多肽類藥物個(gè)人見(jiàn)解

1、多肽類藥物氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，兩個(gè)以上的氨基酸縮合形成肽鏈(polypeptide chain)。蛋白質(zhì)是機(jī)體內(nèi)最重要的一類生物大分子，目前被廣泛地作為藥物用于疾病的治療。但是，蛋白質(zhì)類藥物也有缺點(diǎn)，如分子量大、制備困難、存在抗原性、體內(nèi)易降解等。令人驚喜的是，人們發(fā)現(xiàn)某些分子量較小的多肽同樣具有類似蛋白質(zhì)的活性，且功能更顯著。隨著對(duì)這類生物活性多肽的進(jìn)一步研究，已為新藥的研制和開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)新的途徑。從生物學(xué)角度看，多肽和蛋白質(zhì)的區(qū)別只是前者結(jié)構(gòu)小一些，后者結(jié)構(gòu)大一些。在人的生命活動(dòng)中，蛋白質(zhì)不斷分解變化，蛋白質(zhì)分解后形成多肽，多肽聚合又形成蛋白質(zhì)。在人體中，多肽是涉及各種細(xì)胞功能的生

2、物活性物質(zhì)，幾乎所有的細(xì)胞都能合成多肽，所有細(xì)胞又受多肽調(diào)節(jié)。生命科學(xué)之所以將目光投向多肽，原因恰恰在于多肽在人體內(nèi)擔(dān)當(dāng)?shù)倪@種獨(dú)特的生理和生化反應(yīng)的信使角色。蛋白質(zhì)和多肽之間在分子量上并無(wú)明確的區(qū)分，習(xí)慣上將胰島素(51個(gè)氨基酸組成，分子量5733)視為多肽和蛋白質(zhì)的界限。也有人將分子量小于104(或2×104)的氨基酸鏈稱為多肽。目前生物醫(yī)學(xué)在人體中已發(fā)現(xiàn)了1000多種具有活性的多肽，僅腦中就存在近40種，它們?cè)谏矬w內(nèi)的濃度很低，血液中一般僅有10-1210-9mol/L，但生理活性很強(qiáng)，在神經(jīng)、內(nèi)分泌、生殖、消化、生長(zhǎng)等系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的生理調(diào)節(jié)作用。人們比較熟悉的有谷胱甘

3、肽(3肽)、催產(chǎn)素(9肽)、加壓素(9肽)、腦啡肽(5肽)、-內(nèi)啡肽(31肽)、P物質(zhì)(10肽)等。作為藥用的肽，通常是由幾個(gè)到二十幾個(gè)氨基酸組成的比較短的多肽。開(kāi)發(fā)和發(fā)展內(nèi)源性活性物質(zhì)作為治療疾病的藥物具有重要的實(shí)用價(jià)值，因?yàn)樗亲罘先梭w生物學(xué)調(diào)節(jié)規(guī)律的治療手段，可以避免許多其他類型藥物給人體帶來(lái)的不良反應(yīng)。目前，全世界已經(jīng)應(yīng)用于臨床的多肽類藥物約有幾十種，包括人們熟知的胰島素、胸腺肽、抗艾滋病新藥T20以及肽類激素等。近幾年蛋白質(zhì)/多肽類藥物市場(chǎng)的發(fā)展速度驚人，年增長(zhǎng)率達(dá)24%，與增長(zhǎng)率僅為9%的總體醫(yī)藥市場(chǎng)相比，該領(lǐng)域令人注目。鑒于多肽生物活性高，一些肽在人的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、大腦活

4、動(dòng)、腫瘤病變、免疫防御、生殖控制、抗衰防老及分子進(jìn)化等方面又具有極其特殊的功能，多肽類藥物的研發(fā)自然成為近年生命科學(xué)的一大熱門(mén)領(lǐng)域。1. 多肽藥物的優(yōu)勢(shì)多肽藥物是近年來(lái)世界新藥研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，也是我國(guó)生物醫(yī)藥研究的重點(diǎn)方向之一。與傳統(tǒng)藥物相比，多肽藥物具有以下明顯的優(yōu)勢(shì)：(1) 活性高，在很低的劑量和濃度下即可表現(xiàn)出顯著的高活性；(2) 分子量小，相對(duì)蛋白質(zhì)而言易于人工化學(xué)合成，方便進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造；(3) 合成效率高。近年來(lái)技術(shù)的進(jìn)步使多肽的固相合成變得簡(jiǎn)單，過(guò)程自動(dòng)化，易于控制；(4) 副作用小。由于許多多肽藥物采用與人同源的序列，加之分子量小，無(wú)抗原性，不易引起免疫反應(yīng)。2. 常見(jiàn)多肽藥物分

5、類生物技術(shù)的發(fā)展極大地促進(jìn)了多肽、蛋白藥物的研制開(kāi)發(fā)，目前已有40 種以上重要的治療藥物上市，700多種生物技術(shù)藥物正進(jìn)行期臨床試驗(yàn)或接受FDA審評(píng)，其中200種以上的藥物進(jìn)入最后的批準(zhǔn)階段(期臨床與FDA評(píng)估)。2.1 根據(jù)分泌部位分類2.1.1 加壓素及其衍生物：腦神經(jīng)垂體素、加壓素、鞣酸加壓素、去氨精加壓素、苯賴加壓素、鳥(niǎo)加壓素(POR-8)等。2.1.2 催產(chǎn)素及其衍生物：催產(chǎn)素、去氨基催產(chǎn)素、催產(chǎn)素酒石酸等。2.1.3 促皮質(zhì)素及其衍生物：促皮質(zhì)素、鋅促皮質(zhì)素(ACTH-Zn)、磷鋅促皮質(zhì)素、明膠促皮質(zhì)素、羧纖促皮質(zhì)素、絲賴促皮質(zhì)18肽、 甘精促皮質(zhì)18肽、鋅促皮質(zhì)24肽、促皮質(zhì)24

6、肽、25肽、28肽等。2.1.4 下丘腦-垂體肽激素：促性腺素釋放激素、促甲狀腺素釋放激素、生長(zhǎng)激素釋放激素(CHRH)、生長(zhǎng)激素抑制素(CHIH，l4肽)、 促黑色素細(xì)胞抑制激素(MRIH)、促黑色素細(xì)胞釋放激素(MRH)、催乳素釋放激素(PRH)、催乳素抑制激素(PIH)、 促皮質(zhì)素釋放激素(LRH)等。2.1.5 消化道激素：促胃泌素34肽、17肽、14肽、5肽、4肽，胰泌素27肽、膽囊收縮素39肽、33肽、8肽，抑胃肽、 胃動(dòng)肽、血管活性肽、胰多肽、P物質(zhì)、神經(jīng)降壓肽、蛙皮肽14肽、10肽等。2.1.6 其他激素和活性肽：胸腺素a1(28肽)、胰高血糖素(29肽)、降鈣素(32肽)、血

7、管緊張肽(10肽)、(8肽)、(7肽)、腦啡肽、 內(nèi)啡肽、睡眠肽、記憶肽、松果肽、胰蛋白酶抑制劑、舒緩激肽(8肽)、蛙皮降壓肽(8肽)等。2.2 根據(jù)功能分類2.2.1 多肽疫苗傳染性疾病，例如肝炎、流感、瘧疾和血吸蟲(chóng)病等，流行很廣，危害很大。目前，雖然可用化學(xué)藥物治療且療效較好，但治愈后再感染率很高，在疫區(qū)需對(duì)再次感染者不停地進(jìn)行治療。因此，若要從根本上防治這些傳染性疾病，就必須借助于疫苗。雖然滅活或減毒疫苗有一定效果，但仍有引起感染的可能性。因此，對(duì)于危險(xiǎn)性很大的傳染病，如艾滋病等，人們就不敢使用滅活或減毒疫苗，對(duì)于這類疾病來(lái)說(shuō)，發(fā)展合成多肽疫苗顯得尤為重要。20世紀(jì)80年代初，Lerne

8、r提出了發(fā)展合成多肽疫苗的方法。首先確定天然抗原(如病毒或其亞單位)的氨基酸序列，并尋找抗原決定簇肽段；然后合成抗原肽，并試驗(yàn)其誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，選出具有免疫性和保護(hù)性的特異性抗原肽制備疫苗。多肽抗原作為完整病毒的一部分，不具備傳染疾病的危險(xiǎn)性，并可以大量合成生產(chǎn)，是未來(lái)疫苗發(fā)展的重要途徑之一。合成多肽疫苗研究的第一步是確定抗原肽，其后的關(guān)鍵是制備出有很好免疫原性，同時(shí)又無(wú)毒副作用的多肽抗原，并結(jié)合使用適當(dāng)?shù)淖魟?，以得到較好的免疫效果。由抗原肽制備的合成多肽抗原主要有3類：(1)抗原肽-載體復(fù)合抗原；(2)多抗原肽抗原；(3) 多價(jià)合成多肽疫苗抗原。目前對(duì)人類危害極大的兩種病毒性疾病艾滋病和

9、丙型肝炎均無(wú)理想的疫苗，核酸疫苗和多肽疫苗的研究結(jié)果令人鼓舞。1999年美國(guó)NIH公布了兩種HIV-I病毒多肽疫苗，對(duì)人體進(jìn)行的期臨床試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)兩種多肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和特異性細(xì)胞免疫，并有較好的安全性。我國(guó)清華大學(xué)也證實(shí)HIV-I膜蛋白內(nèi)一段多肽有很強(qiáng)的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也顯示有良好的發(fā)展前景，國(guó)外學(xué)者從丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2內(nèi)篩選出一段多肽，它可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。其它病毒(如甲肝、麻疹、辛德畢斯病毒等)的多肽疫苗及抗腫瘤，避孕等多肽疫苗的研究也取得了較大進(jìn)展。例如，美國(guó)學(xué)者NaZ等從噬菌體肽庫(kù)內(nèi)篩選出一個(gè)12氨基酸小肽，它能特異性地與人卵子結(jié)合，阻止精子與

10、卵子的結(jié)合，可用于避孕疫苗。2.2.2 抗腫瘤多肽腫瘤的發(fā)生雖然是多種原因作用的結(jié)果，但最終都要涉及癌基因的表達(dá)調(diào)控。不同的腫瘤產(chǎn)生時(shí)所需要的酶等調(diào)控因子不同，選擇特異性小肽作用于腫瘤發(fā)生時(shí)所需的調(diào)控因子等，封閉其活性位點(diǎn)，可防止腫瘤發(fā)生?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)很多腫瘤相關(guān)基因及腫瘤生長(zhǎng)調(diào)控因子，篩選與這些靶點(diǎn)特異結(jié)合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱點(diǎn)。美國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短肽(6個(gè)氨基酸)，它在體內(nèi)能顯著抑制腺癌的生長(zhǎng)，包括肺、胃及在大腸腺癌為治療這一死亡率很高的惡性腫瘤開(kāi)辟了一條新路。流感病毒血凝素-2氨基端模擬肽能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，激活抗癌基因p53，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。P物質(zhì)(10肽)的一個(gè)衍生物對(duì)小細(xì)

11、胞肺癌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)多種具有抗菌活性的多肽更敏感，目前對(duì)引起這種差別的原因還不完全清楚，初步認(rèn)為與以下幾個(gè)因素有關(guān)：由于腫瘤細(xì)胞的高代謝引起細(xì)胞膜電位的改變；腫瘤細(xì)胞膜外表面含有更高的酸性磷脂；腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架或胞外基質(zhì)的變化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cecropin及其類似物，magainin及其類似物，cecropinA-magainin，cecropinA-melittin雜合肽及其類似物都對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用。2.2.3 抗病毒多肽病毒感染后一般要經(jīng)歷吸附(宿主細(xì)胞)、穿入、脫殼、核酸復(fù)制，轉(zhuǎn)錄翻譯，包裝等多個(gè)階段。阻止任一過(guò)程均可防止病毒復(fù)制。最有效

12、的抗病毒藥物應(yīng)該是作用在病毒吸附及核酸復(fù)制兩個(gè)階段，因此篩選抗病毒藥物主要集中在病毒復(fù)制的這兩個(gè)階段。病毒通過(guò)與宿主細(xì)胞上的特異受體結(jié)合吸附細(xì)胞，依賴其自身的特異蛋白酶進(jìn)行蛋白加工及核酸復(fù)制。因此可從肽庫(kù)內(nèi)篩選與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的多肽或能與病毒蛋白酶等活性位點(diǎn)結(jié)合的多肽，用于抗病毒的治療。多肽藥物可以3種不同的機(jī)制起到抗病毒的作用。第1種是通過(guò)直接與病毒粒子相結(jié)合而發(fā)揮作用。如-defensins，modelin-1等對(duì)皰疹病毒的作用，polyphemusins對(duì)HIV病毒的作用。第2種是抑制病毒的繁殖，如mellitin和cecropin A對(duì)HIV病毒的作用。第3種機(jī)制是通過(guò)模仿病毒的侵染

13、過(guò)程而起作用。如蜂毒肽及其類似物的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒核衣殼與mRNA相互作用的區(qū)域具有相似性，通過(guò)干擾病毒的組裝而對(duì)病毒產(chǎn)生作用。HCV非結(jié)構(gòu)蛋白3區(qū)(NS3)是一個(gè)與病毒復(fù)制密切相關(guān)的蛋白酶，其活性位點(diǎn)已被確定，并且從肽庫(kù)內(nèi)篩選到一個(gè)6肽(DDIVPC)能顯著抑制該酶活性。同樣已從肽庫(kù)內(nèi)篩選到能與HIV復(fù)制必需的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合的小肽，及能與HIV外膜蛋白結(jié)合防止病毒進(jìn)入細(xì)胞的小肽。這些小肽部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。2.2.4 多肽導(dǎo)向藥物已知很多毒素(如綠膿桿菌外毒素)，細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素系列)等有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒性，但在人類長(zhǎng)期或大量使用時(shí)也可損傷正常細(xì)胞。將能和腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合的多肽與這些活

14、性因子進(jìn)行融合，則可將這些活性因子特異性地集中在腫瘤部位，可大大降低毒素、細(xì)胞因子的使用濃度，降低其副作用。比如，在很多腫瘤細(xì)胞表面存在表皮生長(zhǎng)因子的受體，其數(shù)量較正常細(xì)胞上的數(shù)目高幾十倍，甚至上百倍，將毒素或抗腫瘤細(xì)胞因子與表皮生長(zhǎng)因子融合，可將這些活性因子特異地聚集到腫瘤細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外已有幾家將表皮生長(zhǎng)因子與綠膿桿菌外毒素融合表達(dá)成功。同從肽庫(kù)內(nèi)篩選出能與腫瘤抗原特異結(jié)合的小肽，也可用于導(dǎo)向藥物，因其分子量小，比鼠源性的單克隆抗體更適合用于導(dǎo)向藥物。2.2.5 細(xì)胞因子模擬肽利用已知細(xì)胞因子的受體從肽庫(kù)內(nèi)篩選細(xì)胞因子模擬肽，近年成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。國(guó)外已篩選到了人促紅細(xì)胞生成素，人促血小板

15、生成素，人生長(zhǎng)激素、人神經(jīng)生長(zhǎng)因子及白細(xì)胞介素1等多種生長(zhǎng)因子的模擬肽，這些模擬肽的氨基酸序列與其相應(yīng)的細(xì)胞因子的氨基酸序列有所不同，但具有細(xì)胞因子的活性，并且具有分子量小的優(yōu)點(diǎn)。這些細(xì)胞因子模擬肽正處于臨床前或臨床研究階段。2.2.5.1 胸腺肽胸腺五肽(thymopentin， TP5)是目前世界上處方量居第一位的免疫調(diào)節(jié)劑。TP5是人工合成的五肽，其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與胸腺生成素的第3236位的氨基酸組成相同，即為T(mén)P的主要活性部位，功能與TP相同。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明胸腺五肽對(duì)免疫功能低下和自身免疫疾病患者的免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。正是由于胸腺五肽優(yōu)良的免疫調(diào)節(jié)功能，使其在非典時(shí)期

16、的醫(yī)藥市場(chǎng)上十分搶手。2.2.5.2干擾素干擾素是哺乳動(dòng)物細(xì)胞在誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種高活性、多功能的淋巴因子，其相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×104。干擾素作用于相應(yīng)的其他同種生物細(xì)胞，并使其獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面的“免疫力”。它能夠抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。目前，人們已經(jīng)利用大腸桿菌系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)成功地高效表達(dá)了干擾素。已上市的干擾素制劑有13種，其中-IFN 7種，-IFN 2種，-IFN 4種，取得許多國(guó)家的批準(zhǔn)，用于臨床。2.2.5.3 白細(xì)胞介素白細(xì)胞介素是一類抗腫瘤免疫因子，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化，也能夠促進(jìn)B細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖

17、，并且能夠增強(qiáng)殺傷性淋巴細(xì)胞的功能，也用于癌癥的治療。白細(xì)胞介素包括29個(gè)成員，其中白細(xì)胞介素-2是含量最高的一種。目前，重組白細(xì)胞介素2和白細(xì)胞介素3已經(jīng)上市.2.2.5.4 集落刺激因子集落刺激因子可以分為兩類，即粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。這類細(xì)胞因子促進(jìn)體內(nèi)白細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)粒細(xì)胞的功能，調(diào)控造血功能，可用于治療腫瘤病人化療后白細(xì)胞下降等癥狀。目前已有產(chǎn)品上市，年產(chǎn)值達(dá)數(shù)億美元.粒細(xì)胞集落刺激因子(商品名惠爾血，粒生素，欣粒生等)能促進(jìn)粒細(xì)胞集落的形成，促進(jìn)造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞增殖、分化。對(duì)成熟的中性粒細(xì)胞可促進(jìn)游走、吞噬、產(chǎn)酶、釋放活性氧、殺菌能力和對(duì)外來(lái)異物的

18、黏著作用。還可動(dòng)員成熟中性粒細(xì)胞從骨髓進(jìn)入外周。能使早期多能造血干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，連日應(yīng)用可促使骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)入外周血。適用于骨髓移植后促進(jìn)中性粒細(xì)胞的升高；腫瘤、白血病化療后的中性粒細(xì)胞減少癥；骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血伴發(fā)的中性粒細(xì)胞減少癥；先天性、特發(fā)性中性粒細(xì)胞減少癥。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(商品名吉姆欣)能與粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞系前體細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)其增殖分化，產(chǎn)生中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞。與高濃度紅細(xì)胞生成因子有協(xié)同作用，促進(jìn)紅細(xì)胞的活力。并能促進(jìn)成熟細(xì)胞向外周血釋放。體外研究表明，本品尚可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解作用。能提

19、高機(jī)體抗腫瘤和抗感染免疫力。2.2.5.5 生長(zhǎng)激素人生長(zhǎng)激素可用于治療侏儒癥和促進(jìn)傷口愈合，動(dòng)物生長(zhǎng)激素能夠加速家禽生長(zhǎng)，增加奶的產(chǎn)量。目前，人和動(dòng)物的生長(zhǎng)激素基因都已經(jīng)在大腸桿菌中得到成功表達(dá)，并已有產(chǎn)品投放市場(chǎng)，年產(chǎn)值達(dá)到6.25億美元，并在醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)領(lǐng)域取得了很好的應(yīng)用效果。2.2.5.6紅細(xì)胞生成素紅細(xì)胞生成素是一種由腎臟產(chǎn)生的作用于骨髓的造血相關(guān)細(xì)胞因子。它可以縮短原始紅細(xì)胞的成熟期，調(diào)節(jié)骨髓中的造血細(xì)胞含量。可用于腎功能不全引起的貧血，放射化療引起的貧血，以及其他一些罕見(jiàn)的貧血癥的治療。此外，還可用于外科手術(shù)前準(zhǔn)備自體輸血的病人。紅細(xì)胞生成素是一種糖肽，糖基化對(duì)它的功能至關(guān)重要

20、，因此不能在大腸桿菌等原核細(xì)胞中表達(dá)。目前，采用的方法是在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，因而成本很高，生產(chǎn)過(guò)程比較復(fù)雜。盡管如此，它上市后產(chǎn)值仍高達(dá)每年12.25億美元，居多種重組藥物之首。2.2.6 抗菌性活性肽幾乎所有類型的生物在微生物入侵時(shí)，其機(jī)體都會(huì)產(chǎn)生一些物質(zhì)加以抵御，這些物質(zhì)中大部分是小分子多肽，即抗菌肽。當(dāng)昆蟲(chóng)受到外界環(huán)境刺激時(shí)產(chǎn)生大量的具有抗菌活性的陽(yáng)離子多肽，已篩選出百余種抗菌肽?？咕囊话阌?245個(gè)氨基酸構(gòu)成，來(lái)自不同物種的抗菌肽一級(jí)結(jié)構(gòu)有相似之處，如含精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸而帶有正電，呈疏水性或雙親性?？咕囊蚱浣Y(jié)構(gòu)和作用方式不同可分成兩大類：一類是具有螺旋結(jié)構(gòu)

21、的線性多肽；另一類是由一個(gè)或多個(gè)二硫鍵或硫醚連接構(gòu)成的環(huán)形多肽，含有-折疊和(或)-螺旋。由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好、免疫原性較低、作用迅速、抗菌譜廣等特點(diǎn)，不僅可以抑殺細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)，對(duì)多種癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和實(shí)體瘤也有明顯的抑制作用，且某些抗菌肽在發(fā)揮以上作用時(shí)對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有破壞作用。目前，傳統(tǒng)的抗生素大多出現(xiàn)了與其相應(yīng)的耐藥致病菌株，常用的抗癌藥物又對(duì)“敵我”細(xì)胞不能區(qū)分，而抗菌肽不受已產(chǎn)生的耐藥性突變影響，靶菌株也不易出現(xiàn)耐藥性突變，另外其獨(dú)特的選擇毒性作用和其較低的免疫原性引起人們廣泛的興趣，使其成為新一代的抗菌、抗癌藥物。cecropins、ma

22、gainins、defensins等許多可形成雙親螺旋結(jié)構(gòu)的多肽抗生素是通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，在膜上形成離子通道，引起胞內(nèi)物質(zhì)的外漏而殺死細(xì)菌的。通過(guò)對(duì)sarcotoxin IA的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在脂質(zhì)體中存在膽固醇時(shí)，sarcotoxin IA對(duì)其的裂解作用減弱。這可部分解釋這類多肽對(duì)真核細(xì)胞不起作用的原因。apidaecins類多肽抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制是非裂解機(jī)制，可能是通過(guò)與膜上的手性分子相互作用進(jìn)而殺死細(xì)菌的。許多多肽抗生素除了具有抗細(xì)菌的活性外，還具有抗真菌的作用。如來(lái)源于蛙類的PGQ，dermaseptin和哺乳動(dòng)物的defensins對(duì)一些人類致病真菌具有殺傷作用，其中兔defe

23、nsinNP-1對(duì)玉米的致病真菌也有作用。一些來(lái)源于植物的多肽抗生素，如植物defensins、thionins等對(duì)多種植物致病真菌具有殺傷作用。最近，Cavallarin等發(fā)現(xiàn)cecropin衍生物N末端螺旋區(qū)域的11個(gè)氨基酸順序與抗真菌活力有關(guān)。2.2.7 用于心血管疾病的多肽很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用，不僅可用作藥物，亦可用作保健食品。但由于其作用成份不能確定。其應(yīng)用受到很大限制?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多有效成分是小分子多肽，比如我國(guó)科學(xué)家從大豆內(nèi)加工分離出的小分子活性多肽(MW<1000)，可通過(guò)小腸直接吸收，能防治血栓，高血壓和高血脂，還能延緩衰老，提高肌體抗腫瘤能力。來(lái)源

24、于-和-玉米醇溶蛋白的玉米多肽(Leu-Gln-Gln、Val-Ser-Pro、Leu-Gln-Pro、Leu-Ala-Tyr和Val-Ala-Tyr)；來(lái)源于無(wú)花果乳液的肽類Ala-Val-Asp-Pro-Ile-Arg，Leu-Tyr-Pro-Val-Lys和Leu-Val-Arg均有抗高血壓作用；從人參、茶葉、銀杏葉等植物內(nèi)也分離出很多用于心血管疾病的小肽。2.2.8 其它藥用小肽小肽藥物除在上述幾大方面已取得較大進(jìn)展外，在其它很多領(lǐng)域也取得一些進(jìn)展。比如stiernberg等發(fā)現(xiàn)一個(gè)合成肽(TP508)肽能促進(jìn)傷口血管的再生，加速皮膚深度傷口的愈合。Pfister等發(fā)現(xiàn)一個(gè)小肽(RTR

25、)4能防止堿損傷角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的侵潤(rùn)，抑制炎癥反應(yīng)。Carron等證實(shí)其篩選的2個(gè)合成肽能抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨質(zhì)的重吸收。內(nèi)嗎啡肽-1是國(guó)內(nèi)學(xué)者研究較深入的另一個(gè)具有開(kāi)發(fā)前景的鎮(zhèn)痛多肽。具有強(qiáng)烈鎮(zhèn)痛活性，其活性高于嗎啡。它存在于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)，是內(nèi)源性的阿片受體的激動(dòng)劑。內(nèi)嗎啡肽-1是迄今所知對(duì)阿片受體親和力和選擇性最高的生物活性肽。由于它只含有4個(gè)氨基酸，國(guó)內(nèi)學(xué)者采用液相合成方法，方便快速、純度高，且能大量合成。 2.2.9 診斷用多肽多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測(cè)病毒、細(xì)胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲(chóng)、錐蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)的抗體，多肽抗原比天然微生物或寄生蟲(chóng)蛋白抗原的特異性強(qiáng)，且易于制備，

26、因此裝配的檢測(cè)試劑，其檢測(cè)抗體的假陰性率和本底反應(yīng)都很低，易于臨床應(yīng)用?，F(xiàn)在用多肽抗原裝配的抗體檢測(cè)系統(tǒng)有針對(duì)甲、乙、丙、庚型肝炎病毒、艾滋病病毒、人巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、萊姆病及類風(fēng)濕的試劑盒。使用的多肽抗原大部分是從相應(yīng)致病體的天然蛋白內(nèi)分析篩選獲得，有些是從肽庫(kù)內(nèi)篩選的全新小肽。2.2.10 食品感官肽 阿斯巴甜(Aspartame)作為一種非糖甜味劑是一類開(kāi)發(fā)較成功的食品感官肽。阿斯巴甜由苯丙氨酸與天冬氨酸為原料合成，其甜度為蔗糖的200倍，可供糖尿病患者等忌糖者食用，且熱量低，可用作減肥保健品。賴氨酸二肽(如N-Ac-Phe-Lys)被證明是有效

27、的阿斯巴甜替代品，因?yàn)樗缓絮サ墓δ芴匦裕蚨谑称芳庸ず蛢?chǔ)存過(guò)程中更加穩(wěn)定。我國(guó)人口眾多，食品消費(fèi)量數(shù)值驚人，甜味劑需求潛力很大。其它食品感官肽還有苦味肽、酸味肽、咸味肽、增強(qiáng)風(fēng)味肽、苦味掩蓋肽、抗氧化肽、表面活性肽等。這些食品感官肽能夠模擬、掩蓋和增進(jìn)口感。如咸味肽作為無(wú)鈉調(diào)味劑，可為糖尿病患者和高血壓患者所用，也可作為保健食品。而風(fēng)味肽則可作為加工食品的風(fēng)昧和香味的前體，起到增強(qiáng)風(fēng)味的作用。表面活性肽則可作為食品的穩(wěn)定劑和乳化劑。食品感官肽在我國(guó)生產(chǎn)和應(yīng)用剛剛起步，但市場(chǎng)潛力巨大，值得進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)。3多肽藥物的穩(wěn)定性問(wèn)題及其對(duì)策：多肽因子、蛋白藥物主要通過(guò)降解、排泄、以及受體介導(dǎo)的

28、內(nèi)吞等作用在體內(nèi)被清除。其中分子量小于20kDa的多肽因子在代謝過(guò)程中易由腎小球?yàn)V過(guò)；通過(guò)腎小管時(shí)多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，因而半衰期短。為維持一定的療效需要大劑量反復(fù)用藥，長(zhǎng)期的頻繁注射不僅增加了病人的痛苦而且易引發(fā)一系列副反應(yīng)。近幾年各國(guó)學(xué)者主要從化學(xué)修飾、基因融合、點(diǎn)突變以及制劑改造等方面著手進(jìn)行長(zhǎng)效多肽藥物的研究。3.1 引起多肽不穩(wěn)定的原因3.1.1 脫酰胺反應(yīng)：在脫酰反應(yīng)中，Asn/Gln 殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)與環(huán)境條件和多肽結(jié)構(gòu)有關(guān)，提高pH值、升高溫度都有利于脫酰胺反應(yīng)的進(jìn)行。在Asn-Gly-結(jié)構(gòu)中的酰胺基團(tuán)更易水解，位于分子表

29、面的酰胺基團(tuán)也比分子內(nèi)部的酰胺基團(tuán)易水解。 3.1.2 氧化：多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過(guò)氧化物的污染，二是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對(duì)氧化也都有影響。3.1.3 水解：多肽中的肽鍵易水解斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽鍵。3.1.4 形成錯(cuò)誤的二硫鍵：二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯(cuò)誤的二硫鍵，導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)改變和活性喪失。 3.1.5 消旋：除Gly外，所有氨基酸殘基的碳原子都是手性的，易在堿催化下發(fā)生消旋反應(yīng)。其中Asp殘基

30、最易發(fā)生消旋反應(yīng)。 3.1.6 -消除：-消除是指氨基酸殘基中碳原子上基團(tuán)的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr等殘基都可通過(guò)-消除降解。在堿性PH下易發(fā)生-消除，溫度和金屬離子對(duì)其也有影響。 3.1.7 變性、吸附、聚集或沉淀：變性一般都與三級(jí)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。在變性狀態(tài)，多肽往往更易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，活性難以恢復(fù)。在多肽變性過(guò)程中，首先形成中間體。通常中間體的溶解度低，易于聚集，形成聚集體，進(jìn)而形成肉眼可見(jiàn)的沉淀。蛋白質(zhì)的表面吸附是其貯存、使用過(guò)程中遇到的另一個(gè)令人頭痛的問(wèn)題，如riL-2在進(jìn)行曲灌注時(shí)會(huì)吸附在管道表面，造成活性損失。3.2 增加多肽藥物穩(wěn)定性的方法3.2.1

31、 改進(jìn)多肽的自身結(jié)構(gòu)：3.2.1.1 定點(diǎn)突變 通過(guò)基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)定性的殘基，可提高多肽的穩(wěn)定性。 利用寡核苷酸引物、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變及盒式突變等方法使蛋白藥物中影響活性或穩(wěn)定性的氨基酸發(fā)生突變可以有效提高蛋白穩(wěn)定性，增加藥物半衰期。例如白介素-2是一條133個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，其中呈游離狀態(tài)的Cys-125易形成錯(cuò)誤的二硫鍵配對(duì)或形成分子之間的二聚體影響活性和穩(wěn)定性，將Cys-125用Ser或Ala取代后生物活性比正常高1倍，體內(nèi)半衰期由數(shù)分鐘提高到1.2h。重組組織型纖溶酶源激活劑(rtPA)能高效特異地溶解血栓，目前兩種新型tPA(K2-tP

32、A、TNK-tPA)已被歐洲和美國(guó)批準(zhǔn)上市。K2-tPA保留了tPA1-3及176527位氨基酸的肽段，缺失K1區(qū)、E區(qū)和F區(qū)使之成為單鏈多肽，無(wú)糖基側(cè)鏈，半衰期延長(zhǎng)45倍；TNK-tPA突變體是將tPA 103位Thr變成Asn；117位Asn變成Gln；Lys296-His297-Arg298-Arg299替換成4個(gè)Ala，該突變體血清清除速率降低4倍左右，已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。自然界中亦存在天然突變體，使其具有更高的生物學(xué)活性和更長(zhǎng)的血漿半衰期，如載脂蛋白AI(apoAI)的米蘭突變體(AIM)，即apoAI的Arg173突變?yōu)镃ys173，兩個(gè)AIM單體通過(guò)Cys173之間的二

33、硫鍵形成同源二聚體，血漿半衰期得到進(jìn)一步延長(zhǎng)。3.2.1.2 化學(xué)修飾 選擇合適的修飾方法和控制修飾程度可提高多肽的生物活性，提高熱穩(wěn)定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期?；瘜W(xué)修飾是延長(zhǎng)蛋白藥物半衰期的一個(gè)有效途徑，其中應(yīng)用最為廣泛的修飾劑是單甲氧基聚乙烯二醇(methoxypoly ethylene glycol，mPEG)，其次是多糖類如葡聚糖、聚蔗糖、淀粉等；同源蛋白質(zhì)、人工合成多肽類如白蛋白、聚丙氨酸等；長(zhǎng)鏈脂肪酸類以及聚烯屬烴基化合物、聚酸酐等。PEG是惰性、兩親、不帶電荷的柔性聚合物，分子量隨聚合程度而變化(150kDa)，有線性和支鏈兩種構(gòu)型，其中線性單甲氧基聚乙烯

34、醇(mPEG)已經(jīng)FDA批準(zhǔn)作為許多藥物的安全載體。mPEG通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)連接，對(duì)蛋白表面氨基進(jìn)行修飾以有效地改變多肽、蛋白藥物在體內(nèi)的分布和藥物學(xué)特性。目前mPEG修飾已應(yīng)用于40多種不同蛋白的修飾如豬血清白蛋白(BSA)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-2(IL-2)等。PEG修飾后血漿半衰期一般可延長(zhǎng)幾倍至幾十倍甚至是上百倍，但大部分蛋白的免疫原性也有所降低，而蛋白的生物活性也有不同程度降低。這可能是由于PEG大分子在蛋白分子周圍形成一層外殼阻礙了免疫細(xì)胞與蛋白的接觸保護(hù)了蛋白，掩蓋了蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)避免蛋白酶降解的發(fā)生，但同時(shí)也使蛋白的活性位點(diǎn)受到影響。中國(guó)藥科大學(xué)田泓等用

35、聚乙二醇修飾干擾素2的研究表明活性損失與修飾率有關(guān)，修飾率保持在30%以內(nèi)時(shí)生物活性保持較好。Yamasaki等在PEG修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)中發(fā)現(xiàn)修飾位點(diǎn)的多少(即1分子rhG-CSF與幾分子PEG結(jié)合)對(duì)半衰期的延長(zhǎng)方面并無(wú)多大影響，但修飾位點(diǎn)少活性損失就相對(duì)少一些；為保持蛋白的生物活性，采取位點(diǎn)特異性修飾即將蛋白功能結(jié)構(gòu)域中易與PEG結(jié)合的氨基酸殘基換成功能相似不干擾蛋白與PEG結(jié)合的氨基酸殘基如賴氨酸替換成精氨酸。PEG修飾應(yīng)用十分廣泛，它對(duì)酶、多肽、受體、抗體片斷等均能實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)以延長(zhǎng)半衰期，抗體藥物是繼疫苗之后的第二大生物技術(shù)藥物產(chǎn)業(yè)，但是異體抗體容易產(chǎn)生免疫

36、識(shí)別而被清除，經(jīng)PEG修飾后就可得到明顯改善，從而為抗體更廣泛地應(yīng)用于疾病的治療提供了基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，不少PEG修飾蛋白藥物已經(jīng)上市或者進(jìn)入臨床。另外，掩蔽多肽分子的末端羧基或/和氨基基團(tuán)，也可以對(duì)抗外肽酶，減少水解作用。多糖和白蛋白作為化學(xué)修飾劑也有成功范例：用于治療血栓的葡聚糖-鏈激酶已在俄羅斯上市；白蛋白已作為多種蛋白藥物的載體，白蛋白-SOD半衰期由5min提高到6h；白蛋白-GH半衰期由5min提高23h，將rhG-CSF通過(guò)異雙功能試劑聚乙二醇與白蛋白共價(jià)偶聯(lián)，使G-CSF的體內(nèi)清除速度降低約6倍。也有將蛋白藥物與抗體偶聯(lián)來(lái)延長(zhǎng)藥物半衰期的報(bào)道。但是化學(xué)修飾是完全隨機(jī)的，

37、帶來(lái)的產(chǎn)物不均一性及藥物活性的降低似乎是不可避免的，為此有人提出采用酶法進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾。對(duì)于修飾劑的活化方法、修飾位點(diǎn)、修飾率、修飾反應(yīng)時(shí)間等都需要深入研究。3.2.1.3 基因融合通過(guò)基因融合技術(shù)增加多肽和蛋白藥物分子量或改變與受體的親和性等原理延長(zhǎng)藥物半衰期。人血清白蛋白(HSA)是現(xiàn)有天然載體蛋白之一，并且是血液中含量最高的單一蛋白(達(dá)40g/L)，是人體血漿的主要成分，在體內(nèi)有維持血液滲透壓，運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)和其它重要生物物質(zhì)的作用，具有無(wú)免疫原性，人體相容性好，分子量大(約為66kDa)，半衰期長(zhǎng)(達(dá)兩周)等穩(wěn)定劑和多肽運(yùn)載蛋白的必需性質(zhì)，它已成功地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。日本Green Cross公司酵母表達(dá)的HSA 已完成期臨床實(shí)驗(yàn)和規(guī)模化生產(chǎn)的準(zhǔn)備，臨床實(shí)驗(yàn)證明酵母表達(dá)的HSA與天然的HSA在效果和安全性方面完全一致。1990年英國(guó)delta公司首先將白蛋白用于