71基因工程和克隆技術(shù)

1、【注意點(diǎn)】【注意點(diǎn)】限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6 6個(gè)堿基還是個(gè)堿基還是4 4個(gè)堿個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈dnadna上的堿基是上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。的。1.限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）2.dna連接酶連接酶 ecolidna連接酶、連接酶、t4dna連接酶連接酶【對(duì)位訓(xùn)練】【對(duì)位訓(xùn)練】限制酶在限制酶在dnadna的任何部位都能將的任何部位都能將dnadna切開嗎？以切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的下是四種不同限制酶切割形成的dna

2、dna片段：片段：【思考】【思考】（2 2）（）（7 7）和（）和（3 3）（）（6 6）可以交換連接嗎？）可以交換連接嗎？可以接，但失去識(shí)別位可以接，但失去識(shí)別位點(diǎn)，接后不能再切開。點(diǎn)，接后不能再切開?！炯m錯(cuò)】【糾錯(cuò)】某土壤農(nóng)桿菌中的某土壤農(nóng)桿菌中的titi質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（內(nèi)含質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（內(nèi)含t-dnat-dna片段）片段）3.載體（分子運(yùn)輸車）載體（分子運(yùn)輸車）此外，還有此外，還有噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒等4.基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序直接分離直接分離 較小較小 dnadna合成儀合成儀 rna rna 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 pcr pcr

3、基因組文庫(kù)；部分基因文庫(kù)（如基因組文庫(kù)；部分基因文庫(kù)（如cdnacdna文庫(kù)）文庫(kù)） pcrpcr技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增前提是：要有已知目的基因的核苷酸前提是：要有已知目的基因的核苷酸序列（以便根據(jù)這一序列合成引物）序列（以便根據(jù)這一序列合成引物）（2 2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建）基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心基因工程的核心目的：目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用?；虮磉_(dá)載體的模式圖：基因表達(dá)載體的模式圖：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花

4、粉管通道法槍法、花粉管通道法 顯微注射顯微注射技術(shù)技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞法感受態(tài)細(xì)胞法( (用用caca2 2處理處理) ) 受精卵、體細(xì)胞受精卵、體細(xì)胞 受精卵受精卵 原核細(xì)胞原核細(xì)胞 【思考】【思考】若想將一個(gè)抗病基因利用若想將一個(gè)抗病基因利用“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法”導(dǎo)入單導(dǎo)入單子葉植物，從理論上說(shuō)應(yīng)該怎樣做？子葉植物，從理論上說(shuō)應(yīng)該怎樣做？【轉(zhuǎn)化】【轉(zhuǎn)化】 目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程?！咎崾尽俊咎崾尽恳x擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以

5、侵染單子葉植物；菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化（酚類化合物）要加趨化（酚類化合物）和誘導(dǎo)的物質(zhì)。和誘導(dǎo)的物質(zhì)。 【歸納總結(jié)】【歸納總結(jié)】基因工程中受體細(xì)胞的選擇問(wèn)題解讀：基因工程中受體細(xì)胞的選擇問(wèn)題解讀：dnadna分子分子 ( (核酸核酸) )分子分子 抗原抗原抗體抗體 目的基因表達(dá)出的性狀目的基因表達(dá)出的性狀 5.基因工程的應(yīng)用基因工程的應(yīng)用（1 1）（2 2）預(yù)期蛋白質(zhì)功能預(yù)期蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)氨基酸序列推測(cè)氨基酸序列推測(cè)脫氧核苷酸序列推測(cè)脫氧核苷酸序列合成合成dnadna表達(dá)出蛋白質(zhì)表達(dá)出蛋白質(zhì)6.蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程（1 1）流程圖：）流程圖：中心法則的

6、逆推中心法則的逆推（2）基因修飾或基因合成）基因修飾或基因合成第二代基因工程第二代基因工程7.植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞融合植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)脫脫分分化化再再分分化化避光，有避光，有光過(guò)早刺光過(guò)早刺激分化激分化優(yōu)點(diǎn)：克服優(yōu)點(diǎn)：克服遠(yuǎn)緣雜交不遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙。親和的障礙。（1 1）流程圖）流程圖原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞的全能性性和細(xì)胞的全能性注：注：人工種皮中可以加入適量人工種皮中可以加入適量的養(yǎng)分、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)碳源以的養(yǎng)分、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)碳源以及農(nóng)藥及農(nóng)藥, ,抗生素抗生素, ,有益菌等有益菌等, ,以以利于胚狀體生長(zhǎng)發(fā)育成幼苗。利于胚狀體生長(zhǎng)發(fā)育

7、成幼苗。8.動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程（1 1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)流程圖流程圖【培養(yǎng)條件解讀】【培養(yǎng)條件解讀】無(wú)菌、無(wú)毒無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境的環(huán)境無(wú)菌處理、加抗生素殺菌、定期更無(wú)菌處理、加抗生素殺菌、定期更換培養(yǎng)液。換培養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和微量元葡萄糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和微量元素血清或血漿等天然成分。素血清或血漿等天然成分。原理：細(xì)胞增殖原理：細(xì)胞增殖溫度和溫度和phph(36.5(36.50.5)0.5)和和(7.2(7.27.4)7.4)。氣體環(huán)境氣體環(huán)境95%95%空氣空氣5%co5%co2 2?！咎崾尽俊咎崾尽縞oco2 2作用作用調(diào)節(jié)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)

8、培養(yǎng)基phph； 空氣中空氣中o o2 2作用作用細(xì)胞有氧呼吸；細(xì)胞有氧呼吸； 所用裝置所用裝置coco2 2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)箱。應(yīng)用應(yīng)用 生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)品：干擾素、疫苗、單克隆抗體。生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)品：干擾素、疫苗、單克隆抗體。 檢測(cè)并判斷某毒性物質(zhì)毒性的大小。檢測(cè)并判斷某毒性物質(zhì)毒性的大小。 臨床醫(yī)學(xué)研究。臨床醫(yī)學(xué)研究。 （2 2）動(dòng)物體細(xì)胞核移植動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物技術(shù)和克隆動(dòng)物流程圖：流程圖：原理：動(dòng)物細(xì)胞核的全能性原理：動(dòng)物細(xì)胞核的全能性【流程圖解讀】【流程圖解讀】卵母細(xì)胞選擇時(shí)期及原因：卵母細(xì)胞選擇時(shí)期及原因：減減中期的卵母細(xì)胞，此時(shí)具備受精能力，細(xì)胞質(zhì)中合成中期的卵母細(xì)胞，此時(shí)具備受

9、精能力，細(xì)胞質(zhì)中合成與分裂、分化有關(guān)的物質(zhì)能刺激融合后重組細(xì)胞進(jìn)行分裂與分裂、分化有關(guān)的物質(zhì)能刺激融合后重組細(xì)胞進(jìn)行分裂分化，形成重組胚胎。分化，形成重組胚胎。選卵細(xì)胞作為受體細(xì)胞的原因：選卵細(xì)胞作為受體細(xì)胞的原因：大，易于操作；大，易于操作；卵黃多，營(yíng)養(yǎng)豐富，為發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)；卵黃多，營(yíng)養(yǎng)豐富，為發(fā)育提供充足的營(yíng)養(yǎng)；能激發(fā)重組細(xì)胞分裂分化。能激發(fā)重組細(xì)胞分裂分化。該過(guò)程用到的技術(shù)手段：該過(guò)程用到的技術(shù)手段：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合、早期胚胎培養(yǎng)和胚胎移植。克隆克隆組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)試管動(dòng)物試管動(dòng)物( (嬰兒嬰兒) )生殖方式生殖方式無(wú)性無(wú)性無(wú)性無(wú)性有性有性遺傳物質(zhì)來(lái)源遺傳物質(zhì)來(lái)源2 2個(gè)親本個(gè)親本1 1個(gè)親本個(gè)親本2 2個(gè)親本個(gè)親本性別決定性別決定提供核親本提供核親本一般沒(méi)有一般沒(méi)有精子類型精子類型用途用