抗原的提取與制備.ppt

1、 第一節(jié)第一節(jié) 免疫學(xué)技術(shù)的范疇與應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)的范疇與應(yīng)用一、免疫學(xué)技術(shù)的范疇二、免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)免疫學(xué)技術(shù)的范疇免疫學(xué)技術(shù)的范疇1、對免疫系統(tǒng)的組成成分的數(shù)量、狀態(tài)的測定2、對具有免疫活性物質(zhì)的定性、定量測定（范圍較廣） 免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)1、對象“包羅萬象”2、方法“兼容并蓄”（牽涉到物理，化學(xué)，生物，醫(yī)學(xué)，計(jì)算機(jī)等各學(xué)科）*如何學(xué)習(xí)和使用免疫學(xué)技術(shù)？基本原理的理解+說明書和手冊（向儀器或試劑盒供應(yīng)商索取或網(wǎng)上下載） 第二節(jié)第二節(jié) 有關(guān)免疫學(xué)基本概念有關(guān)免疫學(xué)基本概念一、抗原的概念與屬性二、免疫細(xì)胞的概念與分類三、免疫應(yīng)答的概念與過程1、與抗體結(jié)合的物質(zhì)2、能夠

2、被免疫系統(tǒng)識別的物質(zhì)3、能夠激活免疫細(xì)胞并與免疫效應(yīng)物起反應(yīng)的物質(zhì)抗原抗原免疫原性免疫原性可識別、可反應(yīng)性（誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性）免疫反應(yīng)性免疫反應(yīng)性 選擇結(jié)合性（和免疫應(yīng)答產(chǎn)物特異性結(jié)合的特性）抗原的概念與屬性抗原的概念與屬性*抗原和半抗原免疫細(xì)胞的概念與分類免疫細(xì)胞的概念與分類免疫細(xì)胞（免疫細(xì)胞（immune cellsimmune cells） 泛指所有參與免疫應(yīng)答及與免疫應(yīng)答活動相關(guān)的細(xì)胞。免疫活性細(xì)胞（免疫活性細(xì)胞（immune competent cellimmune competent cell，iccicc） 能夠接受抗原刺激、產(chǎn)生特異性的活化、增殖、分化并形成效應(yīng)產(chǎn)物的

3、淋巴細(xì)胞。 免疫細(xì)胞的類型免疫細(xì)胞的類型 紅細(xì)胞 血小板 肥大細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 漿細(xì)胞 t細(xì)胞 nk細(xì)胞免疫應(yīng)答的概念與過程免疫應(yīng)答的概念與過程免疫應(yīng)答（免疫應(yīng)答（immune response） 免疫系統(tǒng)接觸抗原后，免疫細(xì)胞對抗原進(jìn)行識別；并使特異性淋巴細(xì)胞活化、增殖；表現(xiàn)出免疫效應(yīng)的過程。免疫應(yīng)答的階段免疫應(yīng)答的階段1、抗原識別階段（antigen-recognizing phase）2、淋巴細(xì)胞活化階段（lymphocyte-activating phase） 3、抗原清除階段（antigen-eliminating phase） 第三節(jié)第三節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的基本原

4、理抗原抗體反應(yīng)的基本原理一、抗原抗體反應(yīng)的原理二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)的原理1、抗原抗體之間的作用力2、抗原抗體結(jié)合物析出原因參與抗原抗體相互作用的力參與抗原抗體相互作用的力1、電荷引力（庫侖引力）2、分子力（van der waals力，分子隨機(jī)產(chǎn)生的電偶極矩極化而引起的相互作用 ）3、氫鍵結(jié)合力（氫和電負(fù)性大的原子結(jié)合, 帶正電的原子核暴露于外,可吸引其它電負(fù)性大的原子 ）4、疏水作用力（由大分子中疏水基團(tuán)相互接近. 而形成的一種作用力 ）*以上作用力均非共價鍵單獨(dú)的抗原或抗體不自行聚合析出單獨(dú)的抗原或抗體不自行聚合析出的原因的原因親水

5、膠體的形成1、電荷排斥力（由蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)決定）2、水化層的形成抗原抗體的析出抗原抗體的析出抗原抗體的結(jié)合：可以導(dǎo)致電荷的中和水化層破壞 蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體，聚合析出需要電解質(zhì)的輔助 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1、特異性2、可逆性3、適合比例性特異性及其相對性特異性及其相對性抗原a抗原c抗原b特異性反應(yīng)交叉反應(yīng)無反應(yīng)抗體可逆性可逆性k（親和常數(shù)）=ag+abag ab適合比例性適合比例性抗體含量抗原含量前帶后帶等價帶網(wǎng)格學(xué)說網(wǎng)格學(xué)說（lattice theory）抗體過?？乖^?？贵w抗體比例合適 抗原抗體反應(yīng)的影響因素抗原抗體反應(yīng)的影響因素1、電解質(zhì)2、酸堿度（ph值6-

6、8）3、溫度（37-42。c） 第四節(jié)第四節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù)的評價免疫學(xué)檢測技術(shù)的評價一、評價標(biāo)準(zhǔn) 二、特異性與敏感性的關(guān)系評價標(biāo)準(zhǔn)評價標(biāo)準(zhǔn)specificity（特異）：檢測信號針對性和排它性sensitivity（靈敏）：可測出的最低含量simplicity（簡便）：操作是否方便safety（安全）：是否有污染，對操作者的傷害saving（節(jié)約）：性能/價格比特異性與敏感性的關(guān)系特異性與敏感性的關(guān)系靈敏度高、特異性低（假陽性）特異性高、靈敏度低（假陰性） 第一節(jié)第一節(jié) 抗原抗原/ /免疫原制備的基本概念免疫原制備的基本概念一、抗原制備的目的二、抗原的“純度”三、抗原制備的主要技術(shù)途徑抗原制

7、備的目的抗原制備的目的免疫原：激活t、b細(xì)胞半抗原：檢測相應(yīng)抗體抗原的抗原的“純度純度”免疫原：除保留可被b細(xì)胞識別的抗原決定簇，還需保留足夠的被t細(xì)胞識別的抗原決定簇半抗原：盡可能減少影響反應(yīng)特異性的抗原決定簇抗原制備的主要技術(shù)途徑抗原制備的主要技術(shù)途徑天然抗原分離、純化半抗原人工合成、載體聯(lián)接抗原肽 合成、基因工程制備 第二節(jié)第二節(jié) 完全抗原完全抗原/ /免疫原的制備方法免疫原的制備方法一、顆粒性抗原的制備二、可溶性抗原的制備顆粒性抗原的制備顆粒性抗原的制備1、抗原的獲取：采集分離2、無害化處理：去除對機(jī)體有毒成分，如用甲醛（細(xì)胞，細(xì)菌）可溶性抗原的制備與純化可溶性抗原的制備與純化1、處理

8、與粉碎2、蛋白質(zhì)分離富集3、單一組分提取4、抗原純度鑒定 （蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白）處理與粉碎處理與粉碎組織粉碎： 機(jī)械 高速搗碎機(jī) ，研磨 生物 酶消化（蛋白酶、膠原酶 ） 細(xì)胞破碎： 物理 反復(fù)凍融 ，冷熱交替 ，超聲 化學(xué) 表面活性劑 生物 溶酶，自溶 蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)分離選擇性沉淀： 鹽析，有機(jī)溶劑沉淀， 水溶性非離子型聚合物沉淀（聚乙二醇） 透析技術(shù)：半透膜超濾技術(shù)：負(fù)壓+濾膜 單一組分提取的方法單一組分提取的方法層析技術(shù)：凝膠過濾 離子交換 親和層析 凝膠層析（分子篩）凝膠層析（分子篩）離子交換層析離子交換層析+親和層析親和層析單一組分提取的方法（續(xù)）單一組分提取的方法（續(xù)）離心技

9、術(shù)：差速離心 密度梯度離心電泳技術(shù)：電泳洗脫 等電聚焦密度梯度離心法控制溶液的比重，將不同比重的分子或細(xì)胞通過離心方法加以分離分為：*不連續(xù)密度梯度離心法（單次密度梯度離心法）*連續(xù)密度梯度離心法不連續(xù)密度梯度離心法（單次密度梯度離心法）分離液僅形成單一的密度層，可在該層中獲取與其比重一致的細(xì)胞或分子。該法較多用于外周血單個核細(xì)胞的分離，常用的分離液為ficoll。聚蔗糖泛影葡胺 不連續(xù)密度梯度離心分離法 連續(xù)密度梯度離心法分離液可形成一連續(xù)的密度梯度層，在不同的密度梯度層中可獲取所需的不同種類的細(xì)胞。該法可一次分離得到幾種所需的不同類型血細(xì)胞。常用于外周血細(xì)胞的分離，使用的分離液為perco

10、ll。聚乙烯吡咯烷酮 連續(xù)密度梯度離心分離法 單一組分提取的方法單一組分提取的方法電泳技術(shù)：電泳洗脫：根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷和分子大小分離等電聚焦：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分離電泳技術(shù)(等電聚焦)抗原純度鑒定抗原純度鑒定方法： 電泳法 免疫法 層析法指標(biāo)： 電泳純（電泳法） 免疫純（免疫擴(kuò)散法，純度要求高） 第三節(jié)第三節(jié) 半抗原免疫原制備的方法半抗原免疫原制備的方法一、載體的選擇二、半抗原與載體的聯(lián)接載體的選擇載體的選擇 結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子 蛋白質(zhì)載體：bsa、hsa、ova（卵清蛋白 ）、klh（鑰孔嘁血藍(lán)蛋白 ）聚合多肽載體：多聚賴氨酸高分子聚合物載體：羧甲基纖維素半抗原與載體的聯(lián)接半抗

11、原與載體的聯(lián)接1、連接方式：物理法（吸附） 化學(xué)法2、化學(xué)連接方法： 直接聯(lián)接法：適用于帶游離氨基或游離羧基的半抗原 間接聯(lián)接法：適用于沒有游離氨基或游離羧基的半抗原半抗原與載體直接聯(lián)接半抗原與載體直接聯(lián)接碳化二亞胺法碳化二亞胺法蛋白質(zhì)-coo + r-n+=cn-r h-n+-r蛋白質(zhì)-coo-c-nh-r + 半抗原-nh2 o蛋白質(zhì)-c-nh-半抗原 + r-nh-co-nh r半抗原與載體直接聯(lián)接半抗原與載體直接聯(lián)接 戊二醛法戊二醛法蛋白質(zhì)- nh2 + 半抗原-nh2 + coh-（ch2 ） 3 - coh蛋白質(zhì)-n=ch-（ch2 ） 3 ch=n-半抗原半抗原與載體直接聯(lián)接半抗

12、原與載體直接聯(lián)接 氯甲酸異丁酯法氯甲酸異丁酯法半抗原-cooh + cl-coo-ch2 ch（ch3）2 o o半抗原-c-o-c-o-ch2ch（ch3）2 + 蛋白質(zhì)- nh2 半抗原-co- nh -蛋白質(zhì) + ho-ch2ch（ch3）2 半抗原與載體間接聯(lián)接半抗原與載體間接聯(lián)接琥珀酸酐法琥珀酸酐法 o o半抗原-ch2 oh + c-o-c ch3 ch3 o半抗原-ch2 o-c-(ch2 ) 2-cooh半抗原與載體間接聯(lián)接半抗原與載體間接聯(lián)接o-（羥甲基）羥胺法（羥甲基）羥胺法半抗原-c=o +h2 n-o- ch2 - cooh 半抗原-c=n-o- ch2 - cooh 半抗原與載體間接聯(lián)接半抗原與載體間接聯(lián)接一氯醋酸鈉法一氯醋酸鈉法半抗原- - oh + cl- ch2 - coona半抗原- - ch2 - cooh 半抗原與載體間接聯(lián)接半抗原與載體間接聯(lián)接重氮化的對氨基苯甲酸法重氮化的對氨基苯甲酸法hooc- -nh2 + nano2 h