高分辨率溶解曲線簡介

1、高分辨率溶解曲線簡介 (2011-09-01 11:30:50)轉載標簽： 雜談高分辨率熔解曲線分析技術（ High Resolution Melting ），簡稱 HRM ，是近年來興起的一種檢測基因突變、進行基因分型和SNP檢測的新工具，可以迅速的檢測出核酸片段中單堿基的突變。 HRM 技術因其速度快，操作簡便，高通量，靈敏性特異性高，對樣品無污染等優(yōu)點而被迅速的應用在生命科學、醫(yī)學、農學、畜牧業(yè)等領域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突變以及 SNP 的掃描； 2、已知突變及 SNP 的基因分型； 3、動植物、微生物等物種的物種鑒定以及品種鑒定

2、； 4 、法醫(yī)鑒定、親子鑒定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。一、HRM 技術的基本原理：    HRM 技術主要是基于核酸分子物理性質的不同。不同核酸分子的片段長短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何雙鏈 DNA 分子在加熱變性時都會有自己熔解曲線的形狀和位置。 HRM 技術的基本原理就是根據熔解曲線的不同來對樣品來進行區(qū)分。   以二倍體細胞為例，當純和子樣品通過 PCR 擴增，經過變性復性后，仍然是純合子，如圖一 A 。而雜合子 PCR 擴增完，經過變性復性后，樣品中會形成部分的含

3、有非沃森 - 克里克配對的雙鏈分子存在。 圖一： A ：純合子樣品 B ：雜合子樣品    如圖一 B 所示，雜合子樣品擴增后，經變性復性，會有非配對堿基的形成，而純合子樣品沒有。這樣，雜合子樣品相對純合子樣品來說，雙鏈不夠穩(wěn)定，表現在解鏈溫度上就會有微小的差別。如果采用高分辨率的儀器進行檢測，并用專門的軟件進行分析，微小的差別就會被檢測出來，從而成功的篩選出純合子與雜合子。下圖是雜合子樣品熔解曲線的的示意圖：  圖二：雜合子樣品的熔解曲線為四種不同雙鏈的熔解曲線的疊加的結果。    

4、以二倍體細胞為例，雜合子擴增后通過變性復性會形成二種同源雙鏈和兩種異源雙鏈的混合物，在熔解過程中四種鏈會形成一條獨特的溶解曲線，從而與純合子的熔解曲線區(qū)分出來。   下圖是采用 Lightscanner 儀器對純合子，雜合子，雙雜合樣品的分析結果    圖三 . 采用 Lightscanner 系統(tǒng)對標準樣品的分析。灰色的曲線代表的是純合子樣品，紅色的曲線代表的是雜合子樣品，藍色的曲線代表的是雙雜合樣品，通過 Lightscanner 系統(tǒng)的分析，三種樣品被明顯的分為了三類，表現出了極高的靈敏性和準確性。二、 HR

5、M 技術的必備條件：HRM 技術走向實踐應用主要基于兩種技術的改進 :1、雙鏈 DNA 嵌入型飽和熒光染料 LCGreen 的開發(fā)；    采用飽和的熒光染料是進行 HRM 分析的必備條件之一。 LCGreen 是飽和的熒光染料，與傳統(tǒng)的熒光染料 Sybr Green 相比有如下優(yōu)點： LCGreen 染料在 PCR 時可以以飽和的濃度加入，不會抑制 PCR 反應而Sybr Green 染料濃度過高會抑制 PCR 反應。在進行 HRM 分析時，由于飽和染料占據了 DNA 雙鏈上每一對堿基上的空位，所以在雙鏈解鏈時，染料立即與雙鏈脫離，使得熒光信

6、號發(fā)生較大的變化，而非飽和染料常發(fā)生位置上的遷移，從而對熒光信號沒有大的影響。圖四 A 所示，飽和染料可以占據 DNA 雙鏈的每個堿基對，非飽和染料只能與部分堿基對結合。當熔解發(fā)生的時候， DNA 雙鏈首先會有局部雙鏈發(fā)生解鏈。采用 LCGreen 染料時，染料立即從 DNA 雙鏈上發(fā)生脫離，造好較大的熒光值的改變，而 Sybr Green 則發(fā)生位置上的遷移，對熒光值的改變不大。圖四 B 則展示了采用飽和染料和不飽和染料對純合子和雜合子樣品分析時熔解曲線峰圖的差異圖，如圖 B 所示，采用 LCGreen 染料時，純合子與雜合子熔解曲線峰圖有較大的差別，采用 SYBR Green 時則基本沒有

7、差異。下圖顯示了飽和熒光染料 LCGreen 和非飽和熒光染料 Sybr Green 的區(qū)別 圖四 A ：非飽和染料 Sybr Green 在 DNA 雙鏈熔解時會發(fā)生位置的遷移，飽和染料 LCGreen 在 DNA 雙鏈熔解時則直接從雙鏈上脫落下來。 圖四 B ，使用飽和染料 LC Green 得到的 DNA 雙鏈熔解峰可以很明顯的將雜合子給區(qū)分出來。2、 擁有精確控溫裝置和高密度數據采集本領的儀器的產生以及專業(yè)化分析軟件的開發(fā)。    Idaho 公司根據 HRM 的方法專門設計出的儀器擁有精確控溫裝置和高密度數據采集本領。 Li

8、ghtscanner 儀器的升溫速度每秒 0.1 度，每攝氏度可以采集 100 個數據點，可以密集的繪制出 DNA 分子的熔解曲線。專業(yè)化分析軟件的開發(fā)使得收集到的數據可以準確而快速的被鑒定出來。三、 HRM 技術的流程圖    目前，研究突變以及 SNP 的研究方法主要有 DHPLC、SSCP、 DGCE 、 MS 、測序等， HRM 技術的優(yōu)點主要在于： 1、 快速、高通量 LightScanner 5 到 10 分鐘完成 96/384 孔板的 PCR 產物檢測， 20000 個 SNP/ 天；2、準確、靈敏度高、特異性好 接近

9、100% 準確性、特異性（ <400bp ），準確性 96.4% 和特異性 99.1% （ 4001kb ）； 3、重復性好 重復性接近 100% ； 4、費用低； 5、不會對樣品帶來污染 染料，探針在 PCR 前加入，不需要后續(xù)的分離純化，實現了真正的閉管操作；6. 操作簡便 LightScanner 只需將 PCR 產物（ 96/384 孔板）放入儀器內檢測即可； 6、 染料的加入不影響后續(xù)的測序工作。圖五為目前篩選突變的幾種常用的方法的簡單流程圖的比較： 圖五，進行突變掃描的幾種常用方法的流程圖比較 通過對目前常用的幾種篩查突變的方法的流程比較可以看出， HRM

10、 技術在 PCR 擴增后即可直接被用來對樣品進行分析，不需要樣品的分離純化。因而可以降低分離純化過程中所帶來的樣品污染的可能性，同時，也能大大減少工作量。高分辨率熔解曲線該詞條缺少摘要圖、基本信息欄、詞條分類，補充相關內容幫助詞條更加完善！立刻編輯>>高分辨率熔解曲線(high-resolutionmelting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術，具有極高的敏感性，可以檢測出單個堿基的差異，并且成本低、通量高、速度快、結果準確、不受檢測位點的局限，實現了真正的閉管操作。在突變掃描、單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面H

11、RM分析技術發(fā)揮著重要作用。目錄· 1HRM介紹· 2基本原理· 3技術特點· 4常用儀器· 5應用· SNP分析· 突變掃描· 甲基化研究· 基因分型· 序列匹配· 定量研究· 對凝膠電泳的替代· 6技術展望1HRM介紹高分辨率熔解曲線分析（high resolution melting analysis，HRM）是國際上發(fā)展的一種新型的檢測單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）及掃描突變的新技術。HRM 無需使用序

12、列特異性探針，而是利用一種飽和染料對 PCR 反應產物進行分析。2基本原理HRM 的基本原理：雙鏈核苷酸（double strand DNA，dsDNA）的熱穩(wěn)定性受其長度和堿基組成的影響，序列變化會導致升溫過程中 dsDNA 解鏈行為的改變。因為所用的熒光染料只能嵌入并結合到dsDNA 上，因此利用實時PCR 技術，通過實時檢測 dsDNA 熔解過程中熒光信號值的變化，就能以生成不同形狀熔解曲線的方式將 PCR 產物中存在的差異直觀地展示出來。同時，借助于專業(yè)性的分析軟件就可以對測試群體實現基于不同形狀熔解曲線的基因分型或歸類。3技術特點相對于其它基于 PCR

13、的 DNA 多態(tài)性檢測技術如單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、變性高效液相色譜（denaturing high-performance liquid chromatography，dHPLC）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，HRM 的優(yōu)勢在于操作簡單，分析時間短，靈敏度和特異性高，PCR 產物無需后處理（如酶切、電泳等），可實現真正的閉管操作從而降低污染風險。另外 HRM 具有高通量的特點，非常適合大量樣品的分析。因此HRM 檢測方法備受關

14、注，并已發(fā)展成為 SNP 基因分型、點突變篩查等的重要手段。4常用儀器常應用于HRM檢測的儀器主要有以下幾種：（1）HR-1是美國Idaho 公司生產的第一種專門應用于HRM 的檢測儀，主要用于基因預編篩查和SNP分析分型。（2）LightScanner，該儀器熒光采集迅速，溫度控制和數據獲取優(yōu)勢明顯，因此適用于疾病篩查及測序前的大規(guī)模突變篩查和基因分型。(3)LightScanner32是Lightcycler PCR儀的功能增強版， 其溫 度控制及熒光檢測的均一性好，可顯著降低實驗誤差。（4）Lightcycler 480是瑞士Roch e公司生產的具有HRM分析功能的板式全自動

15、熒光定量PCR儀，可以做多重PCR檢測分析 及多種探針研究模式分析。（5）Rotor-gene6000是全球第一款成功將qPCR擴增與HRM結合 在一起實現閉管操作的儀器。5應用SNP分析不同個體同一條染色體上同一位點的核苷酸序列絕大多數是一致的，當單個核苷酸堿基不同而導致核酸序列呈包括置換、缺失和插入等多態(tài)性時，稱單核苷酸多態(tài)性，即SNP。SNP現象在生物體內廣泛存在，它是生物遺傳變異的表現之一，因而SNP對研究人類遺傳和進化具有重要意義。突變掃描運用HRM技術可以進行樣本中已知突變位點的檢測、未知新突變位點的鑒定，已知多態(tài)位點(如SNPs、短串聯重復序列、微衛(wèi)星、條形碼序列等)的檢測等。H

16、RM技術已經在人類和動植物遺傳疾病的分子診斷、動植物各類多態(tài)位點的鑒定與檢測、動物生產繁殖數量性狀位點的鑒定與檢測等研究領域獲得了應用，并取得了很多新的研究進展。甲基化研究DNA 甲基化是發(fā)生在DNA堿基序列上的一種共價修飾。靶序列上甲基基團的存在可以影響轉錄因子的結合，引起轉錄抑制，從而使該基因的表達受到抑制。DNA甲基化是表型遺傳修飾的重要組成部分，在細胞正常功能維持、遺傳印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。HRM技術為DNA甲基化狀態(tài)的檢測另辟蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理，將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。這樣，原先未甲基化模板所產生的PCR產物比甲基化模板的Tm要低。HRM還

17、能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合，制作出標準曲線，將樣品的熔解曲線與之相比較，從而確定樣品中甲基化的比例?；蚍中虷RM技術使用了飽和熒光染料和改進的熔解及分析系統(tǒng)，可檢測核酸間的微小差異，其最先被應用于基因的分型試驗。運用該技術進行基因分型較傳統(tǒng)的分型方法（凝膠電泳，高效液相色譜等）具有顯著的優(yōu)越性，并取得了很多新的研究進展。人球蛋白的HbC，HbS和HbE 3個基因型在113bp區(qū)域中，運用以往的技術很難將它們區(qū)分開，Herrmann等應用HRM技術將球蛋白的3個基因型分別檢測出來。曹春鴿 利用HRM技術，快速靈敏地對64例隨機DNA樣本的和

18、兩個多態(tài)性位點進行了基因分型，且HRM方法的分型結果與測序驗證結果完全一致。序列匹配有些研究并不需要完全的基因型，而只需知道 DNA 序列是否匹配，例如：組織移植、基因型-表型的相關性和辯證性. 在活器官移植中，需要對 HLA 進行基因分型. 這個主要牽涉到HLA-A，B，C 和 DR 等幾個位點. 當兩個個體的熔解曲線完全相同時就說明 HLA 基因型完全匹配. 通過 11 混合樣品進行熔解曲線分析，如果樣品不是完全匹配的，那么就將形成不同雜合子而改變溶解曲線，由此可以通過這種方法來驗證試驗結果。定量研究HRM技術具有高度的靈敏性，能鑒別熔解曲線的微小變化，因此可以用做定量分析。檢測變異分子所占的比例，通常使用的方法為雙脫氧測序法和（分辨率下限為20%-30%）和焦磷酸測序法（分辨率下限為1%-10%），但這2種方法既費時又費力。Aten等（2008）和Bruder等（2008）成功地運用HRM技術進行了不同等位基因的 定 量 分 析，結果表明HRM技術可以達到12.5%的分辨率。對凝膠電泳的替代PCR反應和酶切反應結果的檢驗方法是傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳，但這種方法要結合一些有毒染料（如溴化已錠（EB）進行染色，對試驗人員的安全產生潛在的威脅。HRM技術替代瓊脂糖凝膠電泳是一種很好的選擇，通過熔解曲線可以清楚地