發(fā)酵工程大試驗(yàn)(2012)

1、湖南大學(xué)生物學(xué)院湖南大學(xué)生物學(xué)院2012年年5月月一、發(fā)酵設(shè)備二、發(fā)酵方式三、發(fā)酵罐操作四、蒸汽發(fā)生器五、空氣壓縮機(jī)六、空罐滅菌（空消）七、實(shí)際裝料滅菌（實(shí)消）八、發(fā)酵培養(yǎng)九、溶氧（DO）與轉(zhuǎn)速的關(guān)聯(lián)十、發(fā)酵罐工作組織流程十一、思考題目 錄空氣動(dòng)力系統(tǒng)：空壓機(jī)。提供罐壓、氧氣、氣動(dòng)閥 動(dòng)力滅菌系統(tǒng)：蒸汽發(fā)生器溫控系統(tǒng)發(fā)酵罐自帶電加熱自來(lái)水冷卻蒸汽發(fā)生器：滅菌消毒時(shí)用冷水機(jī)：控溫低于水溫時(shí)用 發(fā)酵系統(tǒng)：發(fā)酵罐 一、 發(fā)酵設(shè)備 發(fā)酵罐冷水機(jī)及蒸汽發(fā)生器空壓機(jī)空壓機(jī)表壓發(fā)酵方式固體發(fā)酵法：曲池、固體發(fā)酵罐半固體發(fā)酵法：發(fā)酵罐液體發(fā)酵法：發(fā)酵罐二、發(fā)酵方式三、 發(fā)酵罐操作1.發(fā)酵罐、蒸汽發(fā)生器、空氣壓

2、縮機(jī)均屬壓力容器。操作時(shí)須小心謹(jǐn)慎。尤以滅 菌（空消、實(shí)消）最危險(xiǎn)。滅菌時(shí)須全程看守，不得離人。2.發(fā)酵、空消、實(shí)消前所有蓋板螺絲，探頭、補(bǔ)料口螺絲須全部擰緊。將發(fā)酵罐 、蒸汽發(fā)生器進(jìn)水龍頭打開(kāi)。3.發(fā)酵前，先將空壓機(jī)打開(kāi)，待空壓機(jī)壓力達(dá)到0.6MPa時(shí)，開(kāi)發(fā)酵罐電源。如果 滅菌，須將蒸汽發(fā)生器、空壓機(jī)全部打開(kāi)后，再接通發(fā)酵罐電源。4.發(fā)酵罐開(kāi)機(jī)： 開(kāi)電源開(kāi)攪拌電機(jī)下位機(jī)登陸系統(tǒng)設(shè)計(jì)程序運(yùn)行程序5.發(fā)酵罐關(guān)機(jī)： 退出運(yùn)行程序關(guān)攪拌電機(jī)關(guān)電源關(guān)水龍頭 發(fā)酵罐 、蒸汽發(fā)生器進(jìn)水龍頭 發(fā)酵罐電源、電機(jī)開(kāi)關(guān)及下位機(jī)發(fā)酵罐的控制及使用：通過(guò)下位機(jī)進(jìn)行發(fā)酵罐的控制及使用：通過(guò)下位機(jī)進(jìn)行1、通過(guò)下位機(jī)“登陸

3、系統(tǒng)”。2、輸入密碼后，點(diǎn)擊“確認(rèn)”。操作員“100”，低級(jí)權(quán)限。3、發(fā)酵罐在準(zhǔn)備發(fā)酵或者滅菌時(shí)都必須先點(diǎn)擊“系統(tǒng)控制”的 “啟動(dòng)”。6.發(fā)酵時(shí)，上位機(jī)只能監(jiān)控及輸出數(shù)據(jù)，用下位機(jī)設(shè)置參數(shù)。兩者關(guān)系，下位機(jī)優(yōu) 先。7.發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐過(guò)壓時(shí)(0.15MPa) ，（1）將進(jìn)氣流量設(shè)定為0，若仍不能控制，則將空壓機(jī)關(guān)閉。（2）取消DO-轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制，晚上無(wú)人值班時(shí)須取消DO-轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制。8.發(fā)酵過(guò)程中，罐壓必須為正壓（？），通常為0.02-0.05MPa。四、 蒸汽發(fā)生器1.蒸汽發(fā)生器在空消、實(shí)消、取樣時(shí)使用。 蒸汽發(fā)生器為壓力容器，須謹(jǐn)慎操作。滅菌（空消、實(shí)消）及取樣時(shí)，必須全程看守，不得離

4、人。2.使用時(shí)，打開(kāi)蒸汽發(fā)生器的進(jìn)水龍頭，關(guān)閉排污閥，打開(kāi)蒸汽排出閥，打開(kāi)發(fā)酵罐蒸汽進(jìn)入總閥 。3.開(kāi)蒸汽發(fā)生器電源開(kāi)機(jī) 。會(huì)出現(xiàn)缺水報(bào)警聲，水泵運(yùn)轉(zhuǎn)補(bǔ)水，達(dá)到預(yù)定水位時(shí)，停止報(bào)警，水泵停止補(bǔ)水。4.密切注意蒸汽發(fā)生器的水位變化，若出現(xiàn)故障不進(jìn)水，水位下降至刻度線下時(shí)，應(yīng)立即關(guān)機(jī)、關(guān)電源。5.蒸汽發(fā)生器加熱時(shí)，暫時(shí)關(guān)閉蒸汽閥門(mén)，待壓力到達(dá)工作壓力時(shí)，緩開(kāi)蒸汽閥門(mén)，正常使用蒸汽。6.使用完畢，關(guān)機(jī)、關(guān)電源。若長(zhǎng)時(shí)間不用，則應(yīng)關(guān)閉進(jìn)水龍頭，并待蒸汽發(fā)生器冷卻后，將水箱中的水排空。7.蒸汽發(fā)生器通常在滅菌或取樣前20-30min開(kāi)始工作，蒸汽發(fā)生器的工作壓力為0.4-0.7MPa。 蒸汽發(fā)生器五、

5、空氣壓縮機(jī)1.空氣壓縮機(jī)在空消、實(shí)消、發(fā)酵、取樣過(guò)程中，均須打開(kāi)。功效主要在于：保持罐壓。提供氧氣。為氣動(dòng)閥提供動(dòng)力。吹干空氣過(guò)濾器。2.空氣壓縮機(jī)出口處工作壓力必須達(dá)到0.6MPa才能維持發(fā)酵罐的正常工作。3.空氣壓縮機(jī)在發(fā)酵、滅菌前打開(kāi)，在放罐結(jié)束后才能關(guān)閉。4.發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐過(guò)壓時(shí)(0.15MPa)，若進(jìn)氣流量設(shè)定為0，仍不能控制罐壓，則須將空壓機(jī)關(guān)閉。 空氣壓縮機(jī)六、 空罐滅菌（空消）1.空消通常在實(shí)消（實(shí)際裝料滅菌）前或在發(fā)酵結(jié)束清洗完發(fā)酵罐后進(jìn)行。指對(duì)罐體、管道、閥門(mén)、過(guò)濾器等的滅菌消毒。2.空消前打開(kāi)蒸汽發(fā)生器、空壓機(jī)，將pH、DO電極拔出，用堵帽螺絲塞住并擰緊。其余蓋板螺絲

6、、補(bǔ)料口螺絲須全部擰緊。發(fā)酵罐視鏡窗口裝上防護(hù)板。3.空消前須將夾套中的水排空（？），發(fā)酵罐裝入約5L水（將溫度電極探頭淹過(guò)即可）。4.開(kāi)啟發(fā)酵罐電源，登陸系統(tǒng)，點(diǎn)擊“啟動(dòng)”，進(jìn)入滅菌控制滅菌參數(shù)設(shè)定。 空罐滅菌轉(zhuǎn)速設(shè)定0rpm 攪拌停止溫度設(shè)定0 滅菌穩(wěn)定溫度設(shè)定121 滅菌時(shí)間設(shè)定1030min，一般為20min 滅菌完成罐壓設(shè)定為0.05MPa 滅菌完成后溫度設(shè)定37 滅菌完成后流量設(shè)定30.0L/min 點(diǎn)擊“開(kāi)始”，即可自動(dòng)根據(jù)滅菌參數(shù)來(lái)滅菌。5.空消時(shí)，當(dāng)罐體溫度達(dá)到70時(shí)，開(kāi)啟底閥、放料閥通蒸汽，對(duì)底閥、放料閥滅菌消毒。6.空罐滅菌全程須有人看管，如有報(bào)警，立即處置、報(bào)告。滅菌罐

7、壓0.15MPa。7.空消結(jié)束后，按序關(guān)閉蒸汽發(fā)生器、發(fā)酵罐、空壓機(jī)。七、 實(shí)際裝料滅菌（實(shí)消）1.實(shí)消是指實(shí)際裝料滅菌，通常在空消后進(jìn)行。實(shí)消前要將夾套中的水排空。2.實(shí)消前，先將pH、DO電極用pH標(biāo)準(zhǔn)液及飽和亞硫酸鈉溶液通過(guò)下位機(jī)的“pH電極校正”、“DO電極校正”界面，采用“兩點(diǎn)自動(dòng)校正法”校正，然后裝入發(fā)酵罐，擰緊螺絲。3.從發(fā)酵罐頂部入料口裝入預(yù)先配置好的發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)鹽溶液約5升，再倒入固形料（如麩皮、豆餅粉等），然后補(bǔ)充剩余水份。裝料系數(shù)一般為0.7（20L罐，實(shí)際裝料量為14L）。預(yù)留出滅菌冷凝水或蒸發(fā)水的量。若滅菌后產(chǎn)生冷凝水，滅菌前須少加水；若滅菌后蒸發(fā)了水，滅菌前須多加

8、水。4.調(diào)整好液位電極和消泡電極的位置并旋緊，滅菌完畢不得再調(diào)整液位電極和消泡電極的位置（？）。如果不用，則可拆下并用堵頭封住。 本實(shí)驗(yàn)僅調(diào)整消泡電極的位置。5.打開(kāi)空壓機(jī)、蒸汽發(fā)生器，擰緊發(fā)酵罐的蓋板螺絲、補(bǔ)料口螺絲。發(fā)酵罐視鏡窗口裝上防護(hù)板。所有罐體上的部件都必須保證是安裝可靠的，以防泄漏和罐壓升高時(shí)造成危害。 pH電極校正電極校正：兩點(diǎn)自動(dòng)校正法。通過(guò)下位機(jī)進(jìn)入“pH電極校正”界面1、把pH電極放入6.86的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中，在“測(cè)量值1”處輸入標(biāo)準(zhǔn)值6.86，等“當(dāng)前電壓”穩(wěn)定后，點(diǎn)擊 “第一點(diǎn)確認(rèn)” ，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)將“當(dāng)前電壓”處的數(shù)值記錄到“測(cè)量電壓1”處。2、把pH電極放入4.00（

9、酸性發(fā)酵）標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中，在“測(cè)量值2”處輸入標(biāo)準(zhǔn)值4.00，等“當(dāng)前電壓”穩(wěn)定后，點(diǎn)擊“第二點(diǎn)確認(rèn)” ，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)將“當(dāng)前電壓”處的數(shù)值記錄到“測(cè)量電壓2”處。3、點(diǎn)擊“自動(dòng)校正”，系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出零位和斜率。電極校正完成。DO電極校正電極校正：兩點(diǎn)自動(dòng)校正法。通過(guò)下位機(jī)進(jìn)入“DO電極校正”界面1、把DO電極放入飽和亞硫酸鈉溶液中 ，等“當(dāng)前電壓”穩(wěn)定后，點(diǎn)擊 “第一點(diǎn)確認(rèn)” ，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)將“當(dāng)前電壓”處的數(shù)值記錄到“測(cè)量電壓1”處。DO顯示值在5%以下即可。2、把DO電極放入飽和濕度的空氣中（用濕濾紙包住DO探頭）。在“測(cè)量值2”處輸入標(biāo)準(zhǔn)值98，等“當(dāng)前電壓”穩(wěn)定后，點(diǎn)擊“第二點(diǎn)確認(rèn)” ，

10、系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)將“當(dāng)前電壓”處的數(shù)值記錄到“測(cè)量電壓2”處。3、點(diǎn)擊“自動(dòng)校正”，系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出零位和斜率。電極校正完成。6.開(kāi)啟發(fā)酵罐電源，下位機(jī)登陸系統(tǒng)，點(diǎn)擊“啟動(dòng)”，進(jìn)入滅菌控制滅菌參數(shù)設(shè)定。 攪拌速度設(shè)定100rpm 攪拌停止溫度設(shè)定90 滅菌穩(wěn)定溫度設(shè)定121 滅菌時(shí)間設(shè)定30min 滅菌完成罐壓設(shè)定為0.05MPa 滅菌完成后溫度設(shè)定37 滅菌完成后流量設(shè)定30.0L/min 點(diǎn)擊“開(kāi)始”，即可自動(dòng)根據(jù)滅菌參數(shù)來(lái)進(jìn)行實(shí)消。7.實(shí)消滅菌全程須有人看管，如有報(bào)警，立即處置、報(bào)告。滅菌罐壓0.15MPa。8.實(shí)消罐溫達(dá)到121 后，要對(duì)發(fā)酵罐機(jī)械密封，取樣閥，底閥 通蒸汽滅菌，在滅菌攪拌停止

11、時(shí)用手動(dòng)滅菌 。滅菌時(shí)，先開(kāi)啟蒸汽進(jìn)氣閥，再微開(kāi)蒸汽出口閥，三者滅菌20min 。滅菌完成后，先關(guān)閉開(kāi)蒸汽出口閥，再關(guān)閉蒸汽進(jìn)氣閥。實(shí)消時(shí)不允許蒸氣通過(guò)底閥進(jìn)入發(fā)酵罐（？）。9.實(shí)消時(shí)，罐溫達(dá)到121 后，還要對(duì)空氣過(guò)濾器、尾氣過(guò)濾器滅菌，兩者過(guò)濾器頂部壓力表壓要達(dá)到0.1MPa 。若壓力達(dá)不到，可關(guān)小尾氣手動(dòng)閥。10.實(shí)消完成后，關(guān)閉蒸汽發(fā)生器。待罐溫、罐壓、轉(zhuǎn)速等達(dá)到發(fā)酵參數(shù)設(shè)定值后，必須對(duì)pH電極進(jìn)行在線校正，對(duì)DO電極進(jìn)行100滿(mǎn)度值校正（？）。11. pH電極、DO電極的在線校正通過(guò)下位機(jī)進(jìn)入“pH電極校正”、“DO電極校正”的界面， pH電極在線校正：通過(guò)調(diào)零位，使pH顯示值與標(biāo)準(zhǔn)

12、pH計(jì)測(cè)定值一致（需要取樣30mL測(cè)定）。 DO電極的在線校正：通過(guò)調(diào)斜率，在正常發(fā)酵溫度、罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量狀況下，使DO顯示值達(dá)到100滿(mǎn)度值。兩者校正完畢后，按界面上的“返回”即可。pH電極校正DO電極校正八、 發(fā)酵培養(yǎng)1.實(shí)消完成后，當(dāng)罐溫達(dá)到30-35，罐壓達(dá)到0.02-0.03MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm時(shí)，即可上罐接種。2.接種時(shí)，室內(nèi)空氣要保持相對(duì)靜止，關(guān)掉空調(diào)及電風(fēng)扇，將菌種及要補(bǔ)充的無(wú)菌水移近發(fā)酵罐。兩小組的液體種須事先匯集到兩個(gè)大三角瓶中（200mL2瓶）。3.在接種火圈環(huán)內(nèi)壓入燃燒酒精棉球，發(fā)酵罐頂部軸、螺絲等不銹鋼處，用75的酒精棉球擦拭消毒，點(diǎn)燃酒精棉。4.戴好防

13、燙手套，打開(kāi)接種蓋，將裝菌種的三角瓶瓶口在火焰上灼燒，按接種量迅速倒入液體菌種，補(bǔ)充無(wú)菌水至14L，蓋上接種蓋，并用火焰再次灼燒接種口。5.在下位機(jī)上，登陸系統(tǒng)，點(diǎn)擊“啟動(dòng)”，進(jìn)入“發(fā)酵控制”，按工藝要求，設(shè)定發(fā)酵溫度、罐壓、轉(zhuǎn)速、通氣量等后，點(diǎn)擊“自動(dòng)啟動(dòng)”開(kāi)始發(fā)酵培養(yǎng)。也可按“標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)”后，再設(shè)置運(yùn)行參數(shù)。6.記錄接種時(shí)間。從接種時(shí)計(jì)算，每隔1hr，用實(shí)驗(yàn)記錄本記錄罐溫、攪拌速度、通氣量、罐壓、pH、DO、泡沫變化、發(fā)酵液粘稠度、發(fā)酵液顏色等數(shù)據(jù)。7.每隔12hr取樣一次（通常為上午8：30，晚上8：30），取樣量約30mL，取樣前30min，打開(kāi)蒸汽發(fā)生器，待蒸汽壓力達(dá)到0.6-0.7M

14、Pa時(shí)，通過(guò)手動(dòng)隔膜閥對(duì)取樣口進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間20min，關(guān)閉蒸汽閥門(mén)。用火焰封住取樣口，將滅過(guò)菌的取樣瓶口置于火焰上灼燒，拔出瓶塞，同時(shí)，戴好手套，擰開(kāi)取樣閥，先放出30mL發(fā)酵液棄之，再接入30mL作為樣品。取樣后，關(guān)閉取樣閥，打開(kāi)蒸汽閥門(mén)，對(duì)取樣閥再進(jìn)行5-10min滅菌。關(guān)閉蒸汽發(fā)生器，對(duì)樣品進(jìn)行鏡檢，測(cè)定酶活。8.放罐：到達(dá)發(fā)酵時(shí)間后，須放罐。放罐通過(guò)底閥進(jìn)行，放罐前30min，打開(kāi)蒸汽發(fā)生器，通過(guò)底閥手動(dòng)隔膜閥對(duì)底閥滅菌20min；適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速及罐壓，用不銹鋼桶接住，旋松底閥開(kāi)關(guān)，將發(fā)酵液放入不銹鋼桶內(nèi)。9.放罐完畢，關(guān)閉蒸汽發(fā)生器，停止攪拌，及時(shí)將發(fā)酵罐清洗干凈，以防染菌污染。

15、10.發(fā)酵罐清洗完畢后，對(duì)發(fā)酵罐要實(shí)施空罐滅菌，對(duì)罐體、過(guò)濾器、管道、閥門(mén)等進(jìn)行滅菌消毒。11.實(shí)驗(yàn)報(bào)告：根據(jù)所記錄的數(shù)據(jù)，繪制pH、DO、生物量、酶活、殘?zhí)橇繉?duì)發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)曲線圖。九、 溶氧（DO）與轉(zhuǎn)速的關(guān)聯(lián)1.在“DO控制”界面，點(diǎn)擊“高級(jí)”。2.在“DO高級(jí)控制”界面,將“轉(zhuǎn)速DO關(guān)聯(lián)”設(shè)為“ON”，”系數(shù)”設(shè)為5-50，取值越大關(guān)聯(lián)度越小。再設(shè)“DO高級(jí)控制”旁邊的“OFF”為“ON”，點(diǎn)擊“返回”。 “DO控制”為“ON”。3.DO與轉(zhuǎn)速相關(guān)聯(lián)后，轉(zhuǎn)速設(shè)定值不再起作用。50rpm轉(zhuǎn)速700rpm4.在“轉(zhuǎn)速控制”界面，點(diǎn)擊“高級(jí)”。5.在“轉(zhuǎn)速高級(jí)控制”界面，“轉(zhuǎn)速設(shè)定值”與正常

16、所需轉(zhuǎn)速相同，“轉(zhuǎn)速DO關(guān)聯(lián)”為“ON”， “轉(zhuǎn)速高級(jí)控制”為“ON”， 按“返回”。 “轉(zhuǎn)速控制”為“ON”。6.轉(zhuǎn)速與DO關(guān)聯(lián)后，轉(zhuǎn)速設(shè)定值不再起作用。50rpm轉(zhuǎn)速700rpm7.注意：當(dāng)下位機(jī)不顯示，需重啟時(shí)，一定要將轉(zhuǎn)速與DO關(guān)聯(lián)取消，先采用100-200rpm轉(zhuǎn)速待DO值上升后，再設(shè)定轉(zhuǎn)速與DO關(guān)聯(lián)。否則，會(huì)造成電機(jī)高速飛轉(zhuǎn)損毀。8.考慮到泡沫過(guò)多易堵塞尾氣過(guò)濾芯的情況，不建議將DO-轉(zhuǎn)速進(jìn)行關(guān)聯(lián)。轉(zhuǎn)速維持在250rpm左右。十、發(fā)酵罐工作組織流程1、罐體清洗：對(duì)罐體、攪拌槳、各管路清洗疏通。2、空罐消毒：空消兼保壓試驗(yàn)。121，20min，罐壓0.15MPa。3、實(shí)際裝料滅菌（實(shí)

17、消）：實(shí)消前，將校正好的pH、DO電極裝入發(fā)酵罐，滅菌后，需對(duì)pH、DO電極在線校正。此過(guò)程還需對(duì)機(jī)封軸、取樣閥、放料閥、級(jí)空氣過(guò)濾器、尾氣過(guò)濾器滅菌。 121，30min（閥門(mén)、過(guò)濾器為20min），罐壓0.15MPa。4、發(fā)酵培養(yǎng)：罐壓維持0.02-0.03MPa。記錄罐溫、攪拌速度、通氣量、罐壓、pH、DO、泡沫變化、發(fā)酵液粘稠度、發(fā)酵液顏色等數(shù)據(jù)。每隔12hr取樣一次。根據(jù)所記錄的數(shù)據(jù)，繪制pH、DO、生物量、酶活、殘?zhí)橇繉?duì)發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)曲線圖。5、放罐及后續(xù)工藝處理階段：放罐完畢，取下pH、DO電極，清洗干凈后，裝入電極保護(hù)液套中保存。發(fā)酵液進(jìn)入后續(xù)處理工藝。6、罐體清洗：關(guān)閉蒸汽發(fā)生器、停止攪拌，及時(shí)將發(fā)酵罐、攪拌槳等清洗干凈，防止微生物污染、擴(kuò)散。7、空罐消毒：對(duì)發(fā)酵罐中殘存微生物滅菌。此過(guò)程還需對(duì)機(jī)封軸、取樣閥、放料閥、級(jí)空氣過(guò)濾器、尾氣過(guò)濾器滅菌。 1