細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備及實(shí)驗(yàn)技巧

1、窗體頂端細(xì)胞培養(yǎng)常用設(shè)備及實(shí)驗(yàn)技巧常用設(shè)備  準(zhǔn)備室的設(shè)備：  單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品規(guī)（放置消毒過的物品）、包裝臺(tái)。 配液室的設(shè)備： 扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。 培養(yǎng)室的設(shè)備： 液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液

2、）。 無菌操作  無菌室的滅菌：  1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5過氧乙酸擦拭。  2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射 3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘 4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備： 1.肥皂洗手。 2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋 3.用75酒精棉球擦凈雙手。 無菌操作的演示：  1.凡是帶

3、入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精燈火焰操作。 3.器皿使用前必須過火滅菌 4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火。 5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。 6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。 器械的清洗和消毒  玻璃器械洗消：  一、新的玻璃器皿的洗消：  1.自來水刷洗，除去灰塵。 2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。 3.刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷

4、洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。 5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。 6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。 7.高壓消毒后烘干 二、舊的玻璃器皿的洗消：  1刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。 2.泡

5、酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。 3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。 4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上） 5.烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。 金屬器械洗消： 

6、金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。    橡膠和塑料：  橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：  1 . 針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時(shí),或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30

7、分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺(tái)內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。  2. 膠塞烘干后用2氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。  3. 膠帽，離心管帽烘干后只能在2氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(shí)（切記時(shí)間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。  4. 膠頭可用75酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。&#

8、160; 5.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：  6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺(tái)臺(tái)面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用20000100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。  為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號(hào)，平時(shí)這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC126H2O)2g，30鹽酸1

9、0m1，蒸餾水88m1。  注意事項(xiàng)：  1.嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏?，?huì)降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。  2.安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。  3.注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒  器材與試劑： 

10、 干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。 具體步驟：  一. 水的制備：  細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水 二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：  1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO4 0.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖

11、勻即成新配制的PBS溶液。  2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。  三. 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：  胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)

12、選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。  1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4內(nèi)過夜。  2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20保存以備使用。  四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒  1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。  2

13、.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。  3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位1微克？ 五.RPMI1640的制備與消毒：  1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量

14、的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。  2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。  3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾。  4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4冰箱內(nèi)待用。  5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4時(shí)兩周有效）。  六血清的滅火：  細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。 

15、 七.HEPES溶液：  HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N-ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。  1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：  準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4保存。  注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，

16、所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。  八.谷氨酰胺：  合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4下放置1周可分解50，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中

17、儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。  一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。  九.肝素溶液的配制：  含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝

18、小瓶，保存溫度為¬¬  。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。  十. 型膠原酶：  0.1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)樾湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20保存。  十一.明膠溶液：  因?yàn)槊髂z難于過濾，所以配制0.1明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明

19、膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4保存。  其他培養(yǎng)用液的配制：  20ug/ml內(nèi)皮生長因子，  注意事項(xiàng)：  1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。  2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。  3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。  細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）  具體操作：

20、  一. 傳代前準(zhǔn)備：  1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。 2.用75酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。  3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。  4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。  5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。  6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。 7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面

21、，再在鏡下觀察細(xì)胞。 8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。 二.胰蛋白酶消化；  1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37。 2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。  3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。  三.吹打分散細(xì)胞：  1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。  2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液

22、吸入10ml離心管中。  3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。  4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。 四.分裝稀釋細(xì)胞：  1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。 2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。  五.繼續(xù)培養(yǎng)：  用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)

23、胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25時(shí)為一個(gè)，占50為，占75時(shí)為。  傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：  1.嚴(yán)格的無菌操作  2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。  附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：  EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g，&#

24、160;葡萄糖 2.00g，0.5酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁 細(xì)胞的復(fù)蘇  細(xì)胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196液氮中的細(xì)胞快速融化至37，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。 具體操作  一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：  1.將水浴鍋預(yù)熱至37  2.用75酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。  3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消

25、過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。  二取出凍存管：  1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。  2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。 三迅速解凍：  1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。 2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。 四.平衡離心： 用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min  五.制備細(xì)胞懸液：  1.吸棄上清液。 2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成

26、細(xì)胞懸液。 六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：  細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。 七.培養(yǎng)細(xì)胞  將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37和5CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。 初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：  1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37。  2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。 3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。 4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。 細(xì)胞計(jì)數(shù)  實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的

27、細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。 具體操作：  一.準(zhǔn)備工作：  取一瓶傳代的細(xì)胞，按照傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。  二.細(xì)胞懸液制備：  細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。 三.細(xì)胞計(jì)數(shù)：  1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。  2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。 3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。 5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度： （細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104  說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中