第3章熒光分法ppt課件

1、第3章 熒光分析法3.1 概述3.2 熒光光譜的基本原理 3.3 定量分析方法 3.4 熒光分析技術(shù)及應(yīng)用3.1 概述1. 熒光和磷光的發(fā)展簡史2. 基本概念16世紀(jì)：在礦物和植物提取液中發(fā)現(xiàn)熒光；1575年：monardes-植物愈創(chuàng)木切片黃色水溶液-天藍色熒光；1852年：stokes闡明熒光發(fā)射機制(奎寧和葉綠素的熒光)；1905年：wood發(fā)現(xiàn)氣體分子的共振熒光；1926年: gaviola直接測定了熒光壽命；1923年：熒光x射線光譜；1964年：原子熒光光譜分析的建立；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應(yīng)用；15世紀(jì): 磷光被發(fā)現(xiàn)(重晶石在強烈陽光下的發(fā)光)1944年：lewis

2、提出磷光用于分析的可能性；1957年：keirs將磷光分析用于定量分析及多組分混合物分析；1963年：廣泛用于血液及尿液中痕量藥物及農(nóng)藥殘留量分析。3.1 概述3.1.1熒光和磷光的發(fā)展簡史3.1 概述3.1.2.基本概念o 處于基態(tài)的分子吸收能量被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)釋放能量返回至基態(tài)。如果通過碰撞以熱能或動能的形式釋放能量回到基態(tài)，稱為無輻射躍遷；如果是以輻射(發(fā)射光子)的形式回到基態(tài)，此種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。常見的光致發(fā)光包括熒光和磷光。o 熒光光譜法：基于化合物的熒光測量而建立起來的分析方法，稱為熒光光譜法。特點：靈敏度高，檢測限通常在ppb級(熒光10-7-10-9mg/

3、ml)；發(fā)光參數(shù)多，可進行動力學(xué)分析；分析線性范圍比吸收光譜法寬；選擇性比吸收光譜法好。3.2 基本原理3.2.1 分子熒光光譜的產(chǎn)生3.2.2 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3.2.3 發(fā)光參數(shù)3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素3.2 基本原理3.2.1 分子熒光光譜的產(chǎn)生1. 分子能級與電子能級的多重態(tài)2. 熒光和磷光的產(chǎn)生3.2 基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生1. 分子能級與電子能級的多重態(tài) 基態(tài)基態(tài)：處于基態(tài)的分子，由于成對電子填充在能量最低的各軌道中，能量最低最穩(wěn)定，所處的能態(tài)稱為基線單重態(tài)(圖示a狀態(tài))。 單重態(tài)單重態(tài)：當(dāng)基態(tài)一對電子中的一個被激發(fā)到較高能級，其自旋方向不會立刻改變，分子仍處

4、于單重態(tài)激發(fā)單重態(tài)(圖示b狀態(tài))。 三重態(tài)三重態(tài)：如果某電子在躍遷過程中，發(fā)生自旋方向改變，則分子具有兩個自旋不配對、自旋方向平行的電子，即分子處于激發(fā)三重態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)略低(圖示c狀態(tài))。 光吸收過程光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷光振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間竄躍3.2 基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生2. 熒光和磷光的產(chǎn)生熒光和磷光的產(chǎn)生復(fù)習(xí)電磁波譜：光的波粒二象性hchchecc 1；，射線射線x射線射線 紫外光紫外光 可見光可見光 紅外光紅外光微波微波無線電波無線電波/nm 0.01 10 400 760 5105 8105mhz 波長頻率

5、短高長低3.2 基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生2. 熒光和磷光的產(chǎn)生熒光和磷光的產(chǎn)生吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫系間竄躍振動馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)3.2 基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生2. 熒光和磷光的產(chǎn)生熒光和磷光的產(chǎn)生3.2 基本原理3.2.1分子熒光光譜的產(chǎn)生2. 熒光和磷光的產(chǎn)生熒光和磷光的產(chǎn)生 輻射躍遷發(fā)光失活輻射躍遷發(fā)光失活 熒光熒光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線態(tài)s1的最低振動能級回到基態(tài)s0所發(fā)出的輻射。 磷光磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)t1的最低振動能級回到基態(tài)s0所發(fā)出的輻射。 波長關(guān)系波長關(guān)系：激發(fā)光熒光磷光。 3.2 基本原理3.2.1分子熒光光譜

6、的產(chǎn)生2. 熒光和磷光的產(chǎn)生熒光和磷光的產(chǎn)生 無輻射失活無輻射失活 振動弛豫振動弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動能級轉(zhuǎn)至較低振動能級的過程，其效率較高 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)兩個電子能級非常接近以致其振動能級有重疊時，電子由高能級回到低能級的過程。 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑、溶質(zhì)分子之間發(fā)生相互碰撞而失去能量的過程。 系間竄越系間竄越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。 任何熒光化合物都具有激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光或磷光光譜)兩種特征光譜3.2 基本原理 3.2.2 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜3.2 基本原理 3.2.2 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 激發(fā)光譜和發(fā)

7、射光譜具有三個特點： 斯托克斯位移，波長：熒光激發(fā)光； 熒光光譜和激發(fā)光譜大致成鏡像對稱； 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長無關(guān)。圖11-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜3.2 基本原理 3.2.2 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖11-4 蒽(乙醇)的激發(fā)光譜和不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜/nm吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù)熒光產(chǎn)率3.2 基本原理 3.2.3 發(fā)光參數(shù) 熒光壽命熒光壽命(f)：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最大熒光強度的一半所需的時間稱為熒光壽命(10-8 10-10s)。熒光物質(zhì)受到一個極短時間的脈沖光激發(fā)后，熒光強度從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化，可用指數(shù)衰減定律表示：ft=f0e-k

8、t。f0、ft ：開始時和t時的熒光強度，k為衰減常數(shù)。 熒光產(chǎn)率熒光產(chǎn)率( )：又稱為熒光量子產(chǎn)率、熒光效率。3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素1.內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對熒光效率的影響2.外部因素：外界條件對熒光效率的影響 內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強的紫外吸收和一定的熒光產(chǎn)率是發(fā)射熒光的兩個必備條件。分子結(jié)構(gòu)中有躍遷（k帶強吸收）或n躍遷（r帶弱吸收）。 長共軛結(jié)構(gòu)：分子中必須具有大的共軛鍵結(jié)構(gòu)。共軛度越大，發(fā)射波長長移，發(fā)光強度增加。 分子的剛性和共平面性：具有剛性平面性結(jié)構(gòu)的分子熒光量子產(chǎn)率高。 取代基的影響：給電子取代基使熒光強度增大；而吸電子取代基則

9、使熒光強度降低。 3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素1.內(nèi)部因素3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素1.內(nèi)部因素 長共軛結(jié)構(gòu)示例femex(nm)/(nm)/比較：苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36ch2ococh3維生素a ex327nm；em510nm 3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素1.內(nèi)部因素 剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例 形成絡(luò)合物后，如果分子的剛性和共平面性增強，可使熒光增強。聯(lián)苯f0.2 芴f1.0nohnomg8-羥基喹啉羥基喹啉8-羥基喹啉鎂羥基喹啉鎂 3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因

10、素1.內(nèi)部因素 空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。 順反異構(gòu)體：反式分子有熒光，而順式分子沒有熒光(位阻原因)。例如：1，2二苯乙烯反式有強烈熒光，而順式無熒光。1-二甲胺基萘-7-磺酸鹽 1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽f0.75 f0.03so3nanh3cch3so3na nh3cch33.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素1.內(nèi)部因素 取代基作用 第一類取代基是給電子基團，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長長移。如：nh2、oh、och3 、nhr、cn等。 第二類取代基是吸電子基團，會妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。如：cooh、no2、co、no、

11、sh、nhcoch3、x(鹵素原子序數(shù)，熒光效率)等。 第三類取代基對電子共軛體系作用較小，對熒光的影響不明顯。如：r、so3h、nh3等。 表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式f/nm相對熒光強度苯c6h6270-31010甲苯c6h5ch3270-32017丙基苯c6h5c3h7270-32017氟代苯c6h5f270-32010氯代苯c6h5cl275-3457溴代苯c6h5br290-3805碘代苯c6h5i-0苯酚c6h5oh285-36518苯酚陰離子c6h5o-310-40010甲氧基苯c6h5och3285-34520苯胺c6h5nh2310-40520苯胺正離子c6h5nh

12、3+-0苯甲酸c6h5cooh310-3903腈基苯c6h5cn280-36020硝基苯c6h5no2-0 外部因素：外界條件對熒光強度的影響 溫度的影響：溫度降低會使熒光強度增大；溫度升高熒光強度減小。 溶劑的影響：溶劑極性增加有時會使熒光強度增加，熒光波長長移；溶劑的黏度減小，熒光強度減弱。 ph的影響：對于弱酸或弱堿性熒光物質(zhì)，溶液的ph值改變，影響其解離平衡，使熒光強度發(fā)生變化。 熒光熄滅的影響：熒光物質(zhì)與熒光熄滅劑相互作用，引起熒光強度降低。 散射光的干擾：瑞利光和拉曼光。3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素2.外部因素3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素2.

13、外部因素ph值影響熒光強度示例nh3nh2nhohhohh ph值： 13存在形式：離子 分子 離子有無熒光：無 藍色熒光 無0 20 10 18nhhc nhhc ohc ohhc 3562565656 光強度 相對熒：3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素2.外部因素 熄滅劑：鹵素離子、重金屬離子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。 瑞利光(reyleigh scattering light)：光子與分子發(fā)生彈性碰撞時，僅改變光子運動方向，不發(fā)生能量交換，這種散射光稱為瑞利光。特點特點：波長與入射光相同。 拉曼光(raman scattering light)

14、：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時，不僅改變光子運動方向，而且發(fā)生能量交換，這種散射光稱為拉曼光。特點特點：當(dāng)光子失去部分能量時，波長比入射光長，干擾最大；當(dāng)光子多得到部分能量時，波長比入射光短。消除方法消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長可消除拉曼光干擾。3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素2.外部因素h3connchhch2hohhh2so4h2o1/2例如：硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜320448448360320350400350350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/lh2so4激發(fā)320nm0.1mol/lh2so4強強度度

15、(a)強強度度(b)/nm/nm/nm/nm圖11-6硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜3.2 基本原理 3.2.4 影響物質(zhì)發(fā)光的因素2.外部因素3.3 定量分析方法3.3.1 熒光強度與濃度的關(guān)系3.3.2 定量分析方法 熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強度(f)與熒光物質(zhì)吸收光的程度以及發(fā)射熒光的能力有關(guān)。測試熒光的方向與激發(fā)光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。kcclikfcleikfeiikiikfclcl0303. 20303. 2003 . 205. 01beer時，上式簡化為當(dāng)定律率為常數(shù)，取決于熒光效0iif熒光分析定量依據(jù)：熒光強度f與濃度c成線性關(guān)系。3.3

16、 定量分析方法3.3.1 熒光強度與濃度的關(guān)系1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過和試樣相同的處理之后，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定該標(biāo)準(zhǔn)系列的熒光強度，繪制f(縱)-c(橫)標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測熒光物質(zhì)的含量。2. 比例法若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過原點，在線性范圍內(nèi)可采用比例法(只需1個標(biāo)準(zhǔn)溶液)；若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點，則應(yīng)扣除空白溶液的熒光強度后再計算：3. 多組分混合物的熒光分析ssxxxsxsxsscffffcccffffcffcff00000003.3 定量分析方法3.3.2 定量分析方法3.4 熒光分析技術(shù)及應(yīng)用3.4.1 熒光儀器簡介3.4.2

17、應(yīng)用與示例3.4.3 熒光分析技術(shù)熒光分光光度計方框圖光源第一單色器第二單色器檢測器放大記錄器i0if樣品吸收池1光電熒光計：基本淘汰。2熒光分光光度計：能繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。 第一單色器(激發(fā)單色器)選擇激發(fā)光波長(250nm) 第二單色器(熒光單色器)與激發(fā)光入射方向垂直，選擇熒光波長，可提高方法的選擇性和準(zhǔn)確度。 3.4 熒光分析技術(shù)及應(yīng)用3.4.1 熒光儀器簡介圖118 熒光儀器的光路示意圖a 光電熒光計第一濾光片第二濾光片電表光電管樣品池狹縫汞弧燈樣品池檢測器光源b 熒光分光光度計3.4 熒光分析技術(shù)及應(yīng)用3.4.1 熒光儀器簡介3.4 熒光分析技術(shù)及應(yīng)用 3.4.2 應(yīng)用與示例1. 無機化合物的熒光分析o 熒光法靈敏度高、選擇性好，可用于痕量分析，但是能發(fā)生熒光的化學(xué)體系不多，這是熒光法的應(yīng)用特點。o 無機物通過與熒光試劑(如下圖)作用生成熒光螯合物而進行熒光分析，非過渡金屬離子的熒光螯合物較多，熒光試劑具有兩個(或以上)與mz+形成螯合物的電子給予體官能團的芳香結(jié)構(gòu)。參閱p291.表112無機離子的熒光測定法。能引起熒光熄滅(猝滅)化合物，可用熒光猝滅法測定。