傷在于質(zhì)子的隨機(jī)性結(jié)合。最新研究發(fā)現(xiàn)這種隨機(jī)行為取決于離子形成

31、初期的電荷狀態(tài)，當(dāng)初期高電荷密度低離子被碰撞活化，質(zhì)子的流動(dòng)性就被大大的抑制住了。圖 6 酶解質(zhì)譜法和 top-down 質(zhì)譜法的流程比較86fig 6. the comparison diagram of enzyme digestion and top-down ms method2404.2suprex91 - （ stability of unpurified proteins from rates of h/dexchange）該方法采用氫氘交換和 maldi-ms 相結(jié)合的技術(shù)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)熱力學(xué)穩(wěn)定自由能（3少，可對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)化合物進(jìn)行分析的優(yōu)勢(shì)96。kendall 等人92根據(jù)g

32、f 隨著結(jié)合常數(shù)的變化而變化的特點(diǎn)，通過(guò)考察蛋白質(zhì)的gf 來(lái)研究蛋白質(zhì)配體的結(jié)合常數(shù)。suprex 亦245可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的去折疊自由能（gu）93，但是要求氫氘交換在 ex2 下進(jìn)行（蛋白質(zhì)重新折疊的速率比未保護(hù)氨基質(zhì)子的交換速率快得多）。4.3plimstex-（mass spectrometry，titration and h/d exchange）該方法是依靠滴定過(guò)程中的氫氘交換導(dǎo)致質(zhì)譜中 m/z 值的變化，通過(guò)改變滴定過(guò)程中配體的濃度來(lái)繪制滴定曲線，最終得到m和配體濃度曲線，與 suprex 相比無(wú)需變性劑，250255能夠適應(yīng)各種蛋白、配體、緩沖液、鹽濃度、ph 和溫度94。pli

33、mstex 廣泛用于量化溶液中蛋白質(zhì)與配合物的作用95；測(cè)定結(jié)合的化學(xué)計(jì)量和寬范圍的配合物相互作用親和力96及評(píng)價(jià)各種模型結(jié)合常數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度97等研究領(lǐng)域。蛋白質(zhì)配體化合物的氫氘交換研究的目的大多在于分離蛋白質(zhì)及其蛋白質(zhì)配體化合物。在分析前進(jìn)行蛋白質(zhì)的消化和 ms/ms 的使用，使信息水平提高至多肽甚至是氨基酸38。通常使用 plimstex（h/d exchange ，maldi-ms ）技術(shù)，可以獲得蛋白質(zhì)配體的 kd，依此來(lái)進(jìn)行溶液中蛋白質(zhì)配體結(jié)合熱力學(xué)的量化分析。 plimstex 還可應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象的-8-gf） 。不論是體內(nèi)還是體外蛋白，該方法對(duì)于gf 的測(cè)定具有高準(zhǔn)確性、

34、高精密性、用料變化、結(jié)合常數(shù)計(jì)量和寬范圍的蛋白質(zhì)配體相互作用研究，包括小分子，金屬離子和多肽與蛋白質(zhì)的相互作用98。2602652702752802852902953003053105 結(jié)論本論文著重從氫氘交換的原理及相關(guān)機(jī)制；影響氫氘交換的各個(gè)因素；氫氘交換質(zhì)譜法中常用質(zhì)譜檢測(cè)儀器，以及質(zhì)譜檢測(cè)分析法等四個(gè)方面對(duì) h/d 交換質(zhì)譜分析法在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行概述。但是,該技術(shù)的應(yīng)用還有些不足之處。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大，許多多肽會(huì)發(fā)生多重的同位素交換，并且蛋白質(zhì)的不同亞組也會(huì)出現(xiàn)同分異構(gòu)體的碎片峰，因此經(jīng)過(guò)胃蛋白酶水解后得到的碎片會(huì)出現(xiàn)大量的質(zhì)譜峰重疊。通過(guò)采用 13c 或者 15n 標(biāo)記

35、可以降低這些干擾，提高碎片離子的信噪比，消除質(zhì)荷比值的模糊性以獲得準(zhǔn)確的多肽片段同位素峰。由于沒(méi)有明確的證據(jù)顯示氣相和液相的構(gòu)象相似性，用 esi-ms 的氣相數(shù)據(jù)來(lái)表示液相的非共價(jià)鍵作用似乎還存在爭(zhēng)議。因此今后可以考慮將液相和氣相化學(xué)聯(lián)系起來(lái)作為深入表征生物分子結(jié)構(gòu)的工具，并努力拓展 hdx 的應(yīng)用領(lǐng)域，尋找出更靈敏、更精確的檢測(cè)方法。參考文獻(xiàn) (references)1 raino k h, broadhurst r w.hydrogen/deuterium exchange of hydrophobic peptides in model membranes byelectrospray

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