用非侵害性新技術(shù)識(shí)別調(diào)控小麥根吸收硝酸鹽與信號(hào)分子與研究

1、華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文摘要氮是植物必需的一種大量元素，而硝酸鹽作為植物根系吸收無(wú)機(jī)氮的主要來(lái)源之一，其吸收的信號(hào)調(diào)控則是植物氮素營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，提高其氮的利用率對(duì)于增加糧食產(chǎn)量、減少化肥浪費(fèi)和保護(hù)環(huán)境均具有重要意義。為識(shí)別調(diào)控小麥根系吸收硝酸鹽的信號(hào)分子（包括正向前饋和負(fù)反饋信號(hào)分子），本研究采取了一種非侵害性的新技術(shù)用于測(cè)定硝酸鹽凈吸收量的變化。該技術(shù)是以正常生長(zhǎng)的完整植株為實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)使測(cè)量具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)性，為正確識(shí)別信號(hào)分子提供了可能。為識(shí)別調(diào)控硝酸鹽吸收的正向前饋信號(hào)分子，本文研究了光照和碳水化合物對(duì)硝酸鹽凈吸收量影響的實(shí)時(shí)變化。

2、對(duì)于很多物種而言，地上部接受光照可以增加根系對(duì)硝酸鹽的吸收，其機(jī)理可能是通過(guò)一種從韌皮部運(yùn)輸?shù)礁康男盘?hào)分子起作用的，這個(gè)信號(hào)分子最可能是一種糖。為識(shí)別該信號(hào)分子，我們比較了各種碳水化合物對(duì)小麥根系硝酸鹽凈吸收量影響的差異性，預(yù)期作為信號(hào)分子的糖，對(duì)硝酸鹽凈吸收量的影響應(yīng)該比其他糖更迅速、更大。在分別添加 10 種碳水化合物（9 種糖以及甘露醇）后，發(fā)現(xiàn)只有蔗糖可以迅速引起硝酸鹽凈吸收量的增加，且比其他糖的作用更大，滿足識(shí)別根部信號(hào)分子的標(biāo)準(zhǔn)。葡萄糖、果糖和棉子糖在經(jīng)過(guò)一段或長(zhǎng)或短的時(shí)滯后，可以引起較小的反應(yīng)，l-和 d-阿拉伯糖、半乳糖、乳糖和甘露醇幾乎沒(méi)有影響，而甘露糖由于獨(dú)特的生化特性，

3、引起了硝酸鹽凈吸收量的減小。為進(jìn)一步弄清楚光照和蔗糖對(duì)硝酸鹽吸收量的影響是否是通過(guò)同一機(jī)制作用的，本文又研究了光照和蔗糖的疊加作用。結(jié)果表明，在光照條件下添加外源蔗糖，硝酸鹽凈吸收量增加的比例比在黑暗條件下要小，暗示了光照與添加外源蔗糖對(duì)硝酸鹽吸收的影響具有疊加相應(yīng)，表明兩者是通過(guò)同一個(gè)信號(hào)分子發(fā)生作用的，這個(gè)信號(hào)子最可能是根部細(xì)胞質(zhì)中的蔗糖。從結(jié)果可知，蔗糖具有調(diào)控根吸收硝酸鹽的信號(hào)分子的特征，而光照和添加外源蔗糖之間的相互作用為這一猜測(cè)提供了證據(jù)，表明給植株光照是通過(guò)韌皮部運(yùn)輸?shù)礁康恼崽莵?lái)影響硝酸鹽的吸收。本研究首次直接證明了蔗糖作為一種從光合作用到硝酸鹽吸收的正向前饋信號(hào)分子起作用。事

4、實(shí)上，這i華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文種前饋信號(hào)分子還需要和其他類(lèi)型的信號(hào)分子（主要是負(fù)反饋信號(hào)分子）相互作用從而克服環(huán)境的干擾。為識(shí)別調(diào)控硝酸鹽吸收的負(fù)反饋信號(hào)分子，我們篩選并研究了 13 種氨基酸對(duì)小麥硝酸鹽凈吸收量影響的實(shí)時(shí)變化。結(jié)果表明，添加谷氨酸后，硝酸鹽的吸收經(jīng)過(guò)10 min 的時(shí)滯后就迅速減小甚至變?yōu)樨?fù)值；添加天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、絲氨酸和賴(lài)氨酸后，硝酸鹽吸收經(jīng)過(guò) 0.5-1.5 h 的時(shí)滯后才開(kāi)始減少；其他氨基酸的影響很小或甚至沒(méi)有影響。由此可以推測(cè)谷氨酸最可能作為負(fù)反饋信號(hào)分子起作用，原因在于添加谷氨酸后，硝酸鹽吸收量的變化速度最快且變化量較

5、大。谷氨酸作為一種負(fù)反饋調(diào)控，與蔗糖相比對(duì)硝酸鹽吸收的影響較小，在植物體內(nèi)協(xié)助蔗糖這種正向前饋信號(hào)分子從而共同調(diào)控小麥根系對(duì)硝酸鹽的吸收。關(guān)鍵詞：普通小麥; 硝酸鹽吸收; 信號(hào)分子; 正向前饋; 負(fù)反饋; 非侵害性新技術(shù); 蔗糖; 谷氨酸ii華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文abstractnitrogen is needed in large quantity by plants and nitrate, as one major form of n,was absorbed by plant roots. therefore, nitrate uptake and its co

6、ntrolling signals haveattracted more and more attention so far. wheat (triticum aestivum) is one of the mostimportant food crops in the world, improving its efficiency of nitrate uptake is importantto increase yield, decrease the waste of fertilizer and protect the environment. identifyingsignals, i

7、ncluding feed-forward and feedback signals controlling nitrate uptake by wheatroots, have been investigated. a new non-invasive technique has been used, by whichintact plants grow at the normal rate during the experiments.to identify feed-forward signal(s) controlling nitrate uptake, the effects of

8、light andcarbohydrates on time course of net nitrate influx have been studied. illuminating theshoot stimulated nitrate uptake by the roots in many species, including wheat, as we reporthere. the mechanism is thought to be via a signal transported in the phloem, probably as akind of sugar. sugars su

9、pplied directly to the root system also stimulate nitrate uptake,which is generally viewed as an expression of the same signalling process. our aim is todetermine whether sucrose is a specific signalling molecule, and whether the light effectoccurs via sucrose. to identify a signalling molecule we h

10、ave compared the response ofnet nitrate influx to the supply of several sugars to the root system. a signal sugar shouldcause a rapid, large stimulus of net nitrate influx; other sugars acting indirectly shouldhave a smaller effect after a lag. a method of measuring net nitrate influx with a timeres

11、olution of minutes has enabled us to make this comparison. amongst nine differentsugars and mannitol, sucrose alone caused an immediate, large stimulation of net nitrateinflux. glucose, fructose and raffinose caused smaller responses with a lag. other sugarsand mannitol had no effect (except mannose

12、 which has an effect related to itsbiochemistry). when the plant was in the light, the stimulation by external sucrose wasless than in the dark, indicating that light affects nitrate uptake co-operatively withexternally supplied sucrose. sucrose showed the features of a specific molecule signallingi

13、ii華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文to nitrate uptake by the root system. this has long been supposed but not previouslysupported experimentally. the interaction between light and externally supplied sucroseshowed that the mechanism of the light effect on nitrate uptake involved sucrose. sucroseacts as a posit

14、ive feed forward signal, which must interact with other types of signal toovercome environmental perturbations.to seek the feedback signal(s) controlling nitrate uptake, the effects of thirteen aminoacids on time course of net nitrate influx have been studied. the results showed thatglutamate caused

15、 rapid a rapid and large decrease of net nitrate influx. aspartic acid,asparagine, glutamine, arginine, serine and lysine caused a relatively slow decrease of netnitrate influx with a lag of 0.5-1.5 h. other amino acids had a very small effect or even noeffect. it is speculated that glutamate is mos

16、t possible to be a negative feedback signalbecause the change of net nitrate influx is bigger and faster. glutamate as a feedbacksignal, which has a smaller effect than sucrose, collaborates with sucrose (as afeed-forward signal) and controls nitrate uptake by wheat roots.key words: triticum aestivu

17、m l.; nitrate uptake; signal molecule; positive feed-forward;negative feedback; new non-invasive technique; sucrose; amino acidsiv獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到，本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本

18、學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本論文屬于保密 ，在_年解密后適用本授權(quán)書(shū)。不保密。（請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“”）學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日1緒論1.1問(wèn)題的提出與研究意義植物生長(zhǎng)主要取決于從空氣中吸收的碳和從土壤中吸收的氮（碳氮比率大約是30 : 1），因此植物的同化機(jī)制是由光合作用和 n 的攝取量共同決定的。如果光合作用受到影響（

19、如，光強(qiáng)或者 co2 濃度的改變），那么氮吸收的速率則會(huì)發(fā)生改變以維持氮供應(yīng)，從而滿足植物生長(zhǎng)的需要。另一方面，如果氮的吸收速率發(fā)生改變，那么經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后最終會(huì)恢復(fù)到以前的量或者光合作用的速率會(huì)發(fā)生改變，以便使二者吻合。n 是影響糧食作物生產(chǎn)的主要制約因素，因此在生長(zhǎng)過(guò)程中需要施用 n 肥。但是，n 不能被有效吸收，由此造成了嚴(yán)重的浪費(fèi)并且會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不利影響。為使作物更有效地獲取 n 并將其合成蛋白質(zhì)，有必要理解 n 的吸收和同化過(guò)程，尤其是如何調(diào)控硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。raun 和 johnson 指出，全球谷類(lèi)作物的 n 利用率大約為 33%，意味著每年氮肥損失 159 億美元1。tilm

20、an2也提出氮肥損失導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，如溫室效應(yīng)和飲用水的污染。小麥?zhǔn)亲钪匾墓阮?lèi)作物之一，全球大約 20%的氮肥用于提高小麥產(chǎn)量3，故提高小麥生產(chǎn)中的氮利用率對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展就顯得非常重要。n 是植物必需的最重要的大量元素之一。而硝酸鹽作為植物生長(zhǎng)的一種信號(hào)，是有氧條件下土壤中最主要的無(wú)機(jī)氮形式，也是可供小麥吸收的主要氮源。對(duì)小麥如何吸收硝酸鹽及其同化作用的分子機(jī)制的理解，是提高氮利用率和減少氮損失的關(guān)鍵一環(huán)，因而對(duì)硝酸鹽代謝的研究引起了廣泛的關(guān)注。在植物體內(nèi)，硝酸根首先通過(guò)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)跨膜運(yùn)輸，然后細(xì)胞質(zhì)中一定比例的硝酸根離子被硝酸鹽還原酶還原為亞硝酸根，進(jìn)而參與體內(nèi)代謝合成各

21、種各樣的氨基酸，如谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸。現(xiàn)有研究表明，硝酸鹽的吸收是通過(guò)質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行的，這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)的特征已經(jīng)得到了較為清楚的詮釋?zhuān)蚁跛猁}轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因也已經(jīng)得以分離4-5。然而，對(duì)于硝酸鹽這個(gè)植物體內(nèi)最重要的無(wú)機(jī)物的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控，目前還難以給出令人滿意的答案。因此，研究硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制不僅具有重要的生理學(xué)意義，而且對(duì)于調(diào)節(jié)作物生態(tài)、提高氮肥利用和指導(dǎo)合理施肥等方面都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。1華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文1.21.2.1硝酸鹽吸收的背景知識(shí)硝酸鹽吸收的部位加快植物的 n 吸收速率對(duì)于提高氮肥利用率有著重要的意義，但對(duì)于如何高效吸收

22、 n 的生理學(xué)機(jī)制還有待研究。一般認(rèn)為，根系形態(tài)和硝酸鹽吸收速率（硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活性）是決定作物吸收 n 能力的兩個(gè)重要因素。另外，scheible 等6指出根的生長(zhǎng)率也與根部糖的含量相關(guān)，認(rèn)為糖分布的變化可能是導(dǎo)致根莖生長(zhǎng)發(fā)生變化的決定性因素。這說(shuō)明根部的碳水化合物濃度決定根部的生長(zhǎng)，必定會(huì)影響硝酸鹽的吸收速率。根部是植物吸收礦質(zhì)元素的主要器官，吸收部位以根毛區(qū)為主（圖 1.1）7。吸收速率受一些外界因素的影響，如溫度、土壤 ph 值、通氣狀況、水分狀況以及溶液濃度。圖 1.1 根毛區(qū)橫切面示意圖fig. 1.1 diagrammatic across section of the root

23、 hair zone2華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文1.2.2硝酸鹽吸收的方式與硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)植物細(xì)胞吸收礦質(zhì)元素的方式有兩種：第一，通過(guò)擴(kuò)散作用和協(xié)助擴(kuò)散（離子通道、載體）進(jìn)行被動(dòng)吸收；第二，通過(guò) atp 酶或共轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行主動(dòng)吸收。從熱力學(xué)上看，硝酸根離子在植物體內(nèi)不容易被吸收，而必須依賴(lài)于其代謝機(jī)制。硝酸鹽通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸，即載體介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，進(jìn)入細(xì)胞7。kabala 等8發(fā)現(xiàn)液泡膜上存在硝酸鹽/質(zhì)子的反向協(xié)同運(yùn)輸體系，并且認(rèn)為這個(gè)反轉(zhuǎn)運(yùn)體中的亮氨酸殘基對(duì)于硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入液泡膜起著關(guān)鍵的作用。zinovieva 等9指出，一種大小為 126 kda 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與硝酸鹽通過(guò)質(zhì)

24、膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。植物離子吸收的快慢主要取決于根部離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的活性和地上部的光合作用速率的協(xié)調(diào)，但是這種協(xié)調(diào)機(jī)制在分子水平上卻鮮為人知。在高等植物中，存在兩種動(dòng)力學(xué)不同的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，即高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（high-affinity transportsystem，hats）和低親和性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（low-affinity transport system，lats）4, 10。按照對(duì)硝酸鹽誘導(dǎo)反應(yīng)的不同，hats 可進(jìn)一步分為誘導(dǎo)型（inducible hats，ihats）和組成型（constitutive hats，chats)。chats 的 km 較低（通常為 6-20 µm），而i

25、hats 的 km 則較高（通常為 20-100 µm）。hats 更可能是當(dāng)土壤中的硝酸鹽濃度很低時(shí)（<250 µm），對(duì)硝酸鹽的吸收起作用11。通常認(rèn)為，lats 的轉(zhuǎn)運(yùn)能力比hats 大，在植物中是組成型表達(dá)的，在 0.5 mm 以上顯示出線性動(dòng)力學(xué)的特征11-12。在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi) lats 被認(rèn)為只有組成型的成分，然而最新的研究表明，lats也存在組成型和誘導(dǎo)型，類(lèi)似于擬南芥中的 ihats 和 chats13-14。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因分為兩大家族，即低親和性的 nrt1 和高親和性的 nrt2。目前，在真菌、藻類(lèi)和植物中已經(jīng)分離鑒定了硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因，從小麥中也

26、分離出了一些轉(zhuǎn)運(yùn)基因，如 tanrt2.3 就是從小麥?zhǔn)芟跛猁}誘導(dǎo)后的根系中分離出來(lái)的一個(gè)高親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體15。lejay 等16發(fā)現(xiàn)擬南芥中編碼根部硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因表達(dá)受到晝夜調(diào)節(jié)和糖供應(yīng)的刺激。蔗糖、葡萄糖和果糖能夠誘導(dǎo)離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)。光和蔗糖的誘導(dǎo)密切相關(guān)，可以認(rèn)為是同一種調(diào)節(jié)機(jī)制（即，由光合產(chǎn)物刺激）。這種調(diào)控機(jī)制有著很重要的作用，這可以從擬南芥中 atnrt2 突變體的表型中體現(xiàn)出來(lái)。在該突變體中，糖誘導(dǎo)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因缺失使得根部高親和性的硝酸鹽攝入量受到光和糖的誘導(dǎo)后不會(huì)發(fā)生改變（但野生型的會(huì)提高）。值得注意的是，不管是在植物培養(yǎng)還是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用的營(yíng)養(yǎng)液中的硝酸

27、鹽3華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文濃度都足以完全誘導(dǎo)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如 goyal 和 huffaker17）。在植物培養(yǎng)過(guò)程中，用 1/4 long ashton 營(yíng)養(yǎng)液（含 1.5 mm 硝酸鹽）提供植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)；待小麥幼苗長(zhǎng)到 20-30 d 用于建立實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)后，在預(yù)處理（至少 14 h）及隨后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終使用 1/20 long ashton 營(yíng)養(yǎng)液（含 0.3 mm 硝酸鹽），因此可提供足夠高的硝酸鹽濃度。第二，鑒于誘導(dǎo)型和組成型的高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的 km值都在 20-50 µm4，因此實(shí)驗(yàn)中使用的硝酸鹽濃度足以使之飽和。另一方面，對(duì)于低

28、親和性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)而言（即使 km 大于 1 mm），在 0.3 mm 濃度的硝酸鹽溶液中僅轉(zhuǎn)運(yùn)很少的份額。如在大麥中，低親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的 km 為 3.7 mm，占最大轉(zhuǎn)運(yùn)量的 4%，僅為在實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的總硝酸鹽的百分之幾。因此，本研究主要關(guān)注能被充分誘導(dǎo)的、高親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的生理特征。1.2.3硝酸鹽吸收速率與植物相對(duì)生長(zhǎng)速率有關(guān)硝酸鹽的吸收速率取決于生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)氮的需求與植物氮含量的比值。其中，植物生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)氮的需求被定義為相對(duì)生長(zhǎng)速率（relative growth rate，rgr），而凈硝酸鹽吸收量會(huì)隨著 rgr 的增長(zhǎng)而增加 18。硝酸鹽凈攝入量的最大值（maximu

29、m net influx of no3，imax）為 100 µm 左右甚至更低，但 imax 并不是恒定的，而是依賴(lài)于給定的變量，包括植物的年齡和 n 水平以及硝酸鹽的可利用率。只要 n 的需求和新的生長(zhǎng)之間是線性的（且根莖比保持不變），那么伴隨著植物年齡的增長(zhǎng)，imax 就會(huì)減小，這與 rgr 密切相關(guān)。rgr 更可能反映了凈 n 需求的硝酸鹽吸收，具有一定的生理學(xué)意義。有證據(jù)表明，根系對(duì)硝酸鹽的吸收是通過(guò)植物體內(nèi)韌皮部和木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)陌被徂D(zhuǎn)運(yùn)庫(kù)循環(huán)與地上部的需求相連。農(nóng)作物的 n需求取決于其干物質(zhì)的增加，通常情況下兩者呈線性關(guān)系。當(dāng)然，如果在農(nóng)作物發(fā)育過(guò)程中干物質(zhì)中 n 的臨界

30、值發(fā)生變化，或者 n 從較老的葉片再轉(zhuǎn)運(yùn)到分生組織時(shí)，兩者就不呈線性關(guān)系。光照和溫度影響植物生長(zhǎng)，因此也影響作物的 n 需求，這些關(guān)系都可以用數(shù)學(xué)模型來(lái)描述19。另外，chen 等20研究了硝酸鹽供應(yīng)如何影響三種葉類(lèi)蔬菜的生長(zhǎng)速率、硝酸鹽的濃度和硝酸鹽還原酶的活性，從而知道了供應(yīng)多少硝酸鹽最為合適。1.3硝酸鹽吸收調(diào)控的相關(guān)研究n 是植物需求量最大的礦質(zhì)元素，而硝酸鹽是主要的 n 源21，其吸收調(diào)控機(jī)制4華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文已經(jīng)引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其是在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 n 的利用率從而盡可能減少化肥浪費(fèi)和污染等方面。n 需求受到多種信號(hào)的調(diào)控，包括激素、硝酸鹽、糖

31、、有機(jī)酸和氨基酸。過(guò)去十年間，對(duì)于這些信號(hào)的本質(zhì)和整合作用的研究揭示了調(diào)控系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)22。首先，由于 n 吸收和光合作用速率相互匹配，故 n 吸收必定受到光合作用的調(diào)節(jié)，而光合作用又涉及到光照及在光照條件下合成的碳水化合物的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有研究表明，植物根部對(duì)硝酸鹽的吸收速度在黑暗條件下會(huì)下降而在光照條件下會(huì)上升，這符合硝酸鹽吸收速率變化必須與光合作用速率的改變相一致的觀點(diǎn)。給植物根系供給糖類(lèi)（蔗糖、葡萄糖和果糖，不包括糖衍生物）后，通過(guò)韌皮部運(yùn)輸?shù)礁康男潞铣傻墓夂袭a(chǎn)物作為一種信號(hào)分子起作用5, 16, 23，這被稱(chēng)之為正向前饋控制。其次，在 n 代謝的過(guò)程中會(huì)生成各種各樣的氨基酸，

32、這些氨基酸反過(guò)來(lái)又會(huì)對(duì)n 的吸收速率產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。也就是說(shuō)，如果光合作用和植物生長(zhǎng)加快，根部吸收的氮很快就會(huì)被消耗掉，隨后游離氨基酸和其他氮化合物的濃度就會(huì)下降，最后還原性氮化合物運(yùn)輸?shù)礁康乃俣纫矔?huì)減慢。而這種還原性氮化合物的減少可以作為一種信號(hào)，增加硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)速率5, 23-25，這被稱(chēng)之為負(fù)反饋控制。理解來(lái)自環(huán)境的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如何影響編碼硝酸鹽同化途徑的基因表達(dá)也是非常重要的26。溝通地上部的 n 需求和根部吸收 n 快慢的信號(hào)必須是在一個(gè)整合的調(diào)控系統(tǒng)中。除了韌皮部的可移動(dòng)性，這些信號(hào)分子必須有潛力在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平能夠阻止或促進(jìn)硝酸鹽的吸收。1.3.11

33、.3.1.1光照和碳水化合物的調(diào)節(jié)光照和黑暗的調(diào)節(jié)（不同于晝夜變化）研究結(jié)果表明在已被研究的所有物種中，地上部接受光照可以增加根部對(duì)硝酸鹽的吸收，但反應(yīng)程度因物種、環(huán)境條件和光照強(qiáng)度不同而異。例如，將大麥從黑暗移到光照條件下幾小時(shí)后，硝酸鹽的吸收量增加了 20-40%且趨于穩(wěn)定27-28；將煙草和大豆從光照轉(zhuǎn)到黑暗條件下，硝酸鹽吸收量減低了與之相似的程度。延長(zhǎng)在黑暗中的時(shí)間，硝酸鹽的吸收量會(huì)進(jìn)一步減低29-32。在西紅柿中，硝酸鹽吸收量發(fā)生初級(jí)反應(yīng)的時(shí)間較長(zhǎng)，即在光照中持續(xù)增加或黑暗中持續(xù)減低的時(shí)間長(zhǎng)達(dá) 6 h 甚至更長(zhǎng)31。雖然已知光照可以促進(jìn)硝酸鹽的吸收，但還沒(méi)有詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)分析，因5華

34、中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文此本文致力于研究光照條件改變后硝酸鹽凈吸收量的實(shí)時(shí)變化。真正的光暗影響（改變地上部接受的光照強(qiáng)度），不同于內(nèi)在的晝夜變化（生物鐘），雖然它也會(huì)對(duì) n 的吸收產(chǎn)生一定影響（如 ourry 等的研究33）。為了更清晰地理解兩者的不同，文中系統(tǒng)地總結(jié)了硝酸鹽吸收量變化受光暗影響和晝夜調(diào)節(jié)的研究概況（見(jiàn)表 1.1）。其中，對(duì)擬南芥（arabidopsis thaliana）、大豆（glycine max）、西紅柿（lycopersicon esculentum）的相關(guān)研究，有些結(jié)果反映了光照影響，有些結(jié)果反映了晝夜變化，這說(shuō)明植物既受光照的影響也受晝夜變化（即

35、生物鐘）的調(diào)節(jié)，因此在研究光照影響時(shí)就有必要排除晝夜變化這一影響因素。對(duì)羊茅（festucaovina）、草甸羊茅（festuca pratensis）、棉花（gossypium barbadense 和 gossypiumhirsutum）、鴨茅（dactylis glomerata）、發(fā)草（deschampsia flexuosa）、絨毛草（holcuslanatus）、胡桃（juglans nigra）、黑麥草（lolium perenne）、貓尾草（又名梯牧草，phleum pratense）、楊樹(shù)（populus tremula）、蓖麻（ricinus communis）、煙草（ni

36、cotianatabacum）等的研究清晰地表明了是晝夜變化而非光暗的影響。而對(duì)大麥（hordeumvulgare）、萵苣（ lactuca ativa）、小麥（ triticum aestivum）和高羊茅（ festucaarundinacea）等的相關(guān)研究表明了光照 /黑暗也存在相似的影響，如 peuke 和jeschke29的研究表明大麥的硝酸鹽吸收量變化受光照的影響。6華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文表 2.1 硝酸鹽的吸收受光照和生物鐘的調(diào)節(jié)table 2.1 nitrate uptake is affected by light/dark rather than d

37、iel responselight effectspeciesdistinct fromreferencenotediel responsearabidopsis thalianabrassica napuslolium perennelolium multiflorumtriticum aestivumyes. fig. 8nonocheng et al. 199234lejay et al. 200316lejay et al. 199935palenchar et al. 200436macduff and wild 198837dactylis glomeratadeschampsia

38、 flexuosafestuca ovinaholcus lanatusnoscheurwater et al. 199938festuca arundinaceayesgastal and saugier 198939light/co2/humidity,showed nitrate uptakewas independent oftranspirationandrelatedtonewphotosynthesisfestuca pratensisphleum pratensenonomacduff et al. 199740macduff and bakken 200341glycine

39、maxyesdelhon et al. 1996a42changeinlightintensityandco2availabilitynitrate influxchangednodelhon et al. 1996b437華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文nonodelhon et al. 1995a44delhon et al. 1995b45raper et al. 199146rideout and raper 199447vessey et al. 199048gossypium barbadensegossypium hirsutumnoaslam et al. 200

40、1b49helianthus annuushordeum vulgarehordeum vulgarezea maysyesgutschick 199350aslam et al. 197927peuke and jeschke 199829rao and rains 197651sehtiya and goyal 200052juglans nigralactuca ativalolium multiflorumtrifolium repenslolium perennenoyesnodelaire et al. 200553wheeler et al. 199854macduff and

41、jackson 199230ourry et al. 199633lycopersicon esculentumyescárdenas-navarroetal.199831nocárdenas-navarroetal.199955noono et al. 200056nicotiana tabacumoryza sativapennisetum americanumzea mayspopulus tremularicinus communisnononostöhr and mäck 200157raman et al. 199558pearson et

42、al. 198159siebrecht et al. 200360herdel et al. 200161sorghum sudanesehallmarkandhuffaker8華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文197862spinacia oleraceascaifeandschloemer199463triticum aestivumyesabdellaoui et al. 200164effluxaffectedbylight interacting withdefoliation or apexremoval.1.3.1.2no碳水化合物的調(diào)節(jié)sivasankar and

43、oaks 199665translocation of c-14to the roots地上部接受光照對(duì)刺激根部硝酸鹽吸收的影響被認(rèn)為是受到光合作用產(chǎn)物（例如被運(yùn)輸?shù)礁g皮部的蔗糖）的正調(diào)控作用。將外源蔗糖直接添加到根部周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)液時(shí)，可以刺激硝酸鹽的吸收（如 delhon 等42；geßler 等66；rufty 等32；stitt和 krapp67）和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)35。在根系中，糖類(lèi)為硝酸鹽的同化過(guò)程提供呼吸底物和 c 骨架等（必定會(huì)間接影響硝酸鹽的吸收）。然而，蔗糖和其他糖對(duì)根吸收硝酸鹽的影響非?？欤虼送ǔＵJ(rèn)為這是一種直接對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程起正調(diào)節(jié)的信號(hào)，而不是間接地對(duì)一組與

44、硝酸鹽吸收有關(guān)的過(guò)程起作用。雖然已經(jīng)知道蔗糖濃度在其他一些代謝過(guò)程中作為信號(hào)分子起作用，然而目前還沒(méi)有找到足夠的證據(jù)。最直接的證據(jù)可能就是同一個(gè)庫(kù)（細(xì)胞質(zhì)）中的蔗糖濃度作為一個(gè)信號(hào)分子，而且很可能是僅有一種糖可以攜帶這個(gè)信號(hào)（最可能是蔗糖），而本研究正是致力于驗(yàn)證這一假設(shè)。而且，蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖都會(huì)對(duì)硝酸鹽的吸收產(chǎn)生影響16, 67，由此提出另外一個(gè)問(wèn)題：調(diào)控硝酸鹽吸收的信號(hào)分子是否具有專(zhuān)一性，即是否同時(shí)存在幾種糖對(duì)硝酸鹽的吸收起到調(diào)控作用，而不僅僅是蔗糖。只有系統(tǒng)地比較了這幾種糖對(duì)硝酸鹽吸收量的影響的實(shí)時(shí)變化（目前還沒(méi)有這方面的報(bào)道），才有可能區(qū)別初始的直接反應(yīng)和次級(jí)的間接反應(yīng)（由

45、于不同的糖相互轉(zhuǎn)變引起的反應(yīng)），這就有必要使測(cè)定的精確度比以前的方法要高（即達(dá)到幾分鐘）。最后一個(gè)問(wèn)題，蔗糖和光照影響的作用機(jī)制是否相同，即是否來(lái)自莖部的和來(lái)9華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文自根部的蔗糖起作用是通過(guò)來(lái)自同一個(gè)庫(kù)中的信號(hào)分子（皮質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)）。雖然這看起來(lái)是極有可能的，但目前還沒(méi)有任何證據(jù)支持這一假設(shè)。本研究致力于研究光照和蔗糖的影響是否具有疊加效應(yīng)，從而弄清楚這兩種影響是否通過(guò)同一機(jī)制發(fā)生作用。1.3.1.3光照和碳水化合物對(duì)相關(guān)酶的調(diào)節(jié)如果硝酸鹽吸收的速率發(fā)生變化，硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，nr）的轉(zhuǎn)錄和酶活性也應(yīng)該會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，

46、這一變化受到光和糖等的調(diào)節(jié)68。在光照條件下，根中 nr 的轉(zhuǎn)錄水平幾乎沒(méi)有改變但其蛋白質(zhì)的活性會(huì)增加28，這表明光在調(diào)節(jié) nr 基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮了間接作用（通過(guò)光合產(chǎn)物）。此外，nr 的活性狀態(tài)對(duì)碳水化合物較為敏感69。糖對(duì) nr 基因的表達(dá)、nr 活性和降解有著多重影響。例如，高濃度的糖可以增加 nr 合成，能阻斷使之磷酸化以致失活的蛋白激酶，從而使 nr 保持活性狀態(tài)，以達(dá)到抑制降解的目的。在高等植物中，nr 受到翻譯后水平的調(diào)控，如由光照到黑暗的條件下，植物體內(nèi)的 nr 會(huì)迅速失活。光照到黑暗條件的轉(zhuǎn)變或者飼喂糖后，葉子或根系中 nr活性的變化速率快于 nr 蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的速率（幾分

47、鐘對(duì)幾小時(shí)）7,70周轉(zhuǎn)率受到多種因素的調(diào)控，其合成可能依賴(lài)于糖的可利用性，而降解和半衰期可能是由于受到 nr 磷酸化的影響71。glaab 和 kaise72發(fā)現(xiàn)花生植株置于黑暗中 4 h后，根中 nr 的活性呈現(xiàn)出緩慢減小的趨勢(shì)。當(dāng)花生植株一直處于黑暗環(huán)境下或在光照條件下將地上部切除，從根部提取出來(lái)的硝酸鹽還原酶的活性（nitrate reductase activity，nra）會(huì)慢慢下降，半衰期大約為 4 h。不同的是，從黑暗中生長(zhǎng)的花生葉子中提取的失活的 nr 半衰期僅為 10min，當(dāng)根尖小段從有氧到無(wú)氧的條件下（或反過(guò)來(lái)），nra 的變化與葉子中的一樣迅速73。外源蔗糖、乳糖、d

48、-葡萄糖、d-果糖、d-半乳糖、d-甘露糖和 l-阿拉伯糖對(duì)離體花生（pisum sativum l. cv. raman）根部的 nr、gs 和谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，gdh）水平及無(wú)氧條件下亞硝酸產(chǎn)量和呼吸過(guò)程中 o2的消耗會(huì)產(chǎn)生影響。結(jié)果表明，這些糖都可以增加 nr 的誘導(dǎo)。蔗糖、葡萄糖和果糖都可以增加 nr 和 gs 的水平，降低 gdh 的水平，但影響的程度各不相同（乳糖對(duì)這些酶的影響很?。?。根系中 nr 活性的變化速率比 nr 蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的速率快得多（幾分鐘對(duì)幾小時(shí)）7,7010。根中 nr 的。因此，蔗糖更可能是調(diào)節(jié) nr 的活性而不是合成，

49、原因華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文在于供給蔗糖后，硝酸鹽吸收量的變化非常迅速。在不含蔗糖的營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)的植物，其根部 gdh 水平的增加會(huì)被低濃度的半乳糖和甘露糖所抑制，但被高濃度的半乳糖和甘露糖所增強(qiáng)73。1.3.21.3.2.1硝酸鹽的同化與還原性氮化合物的調(diào)節(jié)硝酸鹽的同化根系吸收的硝酸鹽經(jīng)木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)降厣喜?，通過(guò)一種硝酸鹽質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)體（nitrate-proton symporter，nrt）進(jìn)入葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖 1.2）7。首先，硝酸鹽被 nr 還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入葉綠體中的類(lèi)囊體。然后，亞硝酸鹽在類(lèi)囊體中被亞硝酸鹽還原酶（nitrite red

50、uctase，nir）還原成胺鹽，胺鹽經(jīng)過(guò)谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，gs）和谷氨酸合酶（glutamate synthase，gogat）的順次反應(yīng)轉(zhuǎn)換成谷氨酸。谷氨酸再回到細(xì)胞質(zhì)中并通過(guò)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，asp-at）的作用轉(zhuǎn)換成天冬氨酸。最后，天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，as）將天冬氨酸轉(zhuǎn)換為天冬酰胺。mesophyll cellchloroplastgs/nrtnrnirgogatasp-atasno3no3no2no2nh4+glutamateglutamateaspar

51、tateasparagineproteins,nucleic acidother aminoacids圖 1.2 礦質(zhì)元素 n 在葉子中的同化過(guò)程fig. 1.2 summary of the processes involved in the assimilation of mineral nitrogen in the leaf1.3.2.2還原性氮化合物的調(diào)節(jié)硝酸鹽的同化途徑始于硝酸鹽吸收，隨后是硝酸鹽還原生成銨鹽，在絕大多數(shù)11華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文植物中銨鹽可被固定進(jìn)入谷氨酰胺和谷氨酸中。硝酸鹽在同化過(guò)程中會(huì)生成各種各樣的氨基酸，主要包括天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸和賴(lài)氨酸。這些氨基酸濃度的高低，即 n 水平的高低也會(huì)對(duì)硝酸鹽吸收產(chǎn)生一定的影響。硝酸鹽泵入量受根部細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中硝酸鹽和氨基酸水平的共同調(diào)控41。對(duì)于懸浮培養(yǎng)的玉米胚胎細(xì)胞系而言，在培養(yǎng)基中添加單一的氨基酸（2 mm 谷氨酰胺、甘氨