軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

1、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)原理及步驟原理：軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)主要用于非貼壁生長的細(xì)胞，某些細(xì)胞（如正常成纖維細(xì)胞）在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于此法。某些惡性腫瘤細(xì)胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下能增殖，其在軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。讓細(xì)胞處于不貼壁以及單細(xì)胞狀態(tài)，模擬體內(nèi)細(xì)胞處于半固液態(tài)的情況，在此狀態(tài)下檢測細(xì)胞的增殖能力。單細(xì)胞處于soft agar中，就如胰酶消化后的狀態(tài)，及圓形，此后細(xì)胞繼續(xù)增殖、分裂，形成單克隆球形。半固體環(huán)境肯定是要求惡性程度高的容易生長，所以不會(huì)比平板克隆快，只要能夠和對照比較即有意義。步

2、驟：1、配制100ml的1.2% argrose和0.7%argrose，argrose用dna電泳用biowest regular argrose g10（4），溶劑用雙蒸水（ddw），高壓滅菌后，維持在42中不會(huì)凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的結(jié)晶紫。 2、 實(shí)驗(yàn)前，將水浴鍋放入超凈臺(tái)內(nèi)，紫外照射，設(shè)定溫度42。提前融化血清和雙抗。 3、如已制好上下膠，則在微波爐中溶解1.2%argrose下膠和0.7% argrose上膠，降溫后放入42水浴鍋中保持。 4、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要的量配制20

3、%fbs+2×1640+2×ps（5種細(xì)胞配40ml），每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 5、鋪下膠：按1:1比例使1.2%argrose下膠和20%fbs+2×1640+2×ps混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，輕輕混勻，室溫靜置待下膠凝固（加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡）。對于一個(gè)6孔板，配5ml上述培養(yǎng)液+5ml 1.2%argrose下膠于50ml離心管中（離心管要一直置于水浴鍋中）。 6、細(xì)胞計(jì)數(shù)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用正常培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至40×10

4、4ml以上，這樣加的體積小于100ul，不會(huì)影響其他成分的稀釋程度。每孔鋪1萬個(gè)細(xì)胞，準(zhǔn)備4個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)，即4×104。 7、鋪上膠：按1:1比例混合0.7% argrose上膠和20%fbs+2×1640+2×ps，每種細(xì)胞需先配2ml（20%fbs+2×1640+2×ps+2ml0.7%argrose）上膠于離心管中混勻，放入42水浴鍋中保持。再將細(xì)胞懸液加入上述混合液中，混勻后迅速加入6孔板中，每孔1ml。一般每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3個(gè)樣本，待上層瓊脂凝固后，置于5%co2，37，培養(yǎng)23周。 8、間隔2天補(bǔ)加200

5、ul 10%fbs+1640+1×ps，以防過于干燥。 9、計(jì)數(shù)克?。喊哑矫蠓胖迷诘怪蔑@微鏡下（100×），在鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中大于50個(gè)克隆數(shù)(0.05mm的克隆)和所有克隆數(shù)，克隆形成率=大于50個(gè)克隆數(shù)所有克隆數(shù)×100%。每孔加入1ml的0.005%結(jié)晶紫染色1h以上，鏡下拍照。  10、數(shù)據(jù)處理：每個(gè)視野的面積是1mm2,6孔盤每孔的面積是9.6cm2,則一個(gè)孔中總的克隆數(shù)=平均克隆數(shù)×960，如果要比較0.05mm的克隆的絕對值，則可以利用“每孔0.05mm的克隆數(shù)/每孔總細(xì)胞克隆數(shù)”，

6、將分母取一組作為標(biāo)準(zhǔn)，做出此組與其他組的比值系數(shù)，再分別用此系數(shù)乘以各組0.05mm的克隆的絕對值，就得到總細(xì)胞克隆數(shù)相同條件下的0.05mm的克隆的絕對值，可進(jìn)行比較。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：根據(jù)集落數(shù)和克隆形成率進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析不同組別之間的差異。注意：1）軟瓊脂克隆的操作相對復(fù)雜，在實(shí)驗(yàn)過程中一定要注意無菌操作。   2）在將瓊脂于培養(yǎng)基混勻時(shí)，要注意瓊脂溫度，而且動(dòng)作要迅速，避免局部結(jié)塊。  3）制備好底層瓊脂后，要待其完全凝固后再澆上上層瓊脂。4） 通常下層1.2% argrose快些鋪，略有不平是沒有太大關(guān)系的，上層0.7% argrose與細(xì)胞混合時(shí)水浴不大于40度，小心均勻的鋪，37度不會(huì)那么快凝固，孵箱里過幾天就好了。5） 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)方法簡單，適用于不貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度