最新定量與常規(guī)PCR的差別

1、常規(guī)常規(guī)pcrpcr技術(shù)：技術(shù)：對對pcr擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物終產(chǎn)物進(jìn)行定量進(jìn)行定量及定性分析及定性分析定量定量pcrpcr技術(shù)：技術(shù)：通過對通過對pcr擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)從而實現(xiàn)對對起始模板起始模板定量及定性的分析定量及定性的分析三個關(guān)鍵詞：實時，定量，熒光三個關(guān)鍵詞：實時，定量，熒光opticon實時熒光定量實時熒光定量pcr儀之儀之 ct值的定義是值的定義是pcr擴(kuò)增過程中，熒光擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)。 實時熒光

2、定量實時熒光定量pcr方法利用循環(huán)閾值方法利用循環(huán)閾值（ctct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測，此時樣品間的細(xì)小誤差段進(jìn)行檢測，此時樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該尚未放大，因此該ctct值具有極好的重值具有極好的重復(fù)性。復(fù)性。 q初始初始 dnadna量越多量越多, , 熒光熒光達(dá)到某一值（域值）時達(dá)到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少所需要的循環(huán)數(shù)越少qloglog濃度與循環(huán)數(shù)呈線濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模計算出樣品中所含的模板量板量確定初始模板的濃度確定初始模板的

3、濃度r1r2rqqsybr green 1 結(jié)合到雙鏈dna的小溝部位qsybr green 1 染料只有和雙鏈dna結(jié)合后才發(fā)熒光。gtttggcccccccaaagggacttgatagcatcgtaagttttttggggccccccccaaaaataccggggttacgaacggtaat變性 dna未結(jié)合sybr green 1 dyeq起始模板濃度定量q融解曲線分析 -可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體q基因型分析q使用方便 - 不必設(shè)計復(fù)雜的引物 q沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 q便宜 q靈敏q與非特異性產(chǎn)物結(jié)合與非特異性產(chǎn)物結(jié)合發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜

4、交探針原理：熒光諧振能量傳遞（原理：熒光諧振能量傳遞（fret） 莖由互補配對的序列組成莖由互補配對的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對環(huán)與目標(biāo)序列完全配對莖莖熒光素?zé)晒馑卮銣鐒┐銣鐒┉h(huán)環(huán)taccgggggttacgaacggtaattaccgggggttacgaacggtaattaccgggggttacgaacg gtaatttttgcccccaaaaq熒光素目標(biāo)序列莖淬滅劑q定量起始模板濃度定量起始模板濃度q基因型分析基因型分析q鑒定產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物q單核苷酸單核苷酸多態(tài)性（多態(tài)性（snp）檢測）檢測q對目標(biāo)序列有很高的特異性對目標(biāo)序列有很高的特異性 用于用于snpsnp檢測的最靈敏的試劑之一檢測的

5、最靈敏的試劑之一q熒光背景低熒光背景低q設(shè)計困難設(shè)計困難q無終點分析功能無終點分析功能q只能用于一個特定的目標(biāo)只能用于一個特定的目標(biāo)q價格較高價格較高探針探針熒光素?zé)晒馑卮銣鐒┐銣鐒┧庑碗s交探針?biāo)庑碗s交探針q目標(biāo)特異性探針q5 為熒光素， 3 為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標(biāo)序列互補3355模板和探針雜交5533forwardprimerreverseprimerqr3355taccgggggttacgaacg gtaatg a t c c t a c cg a t c c c a c cq定量起始模板濃度定量起始模板濃度q基因型分析基因型分析q產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物鑒定qsnpsnp分析分析q對目標(biāo)序列有很高的特異性 -特別適合于snp檢測q與 molecular beacons 相比設(shè)計相 對簡單結(jié)合于雙鏈結(jié)合于雙鏈dna的小溝的小溝中中發(fā)夾型雜交探發(fā)夾型雜交探針針?biāo)庑碗s交探水解型雜交探針（針（5-3外切）外切）延伸延伸復(fù)性復(fù)性任何任何步驟步驟定量和檢測目標(biāo)基因定量和檢測目標(biāo)基因融解曲線分析融解曲線分析snp分析分析定量和檢測目標(biāo)