黃曲霉素檢測分析技術(shù)進展

1、黃曲霉毒素分析檢測方法進展浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院 食安1201蔡婉靜201206600102 白鳴鳴201206600101摘要：黃曲霉素是一種具有極強致癌性的劇毒真菌毒素，它廣泛存在于天然食品中。其中在天然食品中最常見的是黃曲霉素B1,其致癌性以及毒性是最強的。本文就黃曲霉素的分析檢測方法作論述并進行分析比較，并進行展望，為該方向的研究提供一些參考。關(guān)鍵詞：黃曲霉素；分析檢測Progress of Aflatoxin test and detectionAbstract: Aflatoxin is a kind of strong carcinogenic virulent fungus t

2、oxin, it widely exists in the natural food. Among them in the natural food the most common form of aflatoxin B1, its carcinogenicity and toxicity was the strongest.In this paper, the analysis method of aflatoxin is discussed and analyzed, to provide some reference for the direction of research.Key w

3、ords: aflatoxin; Analysis of test黃曲霉素(aflatoxin，AFT)，主要是由寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、黃曲霉(Aspergillus flaw )、和集峰曲霉(Aspergillusnomius)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一類真菌毒素。1993年世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)將其劃定為一類致癌物，具有高毒性，世界將其與其他兩種毒物并歸為三大強致癌物質(zhì)。它廣泛地存在于自然食物中，土壤、動植物、各種堅果(特別是花生和核桃中)中，在天然存在的食物中其存在形式主要為B1，B1的致癌性以及毒性也是最強的。其毒性約為KCN的10倍，

4、砒霜的68倍，致癌性約為二甲基亞硝胺的75倍，奶油黃的900倍，3，4一苯并芘的4 000倍，人畜若是誤食該毒素會引起內(nèi)臟出血性壞死，慢性中毒甚至引發(fā)癌癥。1我國的主要糧食作物大米以及玉米極易被黃曲霉毒素污染，而結(jié)晶的黃曲霉毒素B1的熱穩(wěn)定性較高，其分解溫度為268左右，故烹調(diào)中的一般加熱不能破壞黃曲霉毒素。2因此，能快速、有效地檢測出食品中的黃曲霉毒素對于食品安全來說具有很重要的實際意義。1.黃曲霉毒素的分析檢測方法目前測定食品中黃曲霉毒素主要采用高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS）、光譜法、酶聯(lián)免疫法和液相色譜飛行時間質(zhì)譜法（LCQTOF）等。我國

5、標準采用的是高效液相色譜法（HPLC）和薄層色譜法（TLC）測定食品當中的黃曲霉毒素B含量。311色譜法11.1高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法（HPLC）的原理是用高效液相色譜儀加柱后衍生系統(tǒng)分分離，用熒光檢測器測定。該方法速度快、靈敏度高、準確性高，檢測限值是目前所有方法中最低的，但其設(shè)備昂貴，且對工作人員身體健康有影響，若是與免疫親和柱一起使用，則可降低對工作人員身體的影響，但檢測費用會相對增加。4 然而該方法最大的缺點是熒光檢測器對黃曲霉毒素的四種分子具有選擇性，它對黃曲霉毒素G2、B2的很靈敏，但對黃曲霉毒素G1、B1的靈敏性卻不高。若想要提高B1、G1的熒光度，可以通過兩種

6、方法：1.改變流動相或者改進檢測器來減少熒光度損失或者增加靈敏度2.采用柱前或者柱后衍生來增強其熒光度。文鏡使用國產(chǎn)硅鎂制作的吸附柱層析分離純化玉米中的黃曲霉毒素B1，然后用高效液相色譜法分析檢測其中的黃曲霉毒素。結(jié)果證明該方法檢測最低限度可以達到0.08ng,回收率可以達到92.87%。該方法成本較低且制作方便。5MycoSep系列的多功能凈化柱（MFC）可以用于霉菌毒素的分離純化。該多功能凈化柱可以用于HPLC的前處理凈化，該方法可以一步完成凈化過程，并且效果理想。61.1.2薄層色譜法（TLC）薄層色譜法于1990年被列為AOAC標準方法，其原理是利用在樣品中的黃曲霉毒素和其它物質(zhì)在流動

7、相和固定相中的分配系數(shù)不同將其分離，然后在365nm波長的紫外線激發(fā)下使黃曲霉毒素產(chǎn)生熒光，將該熒光與標準品的進行比較從而測定其含量7。在365nm下觀察可發(fā)現(xiàn)，AFG1、AFG2、AFB1以及AFB2分別顯綠色、藍色、藍紫色和藍紫色。TCL的過程主要包括提取樣品、柱層析、洗脫、薄層分離?，F(xiàn)在的TCl的提純、凈化效果并不是非常理想，使得提取液中含有較多雜質(zhì)從而影響斑點的熒光強弱。薄層色譜法設(shè)備簡單，費用低，8因此目前國內(nèi)糧油、一般食品所采用的檢測方法都是薄層色譜法，但其前處理繁瑣，提取以及凈化效果并不是十分理想，靈敏度不高，并且對操作人員身體有害，因此此方法越來越不適合當前時代分析的要求。Ty

8、ihak在1979年提出了一種結(jié)合了高效薄層色譜法、高效液相色譜法以及經(jīng)典薄層色譜法的優(yōu)點的平面液相色譜技術(shù)高壓薄層色譜法（OPTLC）,它能顯著提高薄層分離效率。而后又有人提出了適合專門檢測小麥和玉米中的黃曲霉素的高壓薄層色譜法。12免疫化學(xué)法免疫化學(xué)法是目前比較有效的檢測黃曲霉毒素的方法。常用的方法包括金標免疫層析法（GICA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、免疫親和柱法、微柱篩選法。91.2.1金標免疫層析法（GICA）金標免疫層析法將色譜層析技術(shù)和膠體金免疫技術(shù)結(jié)合起來，其原理是利用樣品中的黃曲霉毒素B1 與膠體金顆粒表面的抗AFB1單克隆抗體反應(yīng)，若黃曲霉毒素超標，膠體金顆粒表面不會再有

9、剩余的抗體位點，它將不停留在檢測線而繼續(xù)上行與質(zhì)控線上的羊抗鼠LgG反應(yīng)，呈現(xiàn)紅色。若樣品中不含黃曲霉毒素或黃曲霉毒素含量未超標，則膠體金顆粒表面剩余的抗體會與檢測線上的物質(zhì)反應(yīng)呈現(xiàn)紅色。10Xiulan等合成了對一種對AFB1具有特異性的抗體金標探針，該探針結(jié)合免疫色譜法對AFB1進行分析所需最長時間僅10min，且最低檢測限度可達到2.5ng/ml.該方法檢測結(jié)果快速準確，因此十分適合快速檢測以及大量樣品的初選。111.2.2酶聯(lián)免疫法（ELISA） ELISA法是近年開發(fā)出的一種新方法，也是我國的國標方法之一。該法利用免疫、酶以及生化技術(shù)來檢測黃曲霉毒素含量，其原理是利用抗原與抗體之間的

10、特異性免疫反應(yīng)來測定黃曲霉毒素含量，并通過測酶活力來增加檢測的精確度。該發(fā)大致可以分為兩類：一是雙抗體夾心法，二是競爭法。該方法速度快，安全性高，精確度高。劉冬兒運用ELSA法對食品中的黃曲霉毒素進行測定，結(jié)果表明該方法檢測靈敏度高達0.015g/Kg,靈敏度比薄層色譜法提高300到400倍，回收率也高達89.2%。但是該方法的缺點是試劑保存期短且需在低溫條件下保存，假陽性的概率比較高，對含鹽以及脂肪量高的樣品需進行額外處理。1.2.3免疫傳感器法免疫傳感器又稱免疫電極，是與測定抗原抗體反應(yīng)有關(guān)的一類傳感器的統(tǒng)稱。傳感器主要有電化學(xué)免疫傳感器、壓電免疫傳感器、光電免疫傳感器。免疫傳感器操作簡單

11、、速度快、靈敏度高、成本低廉，在近年的研究中越來越得到重視。121.2.4管式磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析法該法原理是使被辣根過氧化酶標記的AFB1、AFB1與被FITC標記的AFB1單克隆抗體在均相體系中發(fā)生競爭性免疫反應(yīng)。而后加入被抗FITC包被的微磁粒使之與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，在磁場中分離洗滌后加入發(fā)光物質(zhì)，再通過用冷光分析儀測其發(fā)光強度來檢測AFB1含量。鄭國金13等人已經(jīng)成功將該方法用于檢測玉米樣品中的黃曲霉毒素B1，證明該方法有良好的穩(wěn)定性。1.3聯(lián)用法聯(lián)用法結(jié)合了多種方法一起用于檢測黃曲霉毒素，相對于單一的方法，往往會顯出其獨特的優(yōu)勢。1.3.1免疫親和柱-熒光光度法（IAC/SFB）

12、免疫親和柱-熒光光度法以單克隆免疫親和柱分離技術(shù)為基礎(chǔ)，在熒光光度法之前將樣品提取溶液中的黃曲霉毒素用免疫親和柱捕獲，而后將其用甲醇洗脫，用熒光光度法測定其中黃曲霉毒素含量。由于免疫親和柱是由與黃曲霉毒素B抗體偶聯(lián)的免疫親和球填充而成的，因此具有專一性。14且免疫親和柱能大大減少樣品中的雜質(zhì)峰數(shù)量。15免疫親和柱-熒光光度法檢測時間短，結(jié)果準確性高，且較HPLC以及TLC而言使用的有毒有害有機溶劑少，對檢測人員人體不會造成危害。但是其檢測費用較高，目前暫時無法在我國普及。14其他方法 目前，除了上述提到檢測方法，還發(fā)展出了許多新的方法檢測黃曲霉毒素。1.4.1表面增強拉曼散射技術(shù)表面增強拉曼散

13、射技術(shù)被廣泛應(yīng)用于痕量物質(zhì)檢測16，高思敏17等人利用表面增強拉曼散射技術(shù)（SERS）進行了黃曲霉毒素含量的檢測，該方法具有檢測速度快、所需樣品數(shù)量小的優(yōu)點。1.4.2流式細胞數(shù)流式細胞術(shù)是一種快速定量分析技術(shù)，它能對單個粒子進行多參數(shù)分析。李詠寧等人建立了一種應(yīng)用流式細胞術(shù)(FCM)檢測黃曲霉毒素的方法18，該方法是建立在間接競爭免疫法的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。由于流式細胞儀對每個微球的熒光信號是逐一收集和單個監(jiān)測的，數(shù)據(jù)樣本大，因此該檢測方法的準確度較其他方法而言更高。 1.4.3基于SMT的三維熒光導(dǎo)數(shù)光譜法檢測三維熒光導(dǎo)數(shù)能夠?qū)@得的激發(fā)波長與發(fā)射波長或其他變量同時變化時候的熒光強度表示成激發(fā)波

14、長時間或者波長發(fā)射波長等變量的函數(shù)。19杜樹新等人還建立了通過支持張量機（SMT）的三維熒光導(dǎo)數(shù)光譜而檢測食品中的黃曲霉毒素.20該方法通過將Savitzky-Golay多項式平滑微分方法擴展至三維熒光光譜，從而計算一階導(dǎo)數(shù)光譜。并通過SMT方法建立校正模型實現(xiàn)定量分析。通過該方法對牛奶和白酒中的黃曲霉毒素檢測證明，該方法建立的校正模型的性能要好于將張量轉(zhuǎn)為向量再用SVM和PLS法建立的校正模型。2主要幾種分析檢測方法的比較檢測方法名稱檢測限值g/Kg對人體是否存在危害性檢測一個樣品大致時間列入我國國家標準號高效液相色譜法（HPLC）1.0 存在30分種GB/T18979-2003薄層色譜法（

15、TLC）5.0存在大于4hGB/T5009.22-2003酶聯(lián)免疫法（ELISA）0.01存在大于4hGB/T5009.22-2003免疫親和柱-熒光光度法（IAC/SFB）1.0幾乎沒有15分鐘GB/T18979-2003 從圖表中可以看出酶聯(lián)免疫（ELISA）的檢測限值最低，其次是高效液相色譜法HPLC以及免疫親和柱-熒光光度法（IAC/SFB），而HPLC、TLC、ELISA均對人體有危害性，檢測時長TLC=ELISAHPLCIAC/SFB。因此，通過比較，發(fā)現(xiàn)IAC/SFB檢測時間短但檢測限值較ELISA法高。ELISA較其他方法檢測精度高但時間久。3展望黃曲霉毒素的高毒性以及不易通過

16、高溫去除的特性對人類危害極大，隨著人們對霉菌毒素認識水平的提生以及消費者對食品安全的關(guān)注度增加，黃曲霉毒素及其它霉菌毒素所引起的問題必將越來越受到重視。因此，發(fā)展建立快速有效的檢測方法十分有必要。目前測定食品中黃曲霉毒素主要采用高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、液相色譜質(zhì)譜法（LC-MS）、光譜法、酶聯(lián)免疫法和液相色譜飛行時間質(zhì)譜法（LCQTOF）等。我國標準采用的是高效液相色譜法（HPLC）和薄層色譜法（TLC）測定食品當中的黃曲霉毒素B含量。傳統(tǒng)的液相色譜法（HPLC）檢測限值低且檢測結(jié)果準確，但因為在檢測過程中需要用到一些對人體有毒害的有機試劑，因此該方法會對檢測人員的身

17、體造成傷害。薄層色譜法（TLC）作為傳統(tǒng)的檢測方法，與液相色譜法一樣會對工作人員造成傷害。因此，未來檢測方法的發(fā)展趨勢應(yīng)該是使檢測結(jié)果更加準確、檢測過程更加安全。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，表面增強拉曼散射（SERS）技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于微量物質(zhì)的檢測。以表面增強拉曼散射技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測黃曲霉毒素的方法，具有檢測迅速、結(jié)果準確、需要樣品數(shù)量少的優(yōu)點，是未來黃曲霉毒素分析檢測技術(shù)發(fā)展的趨勢。此外，利用抗原抗體反應(yīng)而設(shè)計的免疫傳感器，具有操作簡單、速度快、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點，非常適合農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)場的快速定量、定性檢測21。該方法在近年的研究中越來越得到重視，也必定會在成為黃曲霉毒素檢測未來發(fā)展的趨勢。 參

18、考文獻： 1 徐雪方,何方法,周學(xué)優(yōu)等,黃曲霉毒素BI誘發(fā)姐妹染色單體互換的研究J遺傳HEREDITAS,1986,8(2): 1-42勞文燕，林素珍.黃曲霉毒素對食品的污染及危害N.北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報,2011,25(1):1-33劉英，胡建華，劉春朝.黃曲毒素毒理效應(yīng)及檢測方法J.生物加工過程,2013,11(3)：4王光建，何才云，魯長等.用免疫親和柱分離、高效液相色譜法測定花生和玉米中黃曲霉毒素的研究.色譜,1995，13（4）:248-2465 李佐卿,謝東軍,孫大為等.光譜實驗室,2001,18(1):28-316柳潔，何碧英.高效液相色譜法測定食品中黃曲霉毒素的方法研究J.現(xiàn)代預(yù)防

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