PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒

1、整理課件1實(shí)驗(yàn)三：實(shí)驗(yàn)三：PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒 整理課件2 乙肝病毒（乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，我）感染引起的乙型肝炎，我國(guó)發(fā)病率很高國(guó)發(fā)病率很高 ，HBV的檢測(cè)極其重要。的檢測(cè)極其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的傳染，乙存在就可以引起乙肝的傳染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒復(fù)制的發(fā)動(dòng)機(jī)制的發(fā)動(dòng)機(jī) 。 整理課件3 PCR技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的病毒，是判技術(shù)可以檢測(cè)出極微量的病毒，是判斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。斷其傳染性最直接、最可靠的證據(jù)。PCR技術(shù)技術(shù)已成為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察已成

2、為公認(rèn)的對(duì)病毒性肝炎的診斷、療效觀察及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。及預(yù)防研究工作最理想的方法之一。整理課件4一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握掌握PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理技術(shù)擴(kuò)增的原理2.熟悉熟悉PCR擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒的基本操作擴(kuò)增檢測(cè)乙肝病毒的基本操作過程。過程。整理課件5二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction) 簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱PCR,是在體外條件下利是在體外條件下利用用DNA聚合酶、催化一對(duì)引物間的特聚合酶、催化一對(duì)引物間的特異性異性DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)，它包括三個(gè)基本過程：術(shù)，它包括三個(gè)基本過程：整

3、理課件61.變性：變性：加熱加熱使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNA變?yōu)閱捂溩優(yōu)閱捂?.退火：退火：急速降溫急速降溫使引物和互補(bǔ)模板使引物和互補(bǔ)模板 在局部形成雜交鏈在局部形成雜交鏈 3.延伸：耐熱延伸：耐熱DNA聚合酶按聚合酶按5 3 方向催化以引物為起始點(diǎn)的方向催化以引物為起始點(diǎn)的 延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)整理課件7模板模板DNA高溫變性高溫變性低溫退火低溫退火引物引物適溫延伸適溫延伸經(jīng)過經(jīng)過25-35次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增次循環(huán)后，目的片段擴(kuò)增2n倍倍兩條子代兩條子代DNA一一次次循循環(huán)環(huán)Tap酶酶5335355353整理課件8三、主要器材及試劑三、主要器材及試劑1.主要器材：主要器材：9700型型PCR儀儀電泳

4、槽、電泳儀電泳槽、電泳儀整理課件9 紫外分析儀紫外分析儀臺(tái)式高速離心機(jī)臺(tái)式高速離心機(jī)整理課件102.主要主要試劑試劑：HBV-PCR定性檢測(cè)試劑盒定性檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)管反應(yīng)管HBV陽性標(biāo)本陽性標(biāo)本DNA提取液提取液整理課件11四、操作步驟四、操作步驟1.標(biāo)本處理：取患者血清標(biāo)本處理：取患者血清40l，加入，加入DNA提取液提取液40l，沸水浴，沸水浴10分鐘，分鐘，10000轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液分鐘，取上清液4l做做PCR反應(yīng)。反應(yīng)。整理課件122.加樣：加樣：加入提取好的標(biāo)本加入提取好的標(biāo)本4l，6000轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心10秒。秒。 取試劑盒中取試劑盒中PCR反應(yīng)管反應(yīng)管 TapDN

5、A聚合酶聚合酶10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液 4種種dNTP混合物混合物引引 物物(小分子小分子DNA片段片段） Mg2+整理課件13 三個(gè)擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間擴(kuò)增步驟溫度及時(shí)間 溫度溫度 時(shí)間時(shí)間變性變性 93 45（首次（首次5）退火退火 55 45延伸延伸 72 60（末次（末次5）循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)：25次次 3.PCR儀上擴(kuò)增：儀上擴(kuò)增：整理課件14PCR儀上擴(kuò)增儀上擴(kuò)增加入標(biāo)本加入標(biāo)本離心離心6000轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心10秒秒整理課件154.電泳檢測(cè)：電泳檢測(cè)：制備制備2%瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 2%瓊脂糖的制備：瓊脂糖的制備：電泳槽的準(zhǔn)備：電泳槽的準(zhǔn)備：稱取稱取0.8g瓊瓊脂糖脂糖40mlTBE

6、電泳緩沖液電泳緩沖液（PH8.0)煮沸溶解煮沸溶解加入加入冷卻冷卻60左右左右加入加入溴乙啶溴乙啶EB20l倒膠倒膠整理課件16加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物加樣：取擴(kuò)增后的產(chǎn)物10 ul點(diǎn)樣于凝膠孔點(diǎn)樣于凝膠孔取樣取樣點(diǎn)樣點(diǎn)樣整理課件17電泳：點(diǎn)樣端接電泳：點(diǎn)樣端接“-”，穩(wěn)壓，穩(wěn)壓，50V，電泳，電泳30分鐘。分鐘。五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色五、結(jié)果觀察：紫外分析儀下觀察，出現(xiàn)橙黃色條帶則為條帶則為HBV陽性陽性HBV陽性陽性HBV陰性陰性HBV陽性對(duì)照陽性對(duì)照HBV陰性對(duì)照陰性對(duì)照正極正極負(fù)極負(fù)極點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣孔整理課件18五、注意事項(xiàng)五、注意事項(xiàng)1. 試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)本及試劑盒內(nèi)陽性標(biāo)本及DNA提取液使用前需充提取液使用前需充分融化離心。分融化離心。2. 反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反應(yīng)液的表面為固體封蓋劑，電泳取樣時(shí)從反應(yīng)管底部