醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究

1、第2章 醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究第2章 醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件研究2.1 引言醋酸菌包括醋酸桿菌屬和醋酸單胞菌屬30，又名醋酸細(xì)菌。醋酸菌的細(xì)胞一般為桿狀、直或者稍彎，也有少部分像橢圓形，由單個、成對或者成鏈狀排列的，大小一般在0.60.8×1.03.0 m。醋酸菌沒有芽胞是革蘭氏陰性菌，它有的細(xì)胞是周生鞭毛種類，一般在液面上生長會形成較厚的菌膜。黑色醋酸桿菌等為另一些種類的醋酸菌細(xì)胞是端生鞭毛。醋酸菌的分布廣泛，在未滅菌的醋、啤酒、黃酒中果酒，以及在果園的土壤中、葡萄或酸敗食物表面中都有生長31。醋酸菌是釀醋過程中不可缺少的。醋酸菌在發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生大量的醋酸和其他有機(jī)

2、酸，而且還有醇類32。本章節(jié)研究醋酸菌的分離鑒定和發(fā)酵條件，通過平板分離、革蘭氏染色、產(chǎn)醋酸實(shí)驗，并經(jīng)生理生化鑒定和查閱伯杰氏手冊，做出進(jìn)一步鑒定。2.2 實(shí)驗材料與方法2.2.1材料與儀器分離樣品：取自湖北某果醋廠發(fā)酵的醋醅。試驗主要儀器設(shè)備型號及產(chǎn)地如表2.2.1.a。表2.2.1.a 主要儀器設(shè)備 tab 2.2.1.a main instrument equipment主要儀器型號廠家生化培養(yǎng)箱雙目生物顯微鏡分析天平手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋超凈工作臺精密數(shù)字式酸度計pyx-250s-abme（ba/e3）bs224sdsx-280bsw-cj-1fdphs-3c長沙科技科力儀器德國萊卡北

3、京化豐上海南鵬上?？萍荚囼炘噭?葡萄糖、酵母膏、甘油、無水乙醇(95%)、caco3、(nh4)2so4、k2hpo4、kh2po4、mgso4·7h2o、fecl3、乙酸鈣、乳酸鈣、濃硫酸均為分析純；瓊脂食用級。2.2.2培養(yǎng)基33-37表2.2.1. 培養(yǎng)基成分表tab 2.2.1.medium composition名稱葡萄糖酵母膏無水乙醇(v/v)瓊脂caco3備注基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基1%1%3%ph 4. 5分離培養(yǎng)1%1%3%2%2%ph自然斜面保藏培養(yǎng)基1%1%3%2%1%ph自然液體保藏培養(yǎng)基1%1%1%ph自然改進(jìn)后的斜面液體保藏培養(yǎng)基1%1%3%2%1%ph自然發(fā)酵培

4、養(yǎng)基1%1%7%ph 4. 5horyer-frateur培養(yǎng)基3%ph自然gyc培養(yǎng)基10%5%2%2. 5%ph自然高糖培養(yǎng)基30%1%2%2%ph自然生酮培養(yǎng)基3%2%甘油3%產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基3%1%2%2%ph自然氧化乙酸培養(yǎng)基1%1%2%乙酸鈣1% ph 7.2氧化乳酸培養(yǎng)基1%1%2%乳酸鈣2% ph7.0-7.2乙醇培養(yǎng)基1%3%2%ph自然注：培養(yǎng)基在斜面保藏培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)24 h，加入無菌碳酸鈣，灌入并液體培養(yǎng)基到斜面上，至離管口2cm處，密封冷藏；培養(yǎng)基其他成分有(nh4)2so40.1%，k2hpo40.1%， kh2po40. 01%，0.025%，fec

5、l30. 0005%；以上培養(yǎng)基均以121滅菌20 min。2.2.3醋酸菌的分離純化2.2.3.1 分離純化實(shí)驗稱取醋醅樣品5g，液態(tài)增殖培養(yǎng)48h后，按照濃度梯度10-6、10-7和10-8，涂布在分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2d后，挑取平板上單個透明圈大的菌落。連續(xù)在平板上培養(yǎng)3次，觀察其菌落形態(tài)是否一致，選取透明圈又大又清晰的單菌落，轉(zhuǎn)接并保藏于4的冰箱。2.2.3.2 革蘭氏染色實(shí)驗將上述活化后的菌株，接種于新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，制作水晶鏡片進(jìn)行革蘭氏染色。2.2.3.3 產(chǎn)醋酸定性實(shí)驗38取活化好的斜面菌種，分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，并加入3% (v/v) 的無水乙醇， 32震蕩培養(yǎng)60

6、h，取少量除去菌體的培養(yǎng)液，用naoh溶液（2.5 mol/l）調(diào)節(jié)ph至7.0，加入56滴5% fecl3溶液，產(chǎn)醋酸細(xì)菌會形成紅褐色沉淀。根據(jù)2.2.3.3試驗和2.2.3.4試驗結(jié)果，篩選出革蘭氏陰性且產(chǎn)醋酸的細(xì)菌39為醋酸菌。2.2.3.4 醋酸定量實(shí)驗經(jīng)過初步篩選后，把所得菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32、140 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)60 h后，檢測其發(fā)酵液中總酸，每株平行3組。醋酸定量測定40：精確吸取發(fā)酵液2 ml至250 ml三角瓶中，并加入蒸餾水50 ml，滴加12 滴0. 5%的酒精酚酞溶液，用已標(biāo)定過的0.1 mol/l naoh溶液滴定至微粉色。產(chǎn)酸量(g/l)=(v-

7、v0)×cnaoh×60/樣品毫升數(shù)；式中：v=發(fā)酵液樣品滴定耗用的naoh毫升數(shù)；v0=以空白培養(yǎng)基為對照滴定耗用的naoh毫升數(shù)；cnaoh=naoh溶液的濃度(mol/l)； 60為醋酸分子量。2.2.3.5耐酒精能力實(shí)驗初篩所得的菌株，分別接種到含有無水乙醇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)從5%到14%，每個梯度相差1%，32恒溫培養(yǎng)3d，觀察其是否生長，篩選出耐酒精性能好的菌株。2.2.3.6 傳代穩(wěn)定性實(shí)驗41將上述所篩選出的菌株，每隔一個月，轉(zhuǎn)接純化后的菌株，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)7代，并測定其酸度，來判斷、篩選，傳代最穩(wěn)定和產(chǎn)醋酸最高的菌株。2.2.3.7 不同保

8、藏方法保藏醋酸菌的存活期限實(shí)驗43將傳代相對穩(wěn)定性的菌株，分別按照培養(yǎng)基2.2.2中的、轉(zhuǎn)接，待斜面上菌苔豐厚，保藏于24的冰箱內(nèi)，每隔三個月再次轉(zhuǎn)接，并觀察其存活情況。2.2.4 菌種鑒定實(shí)驗44-452.2.4.1 培養(yǎng)實(shí)驗觀察通過平板培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，并挑取單個菌落制做水晶片，革蘭氏染色，同時在1000倍光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)、大小和排列特征。2.2.4.2 培養(yǎng)特征實(shí)驗觀察所選菌株在平板上培養(yǎng)的情況；觀察所選菌株是否能在高糖培養(yǎng)基上生長；觀察所選菌株是否能在hoyer-frateur培養(yǎng)基上生長。2.2.4.3 生理生化實(shí)驗46接觸酶的試驗：在長勢旺盛的平板上，滴加3%的h2

9、o2，觀察有無氣泡產(chǎn)生。以銨鹽為唯一氮源的生長試驗：觀察在培養(yǎng)基2.2.2中中生長情況。gyc培養(yǎng)基產(chǎn)色素試驗：觀察在培養(yǎng)基2.2.2中上能否生成棕色的水溶性色素。生酮試驗(甘油生成二羥丙酮的試驗)：在培養(yǎng)基2.2.2中上，將費(fèi)林液注滿平板，觀察菌落周圍是否有紅色沉淀出現(xiàn)。 產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽試驗：在培養(yǎng)基2.2.2中上，32培養(yǎng)24 h后，觀察菌落周圍是否有白色不透圈。葡萄糖產(chǎn)酸試驗：觀察培養(yǎng)基指示劑是否變色。產(chǎn)纖維素試驗：在含糖培養(yǎng)基上向菌落上滴加lugol碘液和60%硫酸液，觀察菌落周圍變化情況。氧化乙酸的能力試驗：在培養(yǎng)基2.2.2中上，32培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)乳白色的

10、暈圈。氧化乳酸的力試驗：在培養(yǎng)基2.2.2中上，32培養(yǎng)48 h，觀察菌落周是否出現(xiàn)乳白色的暈圈。在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基上，觀察其能否生長。2.2.5 發(fā)酵條件實(shí)驗發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗以培養(yǎng)溫度為梯度，26、28、30、32、34、36，將篩選所得的菌種，分別接種于裝有100ml醋酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，置于180r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)72h，以產(chǎn)酸量和醋酸菌數(shù)來確定最佳生長條件。將篩選所得的菌種，分別接種于分離平板上，觀察出現(xiàn)透明圈的時間，確定最快產(chǎn)酸時間。2.3 結(jié)果與分析2.3.1 分離篩選分離純化：從分離平板中挑選出107個單菌落菌株。初步篩選：通過醋酸菌分離培養(yǎng)基篩選

11、，選出44個單菌落產(chǎn)酸菌株。復(fù)篩：又經(jīng)革蘭氏染色和醋酸定性試驗，淘汰了革蘭陽性及不產(chǎn)醋酸的菌株，選出4株醋酸菌株。產(chǎn)酸定量試驗，篩選出產(chǎn)酸量大最快的菌株，結(jié)果見下圖2.3.2.a 圖2.3.1.a 4株醋酸菌產(chǎn)酸量測定fig 2.3.1.a four strains in determination of acid acetic acid bacteria耐酒精能力試驗，篩選出耐酒精性能好菌株，結(jié)果見下圖2.3.2.b 圖2.3.1.b 4株醋酸菌耐酒精測定fig 2.3.1.b 4 of acetic acid bacteria resistant to alcohol determinat

12、ion然后繼續(xù)對2株性能較好菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確定其傳代的穩(wěn)定性。每一代產(chǎn)酸量見下表2.3.1.a。 表2.3.1.a 4珠醋酸菌傳代培養(yǎng)每代產(chǎn)醋酸的測定(g/l)tab 2.3.1.a 4 strains acetic acid bacteria in each generation nestin) cultivating the determination of acetate(g/l)菌株號x1x2x3x41代38.230.931.341.82代39.431.531.543.43代38.330.430.142.34代37.427.326.340.65代35.127.922.738.76代

13、30.624.119.536.97代28.421.814.735.5由表2.3.1.a可以看出，每代發(fā)酵培養(yǎng)中，菌株x4的醋酸產(chǎn)量最高，并在傳代培養(yǎng)過程中產(chǎn)量穩(wěn)定，故選該菌株為目的菌株。存活期限試驗：把x4菌株接入三種斜面保藏培養(yǎng)基，每隔三個月接種到各方法所用的培養(yǎng)基上。觀察其存活情況，見表2.3.1.b：表2.3.1.b 三種方法保藏醋酸菌的存活時間tab 2.3.1.b three methods of acetic acid bacteria survival time of biomaterial時間/月 3691215182124斜面法液體法改進(jìn)斜面注： “+”表示生長； “+”表示

14、生長良好；”表示不生長。從2.3.1.b看可以出，普通斜面保減法保藏的保藏時間小于3個月；而液體保藏法的保藏時間大于18個月；但改進(jìn)后的斜面液體保藏法，能在20個月內(nèi)都保持生長良好，且保藏的時間可達(dá)24個月。醋酸菌所產(chǎn)的酸，是造成醋酸菌保藏時間受到限制的原因之一。隨著保藏時間的延長，盡管醋酸菌能抵抗一定的酸，但一直處在酸性環(huán)境中，醋酸菌會被自己產(chǎn)的酸所殺滅。因此，在菌種生長的很健壯后又加入碳酸鈣和液體培養(yǎng)基，既降低了氧氣的含量，又中和了產(chǎn)生的醋酸，使其在生長和保護(hù)方面較液體保藏更加先進(jìn)了一步，保藏效果也更好。2.3.2 分析鑒定結(jié)果2.3.2.1 菌株x4形態(tài)特征顯微鏡下細(xì)胞呈橢圓或短桿狀，無

15、芽孢，單個或成對、成鏈排列。 2.3.2.2 x4培養(yǎng)特征x4在基礎(chǔ)平板培養(yǎng)基上生長旺盛，形成灰白色圓形菌落，表面光滑、凸起，邊緣整齊，培養(yǎng)48h能產(chǎn)酸，使caco3溶解形成明顯的透明圈。繼續(xù)培養(yǎng)能氧化乙酸產(chǎn)生co2和h2o，菌落周圍出現(xiàn)乳白色透明圈。在斜面培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)2 d產(chǎn)酸。能在12% (v/v)乙醇的培養(yǎng)基上和30%葡萄糖培養(yǎng)基上生長，但在hoyer-frateur培養(yǎng)液中不生長，也不產(chǎn)色素。液體培養(yǎng)搖瓶產(chǎn)酸較快，靜止培養(yǎng)時在液面形成少量菌膜，產(chǎn)酸較慢。平板菌落形態(tài)見下圖2.3.2.a：圖2.3.2.a x4菌落形態(tài)圖fig 2.3.2.a x4 colony morphol

16、ogy diagram2.3.2.3 生理生化實(shí)驗結(jié)果接觸酶試驗陽性，試驗說明x4為好氧菌，所以迅速形成大量氣泡。在hoyer-frateur培養(yǎng)液中不生長。在gyc培養(yǎng)基不產(chǎn)生水溶性棕色色素。生酮試驗結(jié)果為陰性，無紅色沉淀出現(xiàn)。不產(chǎn)生5-酮基葡萄糖酸鹽。產(chǎn)葡萄糖產(chǎn)酸試驗結(jié)果為陽性。產(chǎn)纖維素試驗結(jié)果為陰性。氧化乙酸試驗為陽性，試驗說明x4可以氧化乙酸鈣，產(chǎn)生co2和水，co2又和鈣結(jié)合成乳白色的暈圈。氧化乳酸試驗為陽性，試驗說明x4可以氧化乳酸，產(chǎn)生co2和水， co2又和鈣結(jié)合成乳白色的暈圈。以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基生長試驗試驗說明x4可以在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基生長。2.3.3 分析鑒定

17、結(jié)果在以上生理生化試驗的基礎(chǔ)上，查閱伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第8版)和常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊進(jìn)行鑒定分析。根據(jù)表2.3.3.a可以看出，x4氧化醋酸和乳酸成co2和h2o，所以x4為醋酸桿菌屬，而不是葡糖桿菌屬和假單胞菌屬。表2.3.3.a 葡糖桿菌、醋酸菌屬、假單胞菌屬比較表tab 2.3.3.a glucnobacter、acetobacter、pseudomonas comparison table生理生化特征葡糖桿菌屬醋酸菌屬假單胞菌屬鞭毛運(yùn)動作用極生或沒有周身或沒有極生于ph4.5可生長+-氧化：ph4.5時氧化乙醇成醋酸+(m)a+(s)-醋酸氧化成co2-+d乳酸氧化成co2-+葡萄糖氧

18、化成葡萄糖酸+dd靜止細(xì)胞氧化氨基酸-+krebs循環(huán)（三羧酸循環(huán)）-+產(chǎn)生5-酮基葡萄糖酸產(chǎn)生+d-生酮作用+d-醌類： q10+-q9-+水解： 乳糖和淀粉-d明膠-/w-d呈綠色或熒光色素-d注：此表引用伯杰氏手冊第326頁；a、m.中等；s.強(qiáng)；w.弱。根據(jù)表2.3.3.b比較出，根據(jù)接觸酶試驗、甘油生酮試驗、產(chǎn)纖維素試驗和以乙醇為唯一碳源生長試驗結(jié)果區(qū)別于其他菌株，所以判斷x4為巴氏醋桿菌羅旺亞種 (a· lovaniensis)，并進(jìn)行相同試驗，得出結(jié)論x1為巴氏醋桿菌埃斯群亞種(a·estunensis)。表2.3.3.b 各類醋酸菌特征表tab 2.3.3.

19、b all kinds of acetic acid bacteria features list醋化醋桿菌巴氏醋桿菌過氧化醋桿菌a1a2a3a4b1b2b3b4b5c醋化醋桿菌亞種醋化醋桿菌奧爾蘭亞種醋化醋桿菌木質(zhì)亞種醋化醋桿菌液化亞種巴氏醋桿菌巴氏亞種巴氏醋桿菌羅旺亞種巴氏醋桿菌埃斯群亞種巴氏醋桿菌攀升亞種巴氏醋桿菌奇異亞種過氧化醋桿菌接觸酶（+）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（+）（-）（-）在甘油或赤鮮醇中生酮+a+a+a+a-b-b-b-b-形成5-酮葡萄糖酸鹽（+）（+）（+）（+）-形成2-酮葡萄糖酸鹽（+）（+）（+）（+）d-葡萄糖酸鹽+（+）+-在乙醇上生長+-（-）

20、+（-）+-+產(chǎn)生：纖維素-+-+-吡喃酮-+-褐色素-+-g+c，克分子/%59-6560-6162-636455-626255-5661-64注：此表引用伯杰氏手冊第365頁；a.中度到強(qiáng)；b.陰性或很弱；( ).通常為陽性或陰性。2.3.4 發(fā)酵條件實(shí)驗結(jié)果培養(yǎng)72h后，分別檢測各個溫度下產(chǎn)酸量和總菌數(shù)，結(jié)果見下圖2.3.4.a和表2.3.4.b：注：方型為x4菌株；柱型為x1。圖2.3.4.a 不同溫度下產(chǎn)酸量fig 2.3.4.a production of acid at different temperatures表2.3.4.b 不同溫度下醋酸菌數(shù)量(108cfu/ml)tab 2.3.4.b number of different temperature acetic acid bacteria2628