醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文-123(共11頁)

1、 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)科科研項(xiàng)目申請書項(xiàng)目名稱：_申 請 者: 蔣淑麗 所在學(xué)校： 溫州醫(yī)學(xué)院仁濟(jì)學(xué)院 申請日期： 2011-6-15 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)科科研項(xiàng)目申請書簡 表研究項(xiàng)目項(xiàng)目名稱研究類別研究性質(zhì)基礎(chǔ)研究 應(yīng)用研究 實(shí)驗(yàn)發(fā)展起止年月 2011-6-15至2014-6-1申請金額 50000密 級機(jī)密 秘密 內(nèi)部 一般申請人姓名蔣淑麗性別女出生年月19897政治面貌預(yù)黨民族 漢職稱 學(xué)歷本科學(xué)位 學(xué)士部門部門電話家庭電話手-Mail993968559摘要隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤基因治療實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用都有了很大進(jìn)步，而對膀胱癌的研究有助于其他部位癌癥研究的發(fā)展。從其理

2、論基礎(chǔ)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行了分析，并就腫瘤基因治療的新途徑、取得的主要成就、存在的問題及展望進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞 色素上皮衍生因子 膀胱癌色素上皮衍生因子（PEDF）在膀胱癌中的表達(dá)及其對膀胱癌治療作用的研究 立論依據(jù) 一、趨勢判斷和需求分析國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢（含知識產(chǎn)權(quán)狀況和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)狀況）；經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會發(fā)展需求；科學(xué)技術(shù)價值、特色和創(chuàng)新點(diǎn)。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病，全世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率占全身腫瘤的第8位，在男性其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率9.9/10萬；在女性，其標(biāo)準(zhǔn)發(fā)病率為2.3/10萬，占第25位。死亡率在男性為4.2/10萬，占全身腫瘤死亡率的第9位，在女性為1.1/10萬，占第1

3、6位。在我國,膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的3.2%，1995年，北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率大約為7/10萬人，上海市城區(qū)發(fā)病率為8.6/10萬人1，且今后發(fā)病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機(jī)制和治療方面的研究始終是臨床基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。 目前膀胱癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措施, 但這些治療方法效果都不滿意，主要是治療后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá)80%，其中大約16%-25%復(fù)發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有10%發(fā)展為浸潤性或轉(zhuǎn)移性癌，因此,尋找一種新的、更有效的生物治療方法，是當(dāng)前臨床迫切需要解決的問題

4、。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中，無論是化療還是免疫治療，主要機(jī)制是通過直接殺死腫瘤細(xì)胞、阻斷腫瘤細(xì)胞分裂或誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實(shí)體性腫瘤生長，腫瘤細(xì)胞的增殖固然重要，而新生血管的形成在腫瘤的生長和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下，人體內(nèi)的脈管系統(tǒng)在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡(luò)式的相互作用下處于平衡狀態(tài)；病理狀態(tài)下，尤其是發(fā)生惡性腫瘤時，這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當(dāng)腫瘤生長達(dá)到腫瘤組織超過2mm時就會有新生血管形成，如果沒有新生血管生成，腫瘤生長明顯受到抑制，甚至停止2，3?？寡苌莎煼ㄊ遣煌谀壳俺Ｒ?guī)療法的新的腫瘤治療策略，具有高效低毒和不易產(chǎn)生耐藥

5、性的特點(diǎn)4。有關(guān)血管生長因子和血管生長抑制因子在腫瘤中所起作用，以及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤研究的一個熱點(diǎn)。 近來研究發(fā)現(xiàn)，色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor, PEDF）是一種對腫瘤有抑制作用的細(xì)胞因子。這種細(xì)胞因子是Tombran-Tink等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，由人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，分子量為50 KD5，屬于serpin卵白蛋白/PAT-2亞群，其基因全長16 kb，位于染色體17p13.1-pter 6 。 多項(xiàng)研究表明，PEDF是一種天然的高效的新生血管抑制劑7，并通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化起到抑制腫瘤生長的作用。

6、Tombran-Tink等將PEDF基因定位于染色體17p13.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關(guān)系密切，提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關(guān)基因5。對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行編碼PEDF的腺病毒轉(zhuǎn)染，在血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）存在的情況下，PEDF明顯阻止了血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成和遷移。對患有CNV/AMD患者的體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，PEDF大量減少的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞有明顯遷移;而對照組含有正常水平PEDF,則抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移6。Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中是腫瘤細(xì)胞分化調(diào)控的主要的抗血管生成的抑制劑7 。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)

7、展中，PEDF作為VEGF的拮抗因子，起到了抑制作用。對裸小鼠的在體實(shí)驗(yàn)以及鼠的肺癌模型也同樣證明了PEDF對腫瘤的抑制作用。其機(jī)制乃因PEDF減少腫瘤微血管的密度，因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長，在腫瘤的治療前景上非常樂觀8。 我們最近對PEDF在膀胱癌中表達(dá)情況的初步研究發(fā)現(xiàn)，PEDF在膀胱癌組織中表達(dá)明顯低于正常膀胱組織，而且PEDF表達(dá)情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負(fù)相關(guān)，提示PEDF在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用，PEDF的正常表達(dá)可能抑制膀胱癌細(xì)胞的生長、增殖，PEDF有可能成為膀胱癌生物學(xué)治療的一種有效的新方法。目前國內(nèi)、外尚未見此項(xiàng)研

8、究的相關(guān)報道。因此我們設(shè)想，擴(kuò)大樣本量，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF的表達(dá)水平，進(jìn)一步研究PEDF在膀胱癌中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料分析PEDF表達(dá)與膀胱癌分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系；通過研究膀胱癌組織中PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，PEDF與血小板反應(yīng)素-1表達(dá)的相關(guān)性，探討膀癌組織中PEDF表達(dá)與腫瘤血管形成的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制；通過研究PEDF表達(dá)與金屬蛋白酶-9（MMP-9）的相關(guān)性，探討PEDF表達(dá)與膀胱癌浸潤的相關(guān)性；通過研究PEDF表達(dá)與已知的對腫瘤生長有明確調(diào)節(jié)作用的腫瘤壞死因子（TNF-）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（thro

9、mbomodulin）和白介素8（IL-8）等細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性，探討PEDF表達(dá)對膀癌細(xì)胞調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，從而探討PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機(jī)制；在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，進(jìn)一步探討PEDF表達(dá)對膀胱癌細(xì)胞生長的抑制作用以及對膀胱癌的治療效果,為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種有效的新方法。參考文獻(xiàn) 吳階平， 吳階平泌尿外科學(xué)，山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004.5：898-917二、研究內(nèi)容和技術(shù)關(guān)鍵研究的總體目標(biāo)：(1) 研究PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)

10、生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能的作用機(jī)制。(2) 研究PEDF對膀胱癌細(xì)胞的治療效果，為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法研究的創(chuàng)新點(diǎn)：本課題研究的內(nèi)容和思路不同于以往的其他研究，應(yīng)用分子生物學(xué)方法從研究PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系入手，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中可能的作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型，探討PEDF對膀胱癌的治療作用。目前，本項(xiàng)研究國內(nèi)、外尚未見報道。本研究的順利完成，將為膀胱癌的生物學(xué)行為的研究開辟了新的途徑，也將為膀胱癌的生物學(xué)治療探索一種新的有效方法

11、。研究的主要內(nèi)容：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究： 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF表達(dá)狀況，并檢測VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-、IL-1、血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin）和IL-8的表達(dá)狀況；采用免疫組化技術(shù)檢測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度（microvascular density，MVD），分析PEDF與VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-、IL-1、血栓調(diào)節(jié)蛋白和IL-8表達(dá)的相關(guān)性，PEDF與MVD的相關(guān)性；并結(jié)合臨床資料分析研究PEDF表達(dá)與膀胱癌患者5年生存率之間的關(guān)

12、系；闡明PEDF表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制。 以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株,以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株作為對照，觀察檢測VEGF、TNF-的表達(dá)情況及膀胱癌細(xì)胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療： 以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白（購自吉泰生物科技有限公司）直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內(nèi)作為治療組，以未注射PEDF組為陰性對照組。觀察各組的MVD、VEGF 及腫瘤增殖情況，探討PEDF表達(dá)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，評估PEDF對膀胱癌的治療效果，為

13、進(jìn)一步過度到臨床應(yīng)用提供依據(jù)。需要解決的技術(shù)關(guān)鍵：(1) 連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染成功率。(2) PEDF定量檢測：我們已有對前列腺癌、腎癌、膀胱癌等組織標(biāo)本的PEDF定量分析的基礎(chǔ)，已形成較成熟技術(shù)條件、設(shè)備和研究經(jīng)驗(yàn)。(3) 膀胱癌裸鼠模型的構(gòu)建。我們已有成功構(gòu)建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗(yàn)。研究方法：方法（1）膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究：實(shí)驗(yàn)組對照組標(biāo)本膀胱癌組織非癌膀胱組織A期B期C期D期癌旁膀胱組織正常膀胱組織炎性膀胱組織例數(shù)30303030120120120 應(yīng)用SYBR Green I 實(shí)時定量聚合酶鏈

14、反應(yīng)（real-time PCR）技術(shù),對膀胱癌、非癌膀胱組織中PEDF進(jìn)行定量測定。 Western blot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9。 ELISA法檢測TNF-、IL-1、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度。 免疫組化方法檢測標(biāo)本MVD。 整理臨床資料：膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否轉(zhuǎn)移、5年生存率。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件)：PEDF與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。PEDF與TSP-1表達(dá)的相關(guān)性PEDF與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性PEDF與TNF-、IL-1、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度的相關(guān)性。PEDF與組織MVD相關(guān)性。PEDF與膀胱癌分期的相關(guān)性。PED

15、F與膀胱癌惡性程度（分級）的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關(guān)性。方法（2）PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療：以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞,以空載轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞作為對照，檢測VEGF、TNF-濃度，觀察細(xì)胞的增殖、凋亡情況，分析相關(guān)性。 以RT- PCR法擴(kuò)增PEDF基因。 將擴(kuò)增后的PEDF基因連接入腺病毒載體，轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞。并以空載轉(zhuǎn) 染為對照。 Western blot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9表達(dá)。 觀察膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡情況。 統(tǒng)計(jì)分析。方法（3）PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下，

16、建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內(nèi)作為治療組，以未注射PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織MVD、VEGF表達(dá)情況、腫瘤增殖情況，評價 PEDF對膀胱癌的治療效果。 以人膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠皮下構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型。 將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內(nèi)。 應(yīng)用免疫組化方法檢測MVD；應(yīng)用Western blot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9；觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與VEGF的相互作用關(guān)系及其對腫瘤生長的作用機(jī)制。技術(shù)路線：(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究：膀胱癌標(biāo)本120例癌旁膀胱組織標(biāo)本120例RT-P

17、CR檢測PEDF mRNA 表達(dá)Western blot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9ELISA法檢測TNF-、IL-1、血栓調(diào)節(jié)蛋白、IL-8濃度免疫組化方法檢測標(biāo)本微血管密度（MVD）結(jié)合臨床資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析正常膀胱組織標(biāo)本120例炎性膀胱組織標(biāo)本120例(2) PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療：將PEDF轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株，檢測VEGF、TSP-1、MMP-9、TNF-濃度，觀察腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡情況。RT PCR法擴(kuò)增PEDF基因連接入腺病毒載體轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株空載體觀察細(xì)胞凋亡、增殖情況ELISA法檢測TNF-Western blot法檢測VEGF、TSP-1、MMP-9表達(dá)結(jié)

18、果分析(3) PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療：觀察PEDF與VEGF、MVD相關(guān)性及其對膀胱癌細(xì)胞的抑制作用構(gòu)建膀胱癌裸鼠模型注射PEDF蛋白觀察微血管密度（MVD）VEGF、TSP-1、MMP-9定量測定腫瘤凋亡、增殖、侵襲情況未注射（對照）結(jié)果分析 先后開展了膀胱癌、前列腺癌等的一系列基礎(chǔ)研究（包括分子生物學(xué)研究）和臨床研究，如：裸鼠膀胱癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、P53和Ras基因等表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系、VEGF表達(dá)與膀胱癌的關(guān)系等，熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究的技術(shù)方法，如RT-PCR、southern 、northern雜交、DNA測序、擁有獨(dú)立的泌尿外科免

19、疫、病理、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備完善，技術(shù)方法先進(jìn)，擁有PCR-擴(kuò)增儀、酶標(biāo)儀、各種電泳槽、凝膠成像設(shè)備、細(xì)胞房及各種基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)設(shè)備等,為本課題的順利進(jìn)行提供了有力的技術(shù)和儀器設(shè)備保證。細(xì)胞培養(yǎng)、腺病毒載體構(gòu)建等技術(shù)，積累了較豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。 最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織中PDEF表達(dá)的初步研究，掌握了對腫瘤組織包括膀胱癌組織中PDEF表達(dá)的檢測方法，對本課題的順利進(jìn)行提供了便利條件。例如：已完成對膀胱腫瘤與正常膀胱組織PEDF表達(dá)情況的對照性研究，初步結(jié)果顯示如下:(1) 定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見：PEDF在正常膀胱組織中高表達(dá), 而在膀胱癌組織中表達(dá)明顯降低

20、（見圖1）。 (2) 圖1：正常膀胱組織與膀胱癌組織PEDF定量PCR注：N1，N2，N3：正常膀胱組織T1，T2，T3：膀胱癌組織GAPDH：內(nèi)參照M：為標(biāo)記分子量(3) 在膀胱癌組織中PEDF低表達(dá)與微血管增殖相關(guān)（見圖2）。 進(jìn)度安排 ；2011-6-至2012-3完成膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的檢測及相關(guān)性研究2012-3至2 013-3PEDF對膀胱癌細(xì)胞株的治療2013-3至2014-6PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療預(yù)期成果：（1）明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達(dá)情況以及其與相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系。（2）PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。（3）PEDF對膀胱癌的治療有效，為最終過渡到臨床應(yīng)用提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。成果以論文的形式表達(dá)，并申請“PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術(shù)”的專利；擬發(fā)表論著57篇，其中國內(nèi)權(quán)威雜志45篇，SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒定。本課題實(shí)施過程中，形成一整套的細(xì)胞因子檢測方法、膀胱癌細(xì)胞株培養(yǎng)及腺病毒