SDS-PAGE分離膠配方表-及其原理

1、薃SDS-PAGE電泳原理：賺聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯(lián)劑N ,N'亞甲基雙丙烯酰 胺（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并 以此為支持物進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的 差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)， 蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū) 帶。蚆SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比 例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電 荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種

2、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種 電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDSPAGE）。由于SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度， 如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含 有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDS PAGE后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。裊TEMED :通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合芄過硫酸銨（AP）：提供驅(qū)動丙烯酰胺與雙丙烯酰胺所必須的自由基羀SDS PAGE可分為圓盤

3、狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。本實驗采 用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)。所謂 不連續(xù)”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、 pH和凝膠孔徑等所組成。羀1蛋白樣品濃縮效應(yīng)芅在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有上、下槽緩沖液（TrisGly，pH8.3）、濃縮膠緩沖 液（Tris HCl，pH6.8）、分離膠緩沖液（Tris HCl，pH8.8），兩種凝膠的濃度（即 孔徑）也不相同。在這種條件下，緩沖系統(tǒng)中的 HCI幾乎全部解離成CI-，兩槽 中的Gly （pl= 6.0，pK a=9.7）只有很少部分解離成 Gly的負(fù)離子，而酸性蛋白質(zhì) 也可解離出負(fù)離子。這些離子在電泳時都向正極移動。C1 速度最快（先導(dǎo)離子

4、）， 其次為蛋白質(zhì)，Gly負(fù)離子最慢（尾隨離子）。由于C1很快超過蛋白離子，因此 在其后面形成一個電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域，該區(qū)電位梯度最高，這是在 電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和Gly離子加快移動，結(jié)果使蛋白質(zhì)在進入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利于提高電泳 的分辨率。螂2.分子篩效應(yīng)羂蛋白質(zhì)離子進入分離膠后，條件有很大變化。由于其 pH升高（電泳進行時常 超過9.0）,使Gly解離成負(fù)離子的效應(yīng)增加；同時因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動受到影響，遷移 率急劇下降。此兩項變化，使 Gly的移動超過蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù) 存在，蛋白質(zhì)便在一個較均一的pH和

5、電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動。分離膠的孔徑有一定的大小，對不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說， 通過時受到的 阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大 小的蛋白質(zhì)相互分開。肀SDS-PAGE電泳膠配制:蚆分離膠（12%）蒄螁4ml膀8ml肇 10ml羂h2o薀 1.32ml芀 2.64 ml芄 3.3ml蚄 Acr/Bis(30%)艿 1.6ml3.2 ml4.0ml1.5M Tris-HCI(pH8.8)1.0ml2.0ml2.5mlSDS(30%)40卩l(xiāng)80 gl100 glAP(10%)40 gl80 gl100 glTEMED1.6 gl3.2 gl10

6、0 gl水封30分鐘濃縮膠（5%）2 ml4 ml5 ml出01.36 ml2.72 ml3.4 mlAcr/Bis(30% )0.33ml0.66 ml0.83ml1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.25 ml0.5 ml6.3mlSDS(30%)20 gl40 gl50 glAP(10%)20 gl40 gl50 glTEMED2.0 gl4.0 gl5.0 glSDS-PAGE試劑配制:試劑名稱配制方法備注30% Acr/Bis29% （w/v）丙烯酰胺、1% （w/v ） N,N-亞甲雙丙烯酰胺、一般配置100ml，稱重Acr 29g，Bis 1g，加溫?zé)岬娜ルx子水100ml，

7、溶解室溫，藏于棕色瓶子，幾個月需要重 新配制。具有強神經(jīng)毒性，易吸附于 皮膚，配置是應(yīng)帶面具和手套。1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.5M/L, 一般配置 100ml，稱重 23.6g，加須用Ttis堿，用HCI調(diào)節(jié)pH去離子水100毫升，溶解1.0M Tris-HCI(pH6.8)1.0M/L, 般配置 100ml，稱重 15.8g，加去離子水100毫升，溶解須用Ttis堿，用HCI調(diào)節(jié)pH10% SDS10%( w/v)，一般配置 100ml，稱重 10g，加去離子水100ml，溶解不同廠家的SDS相差較大，建議用同一家的統(tǒng)一級別的試劑10%過硫酸銨(AP)10% (w/v)，稱

8、重10g，加去離子水100ml，溶解過硫酸銨容易分解，建議隔周配置存 于4 'C冰箱或者分裝200門存于-20 CTEMEDTris-甘氨酸電泳緩沖液5 X緩沖液:25mmol/L Ttis 堿,250mmol/L 甘氨酸(電泳級，pH8.3)，0.1%SDS 配置：900ml去離子水，加15.1g Ttis堿， 94g 甘氨酸，50ml 的 10% (w/v) SDS 溶液，補去離子水至 1000ml5 x緩沖液：去離子水以1:4稀釋后為1X的緩沖液，可以重復(fù)使用3次左右僅供個人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and r

9、esearch; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.t o ji e k ogfljirogeifcc, TOpBicnob3 groimio 麻yqeHuicic 碼 egoBua Hudo 員冶hbiucno 員 B30BaTbCEb KoMMepqeckux qeiix.以下無正文僅供個人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins pe