多花黃精皂甙的分離純化工藝

1、 多花黃精皂甙的分離純化工藝皂甙是天然植物中具有重要生物活性成分之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有一半以上天然植物中含有皂甙。國(guó)內(nèi)外對(duì)于皂甙的生物活性已有很多報(bào)道：如大豆皂甙、茶花皂甙可降血脂(Yoshikawa，2005)；輪葉黨參的皂甙組分可以提高機(jī)體的免疫力(Byeon，2009)；昆諾阿藜皂甙(Kuljanabhagavad，2009) 可作為疫苗添加劑。Wang等(2001)和Cai等(2002)從湖北黃精的根莖中分離到一種薯蕷皂苷(dioscin)和一種薯蕷皂苷元(methyl protodioscin)，體外實(shí)驗(yàn)表明具有抗癌作用，可見皂甙具有重要而廣泛的生物活性或功能。然而到目前為止關(guān)于黃精皂甙提

2、取的工藝還鮮見報(bào)道。而縱觀一些關(guān)于植物皂甙提取的方法報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)材料均購(gòu)自藥房，這樣的材料大多已經(jīng)處理或炮制，不能真正反映該植物體原有的特點(diǎn)或生物活性物質(zhì)的含量。為探討和揭示黃精中的主要活性成分、提取方法或工藝，本研究直接從九華山挖掘黃精，對(duì)其中的主要活性物質(zhì)黃精皂甙和多糖進(jìn)行了連續(xù)分離提純，摸索出一套經(jīng)過(guò)優(yōu)化的提取工藝，以期為開發(fā)我省黃精資源提供重要的理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 原料及設(shè)備1.1.1 原料黃精地下塊莖原材料于2008年8月采于安徽省九華山，經(jīng)本院周守標(biāo)教授鑒定為多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua.)。將采集來(lái)的新鮮黃精洗凈，蒸餾水淋

3、洗，曬干。使用前將黃精粉碎，過(guò)60目篩，備用。 圖1 多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua.)植株(左)以及其塊莖(右)Fig.1 The plant(left) and the tuber(right) of Polygonatum cyrtonema Hua.1.1.2 試劑人參皂甙RB1標(biāo)準(zhǔn)品(GINSENOSIDE-RB1 STANDARD)99%，型號(hào)/貨號(hào): 079-02191，購(gòu)于上海貝基生物科技有限公司，產(chǎn)地為日本(說(shuō)明：目前市場(chǎng)上尚沒有純化的黃精皂甙標(biāo)準(zhǔn)品出售，故以人參皂甙標(biāo)準(zhǔn)品替代)；XAD-4型大孔樹脂、XAD-1180型大孔樹脂購(gòu)于北京慧德易科技

4、有限公司；無(wú)水乙醇、乙醚、濃硫酸、正丁醇、香草醛、冰醋酸、甲醇、高氯酸等試劑均為分析純。1.1.3 儀器設(shè)備超聲波清洗器(KQ2100E，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (RE-52，上海青蒲 滬西儀器廠)；大容量離心機(jī)(800B，上海安亭科學(xué)儀器廠)；層析柱、HL-2恒流泵(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；BSZ-100自動(dòng)部分收集器(上海滬西分析儀器廠)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4，金壇市杰瑞爾電器有限公司)、電子天平(FA-N/JA-N型，上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司)、植物粉碎機(jī)(DYF-300型, 溫嶺市林大機(jī)械有限公司)、干燥箱(DGX-9143BC-1，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)

5、、721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀表有限公司)。1.2 皂甙提取1.2.1皂甙提取的一般流程黃 精 粉 末乙醇浸泡超聲波提取，濃縮乙醚脫脂，得粗皂甙1.2.2 皂甙的提取準(zhǔn)確稱取黃精粉末30g若干份，放入具塞圓底燒瓶，加入適量提取劑，按各種條件(料液比、時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù))進(jìn)行超聲提取(50, 頻率為28 kHz)，然后抽濾，濾渣再按上法重新提取。1.2.3 脫脂乙醇超聲提取得到的是含有脂肪的粗皂甙，采用乙醚萃取脫去粗皂甙的脂肪。將乙醚和粗皂甙提取液以一定的比例混合置于分液漏斗中，搖晃分液漏斗使乙醚與提取液混合均勻，然后放氣，靜置一段時(shí)間，待有明顯分層后棄去下層脂肪。重復(fù)幾次，直至乙醚與

6、提取液無(wú)分層現(xiàn)象。1.2.4 皂甙的純化1.2.4.1 水飽和正丁醇萃取純化配制水飽和正丁醇。蒸餾水21ml，飽和正丁醇100ml(胡春風(fēng)，2008)。用水飽和正丁醇純化粗皂甙溶液。共萃取三次，待有明顯分層時(shí)，棄去下層水相，收集并合并上層正丁醇部分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇，得到黃精皂甙的粗產(chǎn)品(徐麗萍，2007)。1.2.4.2 大孔樹脂純化(1) 大孔樹脂的處理 各大孔樹脂分別用70%的乙醇浸泡。將樹脂分別一次性投入柱中。用70%的乙醇從樹脂底部緩緩的加入，進(jìn)行反洗使小顆粒樹脂沖出。然后以2 BV/h 的流速正洗，洗至流出液加水不呈白色為止。用去離子水以2 BV/h 的流速洗凈乙醇，再用2BV

7、4%的HCl 溶液，以5 BV/h 的流速通過(guò)樹脂層，并浸3h，再用去離子水以同樣的流速洗至水洗液呈中性。最后用2.5 BV 5%的NaOH溶液，以5 BV/h 的流速通過(guò)樹脂層，浸泡3h，再用去離子水以同樣的流速洗至水洗液呈中性。(2) 層析：將黃精皂甙粗產(chǎn)品用乙醇稀釋至濃度為0.8 mg/ ml加至已經(jīng)準(zhǔn)備好的大孔樹脂柱(進(jìn)行吸附，先用蒸餾水進(jìn)行洗脫，洗脫至流出液不顯molish反應(yīng)(molish反應(yīng)為鑒定單糖的反應(yīng)，用蒸餾水進(jìn)行洗脫的目的是為了先除掉粗產(chǎn)品中可能存在的糖類)為止，再用體積濃度為75%的乙醇進(jìn)行洗脫，流速3.0ml/min，分步收集乙醇洗脫部分，8ml/管，每5管用香草醛-

8、冰醋酸法跟蹤檢測(cè)皂甙含量，直至洗脫液無(wú)皂甙視為洗脫完全(洗脫液與樹脂體積比約為4:1)，揮干乙醇，經(jīng)冷凍干燥得到黃精皂甙成品，黃精皂甙的粗產(chǎn)品與大孔樹脂的重量比約為1:8。1.2.4.3 水飽和正丁醇萃取純化后再過(guò)大孔樹脂將水飽和正丁醇萃取純化后的皂甙再過(guò)XAD4大孔樹脂進(jìn)一步按1.2.4.2法純化。1.3 皂甙含量測(cè)定首先制作已知皂甙含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(蔡金星，2009；黃桂東等，2006)。分別取0.1mg/ml的人參皂甙液0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ml置于具塞試管內(nèi)，揮干溶劑，在分別加體積分?jǐn)?shù)為5%香草醛冰醋酸液0.2ml和高氯酸0.8ml，混勻、密塞，置于60恒溫水浴鍋中顯

9、色15min，取出后立即以冰水冷卻5min，各加入冰醋酸5.0ml，搖勻，靜置10min,以試劑空白為參比，用UV-722型分光光度計(jì)于波長(zhǎng)544nm處測(cè)其吸光度。回歸方程為：y=0.646X-0.1106，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9994。待測(cè)皂甙樣品作 6個(gè)平行樣，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的皂甙含量。1.4 皂甙得率計(jì)算皂甙得率的計(jì)算公式：純化的皂甙重量/黃精干粉重×100%2 結(jié)果與分析2.1 單因素對(duì)黃精皂甙提取率的影響2.1.1 不同料液比對(duì)黃精皂甙提取率影響稱取黃精粉末10g若干份，用75乙醇分別配置成料液比為1:5，1:10，1:15，1:20

10、，超聲提取50min,，得到不同的料液比對(duì)皂甙提取率的影響，結(jié)果見圖2?？梢钥闯?，在一定范圍內(nèi)，皂甙提取率隨料液比增加而上升，但在料液比為1:15以后，提取率的增加趨于緩和，因此選擇1:10，1:15，1:20做正交實(shí)驗(yàn)。 圖2 不同料液對(duì)皂甙提取率影響Fig.2 The effect of different ratio of liquid to material on extraction efficiency of saponins2.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)黃精皂甙提取率的影響取粉碎后黃精粉末10g若干份，用75乙醇配成料液比1:15，提分別提取10min，30min，50min，70

11、min得到不同提取時(shí)間對(duì)黃精皂甙提取率的影響，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，皂甙的浸出量逐漸增多，但到70min后皂甙得率有下降的趨勢(shì)，有可能是超聲時(shí)間長(zhǎng)，超聲能產(chǎn)生溫度過(guò)高引起皂甙降解，因此選擇30min，50min，70 min做正交實(shí)驗(yàn)。圖3 不同提取時(shí)間對(duì)皂甙提取率的影響Fig.3 The effect of different extracting time on extraction efficiency of saponins2.1.3 不同乙醇濃度對(duì)黃精皂甙提取率影響取粉碎后黃精粉末10g若干份，配成料液比1:15，提取50min，乙醇濃度分別為55%、65%、7

12、5%、85%，得到不同乙醇濃度對(duì)黃精皂甙提取率的影響，結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，隨著乙醇濃度的提高，皂甙的浸出量逐漸增多，但到75%后增幅趨于緩和。因此選55%、65%、75%做正交實(shí)驗(yàn)。圖4 不同乙醇濃度對(duì)皂甙提取率的影響Fig. 4 The effect of different ethanol concentrations on extraction efficiency of saponins2.1.4 不同提取次數(shù)對(duì)黃精皂甙提取率影響取粉碎后黃精粉末10g若干份，用75%乙醇濃度配成料液比1:15，提取50min，殘?jiān)鶕?jù)相同的提取條件再進(jìn)行提取，共提取3次，結(jié)果見圖5。從圖中可以

13、看出，隨著提取次數(shù)的增加，皂甙的溶出量逐漸增多，但提取兩次后增幅趨于緩和。圖 5 不同提取次數(shù)對(duì)皂甙提取率的影響Fig. 5The effect of extracting times on extraction efficiency of saponins2.2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)方案據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選出乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)4個(gè)提取因素，每個(gè)因素3個(gè)水平(表1)的正交設(shè)計(jì)方案,按正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。表1 正交試驗(yàn)L9(34)的因素和水平表Table.1 The factors and levers of orthogonal design

14、L9(34)水平因 素A乙醇濃度(%)B提取次數(shù)C提取時(shí)間(min)D料液比1551301:102652501:153753701:202.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 2 正交試驗(yàn)的參數(shù)表Table.2 The result parameter of orthogonal design實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD得率(%)111113.49212224.56313334.51421236.17522314.32623125.34731324.42832236.74933115.71K112.5614.0814.5413.52K215.8315.6217.4714.32K316.8715.5613.2517.42

15、T14.194.694.854.51T25.285.215.824.77T35.625.194.425.81R1.430.521.41.04注：表中得率均為水飽和正丁醇純化后得到的皂甙數(shù)據(jù) 表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table.3 Variance analysis of orthogonal experiment 方差來(lái)源Variance resource偏差平方和SS自由度f(wàn) 均方 MS F值 P值A(chǔ)10.11725.0587.394*B1.52220.7610.730 C9.35224.6766.531 * D8.48724.2435.642*注：*表示顯著差異， F0.05(2,6)=

16、5.15上述9個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，第8號(hào)實(shí)驗(yàn)(A3B2C2D3)皂甙提取量最高。對(duì)比T值黃精皂甙提取的最佳工藝條件也是A3B2C2D3，即：乙醇濃度為75%，提取兩次，提取時(shí)間50min，料液比1:20提取量最高；由R值可得對(duì)提取率影響因素大小依次為乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比> 提取次數(shù)(即A > C > D > B)。因此提取皂甙最佳條件A3B2C2D3，從最佳提取條件可以看出超聲提取產(chǎn)生的超聲能可以很快的提高提取體系的溫度，縮短提取時(shí)間。2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在上述最優(yōu)條件下，稱取10g黃精粉末5份，進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果平均皂甙得率為6.64%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(R

17、SD)為0.19%。說(shuō)明其穩(wěn)定性較好，方法可靠。2.4 本法與傳統(tǒng)的索氏提取法比較分別采用傳統(tǒng)索氏提取法和超聲波提取法(本法) 進(jìn)行黃精皂甙的3次平行測(cè)定試驗(yàn),并將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較。結(jié)果表明,兩種方法之間具有顯著性差異。本法如上所述平均皂甙得率為6.64%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.19%；而索氏提取法3次平均得率為4.24%，RSD 0.22%，與本法比較具有顯著性差異，t-檢驗(yàn)p0.05,說(shuō)明采用本法比傳統(tǒng)提取方法得率高，而且穩(wěn)定性更好。綜合提取效率以及提取條件，如本法提取時(shí)間短、溫度低、能耗少等，所以采用本法提取具有較強(qiáng)的優(yōu)越性。2.5 純度測(cè)定結(jié)果圖6 不同純化方式皂甙純度F

18、ig.6 The saponins content of different clarification methods1. XAD1180型大孔樹脂 2. 水飽和正丁醇 3. XAD4型大孔樹脂4.水飽和正丁醇+XAD4型大孔樹脂由圖6看出，粗皂甙經(jīng)XAD1180型純化后，純度為35.14%，經(jīng)XAD4型大孔樹脂純化后，純度為80.54%，水飽和正丁醇純化后皂甙純度為67.34%，水飽和正丁醇純化后的皂甙再過(guò)XAD4大孔樹脂柱，純度達(dá)96.33%。稱取1g水飽和正丁醇純化后的皂甙(純度為67.34%)，溶解后再過(guò)XAD4大孔樹脂柱，實(shí)驗(yàn)平行5次，結(jié)果平均回收率達(dá)到93.91%(平均純度達(dá)96

19、.31%)。由此可見，皂甙經(jīng)水飽和正丁醇純化后再過(guò)XAD4大孔樹脂純化的方法是一種穩(wěn)定性好、回收率高、純度高的優(yōu)化方法，這為得到高純度皂甙并進(jìn)一步開發(fā)為藥品等奠定了良好的基礎(chǔ)。根據(jù)表2中最佳提取條件時(shí)的粗皂甙得率6.74%以及水飽和正丁醇純化后的皂甙純度(67.34%)結(jié)合XAD4大孔樹脂純化后的回收率(93.91%)可以計(jì)算出從九華山多花黃精中提取的總皂甙含量可達(dá)4.17%，這與所報(bào)道的其他植物中的皂甙提取得率相比是較高的。3 討論在提取皂甙時(shí)作者采用乙醇試劑，因?yàn)橐掖紝?duì)皂甙有較好的溶解能力，而其沸點(diǎn)低，無(wú)毒，能夠回收，使乙醇可循環(huán)使用，節(jié)約成本。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇溶劑做為提取劑和洗脫劑。在

20、本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)皂甙不溶于乙醚，而脂類溶于乙醚的特點(diǎn)，采用乙醚萃取法脫去粗皂甙中的脂類，而且乙醚可以通過(guò)蒸餾回收，也防止了資源的浪費(fèi)、節(jié)約成本。提高皂甙提取的得率和純度是本研究追求的目標(biāo)，在本研究中通過(guò)提取條件的正交實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析篩選出一套具有穩(wěn)定性較好的組合方式；在提取手段上采用超聲(本法)與傳統(tǒng)方法比較，得出本法得率更高，重復(fù)試驗(yàn)時(shí)穩(wěn)定性好、耗時(shí)短、耗能低的一套工藝。用于中草藥成分分離純化的大孔吸附樹脂類型有:D-101、DA-201型、MD-05271型、GDX-105型、CAD- 40型、SIP系列、D-型等(馬振山，1997)。目前關(guān)于用大孔樹脂純化粗皂甙的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)很多，如顧維(200

21、9)用D-101型大孔吸附樹脂純化薤白總皂甙取得了較好的效果，為該植物皂甙類成分的應(yīng)用提供一可行性方案；關(guān)海寧選擇AB-8、D101、NKA-2、NKA-9型大孔樹脂純化大豆皂甙，證實(shí)了AB-8型大孔樹脂純化效果較好(關(guān)海寧等，2010)；于杰用AB-8 , D-101 , D-100，D-141型大孔樹脂純化人參莖葉總皂甙發(fā)現(xiàn)D-101大孔樹脂純化效果較好(于杰，2009)。而對(duì)于XAD系列的大孔樹脂純化皂甙的報(bào)道極少，本研究采用了XAD系列大孔樹脂純化黃精皂甙，其中的XAD4純化效果明顯優(yōu)于XAD1180，特別是正丁醇純化與XAD4純化相結(jié)合效果尤為顯著。說(shuō)明利用這一方法純化皂甙的可行與優(yōu)

22、越性。而且大孔樹脂也可以回收，經(jīng)過(guò)處理循環(huán)利用，也是節(jié)約成本的一種好方法。作者在本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，從提取皂甙選擇有機(jī)溶劑(乙醇)，到純化皂甙所用的材料(乙醚，大孔樹脂)等都是可以回收循環(huán)利用的。這在工業(yè)大量的生產(chǎn)中具有很大的實(shí)際意義，可減少環(huán)境的污染以及節(jié)省相當(dāng)可觀的成本。參考文獻(xiàn)：Byeon S E, Choi W S, Hong E K, et al. Inhibitory Effect of Saponin Fraction from Codonopsis lanceolata on Immune Cell-Mediated Inflammatory ResponsesJ. Arch Ph

23、arm Res, 2009, 32(6): 813-822.Cai J, Liu J, Wag Z, et al. Apoptosis induced by dioscin in hela cellsJ. Biol Pharm Bull, 2002, 25(2):193-196.Kuljanabhagavad T, Wink M. Biological activities and chemistry of saponins from Chenopodium quinoa WilldJ. Phytochem Rev, 2009, 8:473490.Wang Z J, Zhou Y J, Zhang H. Effects of two saponins