乙型肝毒顆粒超離純化

1、乙型肝炎病毒顆粒超離純化常用離心機1簡介 beckman hitachi sorvall hereus eppendorf低速離心: 6,000rpm以下高速離心: 25,000rpm以下超速離心: 30,000rpm以上1.離心力2.相對離心力(rcf)3.沉降速度4.沉降系數(shù)(s)5.沉降時間和沉清因子(k)離心場中的基本物理概念 離心力 f=ma=m2r : 角速度(弧度rad/秒 ) =(2rpm)/ 60 r: 離心半徑 相對離心力(rcf) 同一顆粒在離心時同地球的重力相比較后得到的值 rcf=離心力/重力=m2r/mg=2r/g =1.12r(rpm/1000)2 沉降速度v 在

2、離心力場的作用下,單位時間內(nèi)沉淀物運動的距離v= d2(p-m) 2r 18(f/f0)v大小與顆粒直徑(d2)成正比v與顆粒密度同介質(zhì)密度差(p-m) 成正比v與外加離心場(2r)成正比 當顆粒密度等于介質(zhì)密度時,沉降速度接近于零v與介質(zhì)粘滯度成反比,粘滯度增加速度減慢v與顆粒形狀有關(guān).顆粒偏離球形越大f/f0的摩擦比也越大,速度越慢 沉降系數(shù)(s) svedberg 定義:單位離心力作用下的沉降速度 物理意義: 被測顆粒達到極限速度時所需要 的時間.單位為秒.1s單位=10-13seconds 沉降系數(shù)與物質(zhì)的質(zhì)量、形狀、密度等因素有關(guān),也受溫度,水化密度,ph的影響,在實際工作中通過實驗

3、測定. 蛋白質(zhì)：1-100s 核酸：10-1000s 病毒：100-1000s 細胞核：106-107s 完整細胞：107-108s 原核核糖體70s(30s,50s) 沉清因子k和沉降時間tk 因子主要由轉(zhuǎn)子決定。離心時，影響所需的沉降時間。離心分離某一物質(zhì)所需的離心時間t=k/s 試管中，分離所需的時間與距離成正比。k因子小，分離所需的時間更短。k因子還受轉(zhuǎn)速影響，轉(zhuǎn)速高，時間短。各種離心方法 沉降速度法 差速離心法 速度區(qū)帶離心法 特點:主要按顆粒大小,形狀不同分離 沉降平衡法 密度梯度離心法（預制梯度，自成梯度） 特點:以顆粒的密度差分離,與大小、形狀無關(guān)差速離心法 原理：通過不斷增加

4、相對離心力的辦法，使一個非均勻混合液內(nèi)的不同大小、形狀的顆粒分步沉淀。 溶解的細胞（組織勻漿液） 600g 離心10min 沉淀（細胞核） 上清液（含細胞膜、線粒體 、溶酶體 核糖體、可溶性蛋白） 10000g離心10min 沉淀 上清液（細胞膜、線粒體、溶酶體） （核糖體、可溶性蛋白） 100000g離心3h 沉淀 上清液 （核糖體） （可溶性蛋白）速度區(qū)帶離心法 原理：在離心管預先裝入密度梯度材料（如蔗糖，cscl 等），樣品鋪在梯度液頂部。同梯度液一起離心，利用各顆粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的顆粒處于同一梯度層內(nèi)，達到分離目的。密度梯度離心法(預制梯度) 在離心之前在

5、管中預先形成線性或非線性梯度,將樣品加入離心管中,經(jīng)長時間平衡離心,使樣品顆粒按其密度不同在梯度液中分布,這時顆粒密度等于周圍介質(zhì)的密度p=m密度梯度離心法(離心自成) 利用某些重金屬鹽(如cscl 等)同樣品均勻混合,長時間離心.在離心場的作用下,重金屬鹽重新分布,最后形成由管底密度高到液面密度低的密度梯度.此時,樣品中原先均勻分布的病毒顆粒隨周圍介質(zhì)密度的變化而上浮下沉,最終進入與自身浮力密度相同的特定位置,只要轉(zhuǎn)速、溫度不變,則延長離心時間也不能改變這些顆粒的成帶位置. 各類超速離心機轉(zhuǎn)子最高轉(zhuǎn)速允許離心管內(nèi)平均密度為1.2g/cm3,超過該密度 ,減速 rpm實際= 1.2/實際密度r

6、pm maxl 轉(zhuǎn)子超過壽命也要減速使用轉(zhuǎn)速限制hbv顆粒分離 1 .差速離心分離:hbv 陽性血清用緩沖液對 倍稀釋,4000rpm離心30min后,棄細胞碎片等大沉淀塊.上清液再經(jīng)40000rpm離心3hr,使病毒顆粒沉淀,得到粗病毒液. 2.速度區(qū)帶分離:在離心管中加入70%(w/v)蔗糖2ml,上加20%(w/v)蔗糖4ml,將粗病毒液加在梯度液頂部,于30,000rpm離心4hr. 收集20%與70%(w/v)蔗糖中間混濁的中間層. 3.預制梯度等密度離心分離:制備1.0-1.27g/ml/蔗糖密度梯度液,sw41 轉(zhuǎn)頭100,000g離心24小時后,分部收集.選擇合并密度1.2-1.24g/ml管作電鏡觀察.預制梯度等密度離心分離: 石蠟油 樣品0.5ml 30% 蔗糖2ml 40% 蔗糖2ml 50% 蔗糖2ml 60% 蔗糖2ml 70% 蔗糖1ml 梯度液的密度測定1.微量取樣器法 精密加樣器, 萬分之一或