果糖的測定 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器法》

1、煙草及煙草制品 麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的測定 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器法標準項目試驗報告煙草及煙草制品 麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的測定 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器法標準項目組2012年3月目 錄1. 綜述12. 實驗原理22.1 實驗原理22.2 蒸發(fā)光檢測器工作原理723. 材料與研究方法33.1 儀器及試劑33.2 研究路線33.3 分析方法43.3.1 樣品制備43.3.2 標準溶液43.3.2.1 標準儲備液43.3.2.2 標準工作溶液43.3.3 液相色譜-蒸發(fā)光檢測器分析條件53.3.4 樣品含量的測定與計算53.3.5 混合標準工作溶液和樣品溶液典型色譜圖64. 結果與討論

2、74.1 樣品量的選擇74.2 萃取條件優(yōu)化74.2.1 萃取溶劑的選擇74.2.2 萃取方式的選擇114.2.3萃取體積的選擇114.2.4 萃取時間的選擇124.3 空白和干擾試驗124.4 標準溶液穩(wěn)定性試驗134.5 前處理實驗條件小結134.6 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器分析方法144.6.1 LC分析條件144.6.1.1 色譜柱的選擇144.6.1.2 流動相的選擇154.6.1.3 流速的選擇154.6.1.4 柱溫的選擇154.6.2 ELSD參數(shù)的確定164.6.2.1 漂移管溫度的選擇164.6.2.2 氮氣流量的選擇164.6.2.3 增益的選擇174.7 方法評價184

3、.7.1 標準曲線線性、檢出限和定量限184.7.2 重復性試驗184.7.3 回收率試驗214.7.4 與行業(yè)推薦標準方法的比對224.7.5 再現(xiàn)性試驗（不同地區(qū)實驗室間的比較）235. 檢測實例24參考文獻27煙草及煙草制品 麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的測定 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器法試驗報告1. 綜述煙草中的水溶性糖與煙草的吃味、香味特征和焦油生成量關系密切，測定其含量對配方設計、工藝生產(chǎn)、煙草品質控制及卷煙降焦減害具有十分重要的意義。麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖是煙草中重要的水溶性糖。麥芽糖和蔗糖在酸性條件下，可水解為2分子的單糖，是重要的煙草二糖。對于糖的測定方法，早期主要采用紙色譜

4、法、薄層色譜法、化學法、比色法、酶法、碘量法等經(jīng)典方法進行混合糖(總糖)的分析，這些方法分辨率低、分析時間長、定量困難、難以實現(xiàn)自動化操作。我國煙草行業(yè)中常用的方法有芒森 .沃克法、連續(xù)流動分析法和近紅外（NR）光譜法，這幾種方法均是以葡萄糖含量來計算煙草中水溶性糖的總量（或還原糖的百分含量）。氣相色譜也可用于糖的測定，但由于其需要衍生化操作，步驟繁瑣、耗時較長，現(xiàn)在測定糖類物質很少采用氣相色譜法。對糖類物質的直接測定法目前主要有高效液相色譜法、離子色譜法和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法，這三種方法都無需進行柱前衍生化操作。HPLC-MS分析糖類物質靈敏度高、分析速度快，非常適合痕量分析。

5、由于煙草和煙草制品中麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量較高，無需使用高靈敏度的HPLC-MS法。離子色譜也較多的應用于煙草中糖的測定，也可以達到較低的檢測限，適用于對微量糖類物質的測定。由于其靈敏度較高，檢測前需對樣品進行較大倍數(shù)的稀釋，且分析時間較長，平均測試一個樣品需要1小時，甚至更長的時間，不利于檢測效率的提高，所以高效液相色譜法是目前采用較多的檢測糖的方法16。高效液相色譜法測定水溶性糖，目前使用較多的檢測器是示差折光檢測器和蒸發(fā)光檢測器。示差檢測器易受溶劑前沿峰的干擾使分析復雜化，對溫度敏感，導致基線不穩(wěn)定。蒸發(fā)光檢測器是上世紀八十年代發(fā)展起來的新型通用型檢測器，響應不依賴于樣品的光學

6、特性，不受其官能團的影響，揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，可獲得穩(wěn)定的基線，使分辨率更好 7。所以項目組在充分查閱國內外相關資料和大量的試驗的基礎上，欲建立煙草及煙草制品中麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器（HPLC- ELSD）方法，以期使高效液相法測糖的準確性更好，檢測效率更高。2. 實驗原理2.1 實驗原理煙草及煙草制品樣品用0.02mol/L氫氧化鈉溶液萃取后，采用蒸發(fā)光檢測器的高效液相色譜測定樣品的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖，外標法定量。2.2 蒸發(fā)光檢測器工作原理7檢測原理(Principle Of Operation)蒸發(fā)光散射檢測器的獨特檢測原理包括以下三個

7、步驟：首先將柱洗脫液霧化形成氣溶膠，然后在加熱的漂移管中將溶劑蒸發(fā)，最后余下的不揮發(fā)性溶質顆粒在光散射檢測池中得到檢測。霧化(Nebulization) 蒸發(fā)(Evaporation) 檢測(Detection) 1 霧化(Nebulization) ：經(jīng)HPLC 分離的柱洗脫液進入霧化器，在此與穩(wěn)定的霧化氣體（一般為氮氣）混合形成氣溶膠。氣溶膠由均勻分布的液滴組成，液滴大小取決于分析中采用的氣體流量。氣體流量越低形成的液滴越大，液滴越大則散射的光越多，從而提高了分析靈敏度，但是越大的液滴在漂移管中越難蒸發(fā)。每種方法均存在產(chǎn)生最佳信號噪音比率的最優(yōu)化氣體流量。2 蒸發(fā)(Evaporation)

8、：氣溶膠中揮發(fā)性成分在加熱的不銹鋼漂移管中蒸發(fā)。為特定應用設置適當?shù)钠乒軠囟?，取決于流動相的組成和流速，以及樣品的揮發(fā)性。最佳溫度需要通過觀察各溫度時的信號噪音比率來確定。3 檢測(Detection)：懸浮于流動相蒸汽中的樣品顆粒從漂移管進入到光散射檢測池。在檢測池中，樣品顆粒散射激光光源發(fā)出的光，而蒸發(fā)的流動相不散射。散射光被硅光電二極管檢測。3. 材料與研究方法3.1 儀器及試劑（1）1100 HPLC，配備G1378B脫氣機、G1311A四元泵、G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱（美國Agilent公司）和 蒸發(fā)光檢測器（美國Alltech公司）；（2）Milli-Q Exl

9、ix 5 純水機（美國Millipore公司）；（3）HY-8回旋振蕩器（國產(chǎn)，常州國華電器有限公司）；（4）德國Sartorious電子天平ME414S；（5）蔗糖，D(-)-果糖，D-(+)-無水葡萄糖和麥芽糖（美國Sigma-Aldrich公司）；（6）氫氧化鈉（分析純）；（7）乙腈（色譜純）；（8）水（符合GB/T 6682中一級水的規(guī)定）；（9）其它實驗室通用玻璃器皿。3.2 研究路線（1） 樣品準備：抽樣方法及實驗前準備工作；（2） 樣品前處理方法的確定：稱取樣品量、萃取溶劑、萃取方式、萃取體積、萃取時間的優(yōu)化；（3） 高效液相色譜條件的選擇：色譜柱的確定，流動相的確定，流速的確定

10、，柱溫的確定，洗脫條件（等度、梯度）等的優(yōu)化；ELSD參數(shù)的選擇：漂移管溫度的確定，氮氣流量的確定，增益的確定；（4） 空白和干擾試驗；（5） 標準溶液的穩(wěn)定性試驗；（6）標準曲線（確定曲線工作范圍），檢出限、定量限的確定；（7）重復性（包括日間重復性和日內重復性）試驗；（8）回收率檢測：分低、中、高三個濃度水平檢測回收率；（9）不同方法檢測結果比對實驗：與離子色譜法，高效液相（示差折光）法的比較；（10）對比實驗（不同地域實驗室數(shù)據(jù)對比）；（11）實際樣品檢測。3.3 分析方法3.3.1 樣品制備稱取1 g試樣，精確至0.0001 g，置于100 mL磨口錐形瓶中，加入30 mL 0.02m

11、ol/L氫氧化鈉溶液，振蕩浸提40 min。過濾，取2mL濾液過022mm水系濾膜，進行HPLC分析。3.3.2 標準溶液3.3.2.1 標準儲備液稱取果糖、葡萄糖0.6 g、蔗糖0.2 g、麥芽糖0.09 g，用水溶解定容于100毫升容量瓶中。配制成果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量分別為6000 µg/mL、6000 µg/mL、2000 µg/mL和900 µg/mL的混合標準儲備液。本儲備液應在0 - 4條件下貯存，并應在一個月內使用。3.3.2.2 標準工作溶液等倍稀釋混合標準儲備液，配制成以下濃度系列標準工作液（見表1）。表1 標準工作溶液濃度系

12、列果糖（µg/mL）葡萄糖（µg/mL）蔗糖（µg/mL）麥芽糖（µg/mL）188188632837537512557750750250113150015005002253000300010004506000600020009003.3.3 液相色譜-蒸發(fā)光檢測器分析條件 色譜柱：Prevail Carbohydrate ES (250 mm×46 mm id，5 mm)，預柱(4.6*7.5mm)，GRACE公司；流速：0.8 mL /min；柱溫：20；進樣量：10mL；等度洗脫：水：乙腈 = 28%:72%；氮氣流量：2.2L/min；

13、漂移管溫度：50；增益：1；3.3.4 樣品含量的測定與計算（1）標準工作曲線繪制對各糖峰面積的對數(shù)與其相應的標準溶液濃度的對數(shù)進行線性回歸，得到線性回歸方程。 （2）樣品的測定濾液（3.3.1）按照儀器測試條件（3.3.3）測定樣品，每個樣品平行測定兩次。樣品中麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的含量按式（1）計算： （1）式中：X 樣品中麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的含量，單位為百分比(%)；c 樣品溶液中麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖的測定濃度，單位為微克每毫升(mg/mL)；V 萃取液的體積，單位為毫升(mL)；m 樣品的質量，單位為克(g)；樣品水分的質量分數(shù)，單位為百分比（%）。結果以兩次平行測

14、定值的算術平均值表示，精確至0.01%。兩次平行測定結果的相對平均偏差不應大于5.0%。3.3.5 混合標準工作溶液和樣品溶液典型色譜圖按照3.3.1、3.3.2進行樣品處理和標準溶液的配置后，以3.3.3分析條件進行LC-ELSD分析，得混合標準工作溶液和樣品溶液典型色譜圖（見圖1、圖2）。圖1 混合標準工作溶液典型色譜圖圖2 樣品溶液典型色譜圖4. 結果與討論4.1 樣品量的選擇為考察取樣量對檢測結果的影響, 稱取四個不同的樣品量進行重復性實驗。分別稱取0.5g、0.8g、1.0g、1.2g，按照3.3.1所述方法處理樣品后上機分析，每個樣品量重復5次，測定結果見表2。表2 樣品量選擇稱樣

15、量(g)果 糖RSD%(n=5)葡萄糖RSD%(n=5)蔗 糖RSD%(n=5)麥芽糖RSD%(n=5)0.51.381.943.939.140.80.731.373.196.191.00.590.592.572.581.20.811.221.862.48由表2可知：隨著樣品量的加大，檢測結果變異系數(shù)逐步變小，但在1.0 g以后，變異系數(shù)變化不明顯。因此，本實驗選定1.0 g 作為稱取樣品量。4.2 萃取條件優(yōu)化為保證萃取的充分性和有效性，降低樣品對檢測結果的影響，有必要對萃取條件進行優(yōu)化。本試驗考察了萃取溶劑、萃取體積、萃取方式和萃取時間的影響。4.2.1 萃取溶劑的選擇國內外各資料中提取煙

16、草中水溶性糖的試劑主要有水12 和0.01 mol/L NaOH8水溶液，二者對四種糖的提取效率相當。由于煙草中含有多種酸，煙草樣品的水提取液也呈偏酸性，其中的檸檬酸、酒石酸等酸性物質可催化蔗糖分解，不利于樣品提取液的長時間放置，對于蔗糖含量較高的樣品，蔗糖的分解更為明顯。根據(jù)德國標準DIN 10371-2001方法（1.000g樣品，50mL 0.01 mol/L NaOH萃?。?，結合本實驗稱樣量（1.000g）、萃取液體積（用30 mL萃取液萃取樣品時，各糖可萃取完全）以及煙草中酸性物質的實際情況，選擇水、0.017 mol/L NaOH、0.02 mol/L NaOH和0.03 mol/

17、L NaOH作為萃取液。比較使用這四類萃取液萃取后，樣品在22小時內的穩(wěn)定性（見表3、4、5、6和圖3、4）。表3 樣品用水萃取22小時內檢測結果時間果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麥芽糖(%)0 7.86 5.60 2.87 0.24 2 7.86 5.75 2.77 0.26 4 7.81 5.79 2.68 0.25 6 7.88 5.84 2.62 0.23 8 7.83 5.89 2.64 0.25 10 8.13 6.12 2.56 0.22 12 7.97 5.95 2.46 0.22 14 7.96 5.92 2.38 0.21 16 7.95 5.99 2.31 0.20 1

18、8 8.04 6.01 2.24 0.20 20 8.03 6.04 2.14 0.20 22 8.07 6.05 2.03 0.19 平均值7.96 5.91 2.47 0.21 變異系數(shù)1.30 2.52 10.53 11.70 表4 樣品用0.017mol/L NaOH萃取22小時內檢測結果時間果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麥芽糖(%)0 7.80 5.65 2.84 0.24 2 7.74 5.65 2.79 0.27 4 7.74 5.71 2.69 0.22 6 7.72 5.70 2.63 0.23 8 7.78 5.81 2.62 0.22 10 7.85 5.86 2.60

19、 0.21 12 7.84 5.76 2.46 0.22 14 7.87 5.89 2.42 0.22 16 7.91 5.94 2.36 0.20 18 7.92 5.93 2.28 0.24 20 7.92 5.81 2.22 0.26 22 7.93 5.68 2.17 0.21 平均值7.83 5.78 2.51 0.20 變異系數(shù)0.98 1.84 8.91 10.62 表5 樣品用0.02mol/L NaOH萃取22小時內檢測結果時間果糖(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麥芽糖(%)0 7.79 5.66 2.94 0.25 2 7.70 5.66 2.83 0.26 4 7.70 5.

20、67 2.81 0.26 6 7.70 5.72 2.77 0.24 8 7.66 5.75 2.80 0.24 10 7.83 5.83 2.72 0.21 12 7.77 5.79 2.65 0.22 14 7.83 5.82 2.60 0.23 16 7.83 5.79 2.57 0.22 18 7.83 5.73 2.47 0.22 20 7.78 5.71 2.41 0.23 22 7.81 5.62 2.27 0.24 平均值7.77 5.73 2.66 0.22 變異系數(shù)0.79 1.23 7.43 7.31 表6 樣品用0.03mol/L NaOH萃取22小時內檢測結果時間果糖

21、(%)葡萄糖(%)蔗糖(%)麥芽糖(%)0 7.78 5.67 2.87 0.26 2 7.65 5.62 2.88 0.25 4 7.66 5.64 2.86 0.26 6 7.68 5.71 2.91 0.22 8 7.72 5.80 2.89 0.20 10 7.70 5.77 2.82 0.19 12 7.72 5.70 2.80 0.24 14 7.72 5.73 2.79 0.25 16 7.76 5.68 2.76 0.22 18 7.70 5.69 2.72 0.23 20 7.57 5.70 2.51 0.22 22 7.56 5.68 2.47 0.24 平均值7.60 5

22、.63 2.78 0.23 變異系數(shù)0.88 0.92 5.24 9.82 圖3 不同萃取液中三種糖隨放置時間的變化圖4 不同萃取液中麥芽糖隨放置時間的變化穩(wěn)定性實驗分析： 22小時內，由于糖類物質的水解，果糖、葡萄糖在四種萃取液中均呈上升趨勢；麥芽糖在四種萃取液中的變化幅度在10%之間，較穩(wěn)定；蔗糖在22小時內均呈下降趨勢。分別對10小時內和22小時以內的檢測結果進行分析：10小時時：蔗糖在水、0.017 mol/L NaOH、0.02 mol/L NaOH和0.03mol/L NaOH萃取液中的檢測值分別為初始值的： 90.0%、91.6%、96.3%和98.3%。22小時時：蔗糖在水、0

23、.017 mol/L NaOH、0.02 mol/L NaOH和0.03mol/L NaOH萃取中的檢測值分別為初始值的：71.8%、76.5%、77.3%和86.1%。用0.02 mol/L NaOH和0.03mol/L NaOH萃取樣品時，果糖、葡萄糖和蔗糖在10小時內的變化值小于5%，麥芽糖變化值在10%以內，可認為用這兩種萃取液的穩(wěn)定時間為10小時。為確保對蔗糖的準確定量，考慮到萃取樣品后的pH應在7左右，選擇0.02 mol/L NaOH為樣品的萃取溶液，制備的樣品需在10小時內檢測。該時間與德國標準DIN 10371-2001一致。4.2.2 萃取方式的選擇在確定了萃取液后，為選擇

24、合適的前處理方式，本實驗比較了超聲（60Hz）和機械振蕩（180 r/min）兩種萃取方式。分別稱取1g試樣六份，前三份用超聲萃取，后三份用機械振蕩萃取，兩者的分析結果見表7：表7 超聲和振蕩萃取方式的結果比較萃取方式果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麥芽糖（)振蕩7.83 5.60 3.03 0.17 超聲8.19 5.87 3.13 0.17 果糖、葡萄糖和蔗糖的超聲比振蕩檢測結果高，分別較振蕩高4.6%、4.8%和3.3%，對于麥芽糖兩種萃取方式無差別，故超聲和振蕩對四糖的萃取效果無顯著差別?；诔曒腿∵^程中，溶液混濁，過濾速率慢，噪音較大，最終選擇機械振蕩方式萃取樣品。4.2.3萃取體積的選

25、擇在確定了萃取液和萃取方式的基礎上，為了使樣品中四種糖較好的萃取和檢出，根據(jù)稱樣量，進行了萃取液體積選擇實驗：稱取樣品12份，稱樣量1g（精確至0.0001g）,分別加入20mL、30mL、40mL、50 mL 、60 mL 、80 mL的萃取液，檢測結果比較如下： 圖5 不同萃取體積萃取效率的比較由圖5可知，萃取液中的四糖含量隨萃取液體積的增大而增加，在30mL后趨于穩(wěn)定，即30 mL時萃取基本完全，且此時四糖含量最大，利于檢測。故選擇萃取液體積為30mL。4.2.4 萃取時間的選擇在前期條件確定的基礎上，分別稱取1g試樣10份，對樣品進行10 min、20 min、 30 min、40 m

26、in、50 min的振蕩萃取后，對比檢測結果（見圖6）：由圖6可知， 40 min后樣品含量趨于穩(wěn)定，說明40 min時樣品萃取完全，故選擇萃取樣品的時間為40 min。圖6 不同振蕩時間的比較圖4.3 空白和干擾試驗不加入樣品和標準品，按樣品前處理方法進行空白試驗。由圖7可見，空白色譜圖基線穩(wěn)定，在葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖出峰處無干擾峰。故本實驗無需進行空白扣除。圖7 空白樣色譜圖為排除煙草及煙草制品中其它性質相近物質的干擾，在本方法下對鼠李糖、半乳糖、甘露糖、丙二醇、甘油、木糖醇和山梨醇進行了分析，如圖8所示：在果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的出峰位置上，不存在以上各物質的干擾。圖8 七糖標

27、（蘭色）、木糖醇（紫紅色）、丙二醇（未出峰）、甘油（紅色）、山梨醇（綠色）檢測圖譜4.4 標準溶液穩(wěn)定性試驗按3.3.2.1配制的標準儲備液，該儲備液于4冰箱中避光保存，并在0、15、20、30天時測定標準儲備液中四糖的含量，試驗結果見表8。由表8可知，30天內該標準儲備液的相對標準偏差在1%以內，即該標準儲備液在30天內穩(wěn)定性較好。表8 標準儲備液穩(wěn)定性放置時間（天）果糖（mg/mL)葡萄糖（mg/mL)蔗糖（mg/mL)麥芽糖（mg/mL)05.985.982.010.90156.025.992.000.89206.016.041.990.89305.976.021.980.89相對標準偏

28、差（%）0.400.460.650.564.5 前處理實驗條件小結- 稱取樣品量為1.0g；- 萃取溶劑為0.02 mol/L NaOH水溶液；- 萃取方式為機械振蕩；- 萃取液體積30 mL；- 振蕩時間為40分鐘，轉速180 r/min。4.6 高效液相色譜蒸發(fā)光檢測器分析方法4.6.1 LC分析條件4.6.1.1 色譜柱的選擇 目前用于檢測煙草中糖的液相色譜柱有兩類：反相色譜柱和離子交換柱。反相柱主要有：Waters公司的高效碳水化合物色譜柱，X-bridge Amide氨基柱； Suplecosil LC-NH2；GRACE公司的Prevail Carbohydrate ES糖分析柱。

29、離子交換柱有各種不同類型的陽離子交換柱：PL-Hi-plex Pb， PL-Hi-plex Ca等。Waters公司X-bridge 色譜柱和Suplecosil LC-NH2糖分析柱均屬于硅膠基質的氨基柱。硅膠基質填料適用于廣泛的極性和非極性溶劑，常規(guī)分析pH范圍為2-8。這兩根柱子在蒸發(fā)光檢測器使用時均存在：基線噪音大，對梯度洗脫不敏感，致使麥芽糖與雜質峰的分離較差等缺點。鑒于以上原因，一般的氨基柱在檢測麥芽糖上有一定的局限性。 PL-Hi-plex Pb和PL-Hi-plex Ca均為陽離子交換柱，該柱子填料為苯乙烯-二乙烯苯（SDVB），是利用混和物中各種糖分在樹脂柱上的吸附力不同而達

30、到彼此分離的目的。其優(yōu)點是耐水相，可以很好地分析果糖、葡萄糖和蔗糖。缺點是蔗糖和麥芽糖出峰位置重合，二者不能同時檢測，所以該柱也不宜選用。Prevail Carbohydrate ES糖分析柱：該柱為聚合物基質的氨基柱。采用雜化鍵合技術，在整個pH范圍內穩(wěn)定。其較強的疏水性和整個pH范圍內的穩(wěn)定性，以及高碳載量（15%，一般氨基柱為3.5%-8%），避免了普通硅膠基質的氨基柱在水相流動相中的柱流失嚴重和不能耐受高pH值，以及易和葡萄糖、果糖、麥芽糖等還原性糖形成Schiff堿的缺點。該柱在水相流動相中，不會發(fā)生降解，與所有檢測器聯(lián)用（包括ELSD）基線都平穩(wěn)，是較理想的糖類物質分析柱。最終選擇

31、Prevail糖柱為本實驗色譜分析柱。4.6.1.2 流動相的選擇據(jù)資料9 10 11，測定糖的流動相多為乙腈和水，當二者為流動相體系時，流動相中水的比例增加，有利于糖的溶解，分析時間變短，但水的比例過大（大于30%）時，不利于流動相在漂移管內的汽化，噪聲增大，靈敏度降低，導致組分峰保留時間接近，木糖和果糖，甘露糖和葡萄糖不能實現(xiàn)基線分離，影響到果糖和葡萄糖的準確定量；乙腈在流動相中的比例增大時，可有效改善色譜峰形，有利于各組分的基線分離，但不利于糖的溶解，分析時間也顯著增長。綜合考慮以上因素，在比較不同等度比例和梯度洗脫比例的基礎上，選擇四種糖最佳洗脫條件，最終確定等度洗脫： V水：V乙腈=

32、28：72 。4.6.1.3 流速的選擇確定了流動相比例之后，選擇在0.6 mL /min、0.8 mL /min和1.0 mL /min的流動相流速下分析樣品。由于流動相中水含量較高，流速為1.0 mL /min時，柱壓過高（應小于2200psi）；流速為0.6 mL /min時，出峰較慢，峰型較寬，分析時間較長；流速為0.8 mL /min時，可以在20分鐘內完成對四種糖的分析，峰型尖銳，分離度良好，故選擇流速為0.8 mL /min。4.6.1.4 柱溫的選擇在前期條件確定的基礎上，考慮到低溫時糖溶解度降低，高溫下還原糖易水解的特性，在柱溫范圍（4-50）內設定六個溫度，考察標準品中目標

33、物分離測定情況。柱溫分別為： 15、20、25、30、35、40, 結果見表9。果糖、蔗糖和麥芽糖的響應值隨著柱溫的升高而增加，柱溫超過35后,二糖的水解加速,蔗糖與麥芽糖的峰面積明顯減小。葡萄糖的響應值隨著柱溫的升高而降低。綜合考慮響應值的高低，以及35后基線不穩(wěn)定等因素，確定柱溫為20。表9 不同柱溫度時四糖峰面積檢測結果溫 度（）果 糖葡萄糖蔗 糖麥芽糖15 1798.91382.1751.7152.220 1862.21398.2775.1158.025 1959.71390.8810.5159.130 2148.71342.3927.7169.035 2368.61342.11095

34、.0178.340 2627.91128.11026.8 139.14.6.2 ELSD參數(shù)的確定4.6.2.1 漂移管溫度的選擇漂移管溫度取決于流動相的組成和流速，以及樣品的揮發(fā)性。漂移管溫度影響檢測器的響應，溫度升高，流動相揮發(fā)趨于完全，信噪比上升。高有機含量流動相比高含水量流動相蒸發(fā)所需要的漂移管溫度低。最佳溫度需要通過觀察各溫度時的信號噪音比率來確定。根據(jù)流動相的種類和比例，首先設氮氣流速2.2 L/min，保持氣流速不變，設置漂移管溫度分別為48、50、52和55，觀察樣品測定情況，比較見表10，溫度為50時，流動相基本揮發(fā)，各糖峰面積最大，故選擇漂移管溫度為50。表10 不同漂移管

35、溫度下四糖峰面積的比較溫度（。C）果糖葡萄糖蔗糖麥芽糖4821386.714826.93988.341.65025682.817774.26560.180.25221401.614796.24100.547.35520333.814061.53773.745.14.6.2.2 氮氣流量的選擇霧化載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測器的響應。氣體流量越低形成的液滴越大，液滴越大則散射的光越多，從而提高了分析靈敏度，但是液滴越大在漂移管中越難蒸發(fā)，基線噪音也隨之變大。在固定漂移管溫度為50后，比較不同氮氣流速時四糖的信號強度及基線噪音情況，圖9依次為氮氣流速2.0 L/min、2.2 L/

36、min、2.5 L/min時的檢測情況。當流速為2.0 L/min 時，基線噪音明顯；當流速為2.2 L/min和2.5 L/min時基線較為平穩(wěn)，噪音較小，各峰峰型良好，麥芽糖峰面積分別為45.7和29.8，流速為2.2 L/min較2.5 L/min時，麥芽糖峰面積高出53%。故選擇氮氣流速為2.2 L/min。圖9 不同漂移管溫度下基線噪音的比較圖4.6.2.3 增益的選擇在確定了漂移管溫度和載氣流速之后，適當增加增益可以提高低含量物質的響應值。分別設置增益為1、2、4檢測樣品（見圖10）。雖然增益2時，可以增大麥芽糖的響應值，但由于葡萄糖、果糖含量較高，增益2時，葡萄糖、果糖峰出現(xiàn)分裂

37、峰，峰型變寬，故最終選擇增益為1。圖10 不同增益值時果糖峰頂圖4.7 方法評價4.7.1 標準曲線線性、檢出限和定量限將最低濃度的標準溶液平行測定10次后，采用外標法定量，計算其標準偏差，分別以3倍和10倍標準偏差對應的濃度值為測定方法的檢出限和定量限（見表11）。結果表明，方法的線性良好，相關系數(shù)均大于0.999，該方法靈敏度較好。表11 標準曲線的線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限名稱線性方程相關系數(shù)檢出限（mg/L）定量限（mg/L）果糖y = 1.6596x +8.04990.9997723葡萄糖y = 1.5966x +8.00530.9994516蔗糖y = 1.6548x+8.

38、08580.9995414麥芽糖y = 1.3905x +7.12320.99966194.7.2 重復性試驗按3.3.1 處理方法對高、中、低三個含量的試樣A、B、C在1日內進行6次平行測定和檢測五天的結果，得方法日內精密度（見表12、13、14）和日間精密度（見表15、16、17），以RSD%表示。果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的日內精密度小于2%，日間精密度小于3，說明該方法在日內和日間均具有良好的重復性。表12 試樣A日內精密度試驗結果測定次數(shù)果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麥芽糖（)18.045.942.910.3128.005.812.870.3237.975.822.900.3148.03

39、5.822.850.3158.025.842.830.3168.025.912.890.31平均值8.015.862.870.31標準偏差0.020.050.030.01變異系數(shù)0.310.941.041.63表13 試樣B日內精密度試驗結果測定次數(shù)果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麥芽糖（)14.972.670.490.3424.972.690.460.3330.000.000.480.3444.982.710.490.3455.102.740.490.0065.062.750.490.34平均值5.022.710.480.34標準偏差0.060.040.010.00變異系數(shù)0.120.130.29

40、0.12表14 試樣C日內精密度試驗結果測定次數(shù)果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麥芽糖（)12.461.330.000.0022.431.340.000.0032.381.320.000.0042.401.310.000.0052.471.370.000.0062.351.350.000.00平均值2.411.340.000.00標準偏差0.050.020.000.00變異系數(shù)1.981.810.000.00表15 試樣A日間精密度試驗結果測定次數(shù)果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麥芽糖（)18.155.862.760.2928.025.912.820.2838.085.922.800.2748.115.9

41、02.850.2957.995.802.900.29平均值8.075.882.830.28標準偏差0.070.050.050.01變異系數(shù)0.830.821.932.74表16 試樣B日間精密度試驗結果測定次數(shù)果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)麥芽糖（)15.022.840.490.3724.932.770.490.3734.982.780.500.3844.952.800.480.3754.942.790.500.37平均值4.962.800.490.37標準偏差0.040.020.010.01變異系數(shù)0.790.871.421.82表17 試樣C日間精密度試驗結果測定次數(shù)果糖（)葡萄糖（)蔗糖（)

42、麥芽糖（)11.450.980.000.0021.531.030.000.0031.480.980.000.0041.491.000.000.0051.541.040.000.00平均值1.501.010.000.00標準偏差0.040.030.000.00變異系數(shù)2.452.720.000.004.7.3 回收率試驗對高、中、低含量的試樣A、B、C，以其五次平行測定的平均值作為計算其果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖原始含量的依據(jù)。分別添加高、中、低三個濃度水平的標準物質，進行回收率試驗（見表18、19、20）。由表可見，在不同含量的試樣中，果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的回收率在 97107之間，結果

43、符合方法要求。表18 試樣A回收率試驗結果化合物添加水平原值（mg)加標量(mg)測定值(mg)回收率果糖低濃度80.1140.39120.55100%中濃度79.50158.2098%高濃度118.60203.82104%葡萄糖低濃度58.4430.0989.71104%中濃度57.92116.33100%高濃度86.96143.3498%蔗糖低濃度28.7218.9146.9797%中濃度35.6464.26100%高濃度53.9682.89100%麥芽糖低濃度3.131.787.32103%中濃度2.775.8397%高濃度3.967.32106%表19 試樣B回收率試驗結果化合物添加水

44、平原值（mg)加標量(mg)測定值(mg)回收率果糖低濃度48.0819.01 68.05 105%中濃度37.13 84.99 99%高濃度56.92 103.48 97%葡萄糖低濃度26.9813.57 40.92 103%中濃度26.35 54.02 103%高濃度40.53 68.34 102%蔗糖低濃度4.842.87 7.66 98%中濃度4.62 9.51 101%高濃度7.33 12.39 103%麥芽糖低濃度3.372.18 5.71 107%中濃度4.52 8.14 106%高濃度6.63 10.15 102%表20 試樣C回收率試驗結果化合物添加水平原值（mg)加標量(m

45、g)測定值(mg)回收率果糖低濃度24.178.91 33.23 102%中濃度16.34 40.27 99%高濃度25.51 49.24 98%葡萄糖低濃度13.284.19 17.39 98%中濃度8.48 22.17 105%高濃度13.94 27.48 102%蔗糖低濃度0.000.00 0.00 0%中濃度4.85 5.02 104%高濃度0.00 0.00 0%麥芽糖低濃度0.000.00 0.00 0%中濃度2.84 2.91 102%高濃度0.00 0.00 0%4.7.4 與行業(yè)推薦標準方法的比對本方法和煙草行業(yè)推薦標準“YC/T 381-2010 煙草及煙草制品 葡萄糖、果

46、糖、蔗糖的測定 高效液相色譜法”和“YC/T 251-2008 煙草及煙草制品 葡萄糖、果糖、蔗糖的測定 離子色譜法”進行了檢測數(shù)據(jù)比對，結果見表21。兩種方法的測試數(shù)值的相對平均偏差均小于5%，一致性較好。表21 本方法、示差折光液相色譜法和離子色譜方法的測試數(shù)據(jù)比較（%，w/w）樣品1#2#3#4#5#6#7#8#果糖本法8.7810.673.490.6210.185.344.895.14示差折光8.6910.383.540.6410.095.284.955.08離子色譜8.6610.493.490.5910.245.214.985.12相對標準偏差（%）0.721.390.824.080

47、.741.230.930.60葡萄糖本法6.4810.792.150.418.753.042.072.60示差折光6.4210.482.200.428.703.002.102.58離子色譜6.410.522.160.398.812.962.092.54相對標準偏差（%）0.651.591.223.760.631.330.731.19蔗糖本法2.341.360.21/1.080.541.791.28示差折光2.301.320.20/1.060.521.751.29離子色譜2.291.330.19/1.050.531.741.24相對標準偏差（%）1.151.565.00/1.441.891.50

48、2.084.7.5 再現(xiàn)性試驗（不同地區(qū)實驗室間的比較）按照本項目建立的方法，項目組于2011年12月初至2012年1月底在7家不同實驗室（分別標注為實驗室、和）進行本方法的對比試驗。選取的對比實驗樣品為：單料煙（進口烤煙）a、單料煙（國產(chǎn)烤煙）b、單料煙（國產(chǎn)烤煙）c、國產(chǎn)香料煙d、烤煙型卷煙（國產(chǎn)）e、烤煙型卷煙（進口）f、混合型卷煙（進口）g和混合型卷煙（國產(chǎn)）h。對比試驗使用了2種品牌4個型號的高效液相色譜儀和蒸發(fā)光檢測器。在各實驗室使用的高效液相色譜（HPLC）和蒸發(fā)光檢測器（ELSD）型號見表22，比對試驗結果見表23。 由表可知，除g樣品麥芽糖測定值RSD超過10%外，其余樣中各糖含量測定值的RSD均小于10%，說明本方法再現(xiàn)性較好，能夠較為可靠地同時測定煙草及煙草制品中麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的含量。表22 實驗室、和使用的高效液相色譜和檢測器型號實驗室HPLC儀器廠商及型號ELSD儀器廠商及型號Agilent 1100Alltech 3000、Agilent 1200Alltech 2000 ESAgilent 1200Agilent 1200 series、Waters Acquity LCWaters Acquity ELSDWaters 2695 LCAlltech 2000表23 實驗室對比試驗結果(%)樣品糖實驗室實驗室實驗室實驗室實驗室實