3zhou目的蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測

1、實(shí)驗(yàn)五目的基因的原核表達(dá)及檢測實(shí)驗(yàn)?zāi)康?重點(diǎn)掌握重點(diǎn)掌握表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建的原理及方法的原理及方法 掌握目的基因原核掌握目的基因原核誘導(dǎo)表達(dá)誘導(dǎo)表達(dá)的原理及方法的原理及方法 了解目的蛋白質(zhì)了解目的蛋白質(zhì) “標(biāo)簽標(biāo)簽”純化純化的基本原理和的基本原理和方法方法 掌握掌握page變性凝膠電泳變性凝膠電泳的原理及方法的原理及方法 掌握掌握考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色的方法的方法實(shí)驗(yàn)原理 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá) 目的蛋白質(zhì)的純化 目的蛋白質(zhì)的檢測實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)的表達(dá)：將克隆基因克隆基因插入合適載體合適載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法。 體內(nèi)很難分析單個(gè)蛋白質(zhì)的作用 進(jìn)行大量表達(dá)和純化

2、是為了在體外進(jìn)行研究 應(yīng)用于蛋白純化、定位及功能分析等方面實(shí)驗(yàn)原理圖圖 pet14b-his-tat-egfp-p38-16 peptides 融合蛋白融合蛋白在在hela細(xì)胞中的熒光顯微鏡檢測（細(xì)胞中的熒光顯微鏡檢測（400）例例 酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)的蛋白具有正常的表達(dá)的蛋白具有正常的活性、構(gòu)象活性、構(gòu)象 技術(shù)難度較大、耗時(shí)、技術(shù)難度較大、耗時(shí)、耗資耗資 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡單，時(shí)間實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡單，時(shí)間較短，費(fèi)用低，系統(tǒng)較短，費(fèi)用低，系統(tǒng)比較完備比較完備 不能有效地對重組蛋不能有效地對重組蛋

3、白質(zhì)進(jìn)行修飾加工，白質(zhì)進(jìn)行修飾加工，易形成包涵體易形成包涵體原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)原理 原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)菌株原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)菌株 菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。 堪稱經(jīng)典的bl21系列就是lon和ompt蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。 大名鼎鼎的bl21(de3)融源菌則是添加t7聚合酶基因，為t7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。 實(shí)驗(yàn)原理 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 目的基因目的基因 表達(dá)載體表達(dá)載體plasmidtaglaciqpromotera

4、mpr多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理 目的基因目的基因 / dna / pcr / 酶切酶切 / primer 例：例：p38中抑制多肽16肽序列 gga aga aca ttg ttt cct ggt aca gac cat att gat cag ttg aag ctcf 5-acg gat cc ta gga aga aca ttg ttt cct ggt-3 r 5-acg gat cc tta gag ctt caa ctg atc aat atg g-35端引物中ac是隨機(jī)保護(hù)堿基，g gat cc是bamh i酶切位點(diǎn)，ta是為防止移碼而引入的兩個(gè)堿基，隨后是編碼16肽前7個(gè)氨基酸

5、的堿基序列。3端引物中ac是隨機(jī)保護(hù)堿基，g gat cc是bamh i酶切位點(diǎn)，taa是終止密碼子的反向互補(bǔ)序列，隨后是從編碼16肽堿基序列的最后一個(gè)堿基開始的反向互補(bǔ)序列。實(shí)驗(yàn)原理 表達(dá)載體表達(dá)載體 能將外源基因運(yùn)載到大腸桿菌細(xì)胞中;在基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件表達(dá)元件，就構(gòu)成了表達(dá)載體。 元件 啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別序列 誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件 操縱子序列操縱子序列 調(diào)控基因調(diào)控基因 多克隆位點(diǎn) 融合tag 復(fù)制起始序列 篩選標(biāo)記/報(bào)告基因 各種表達(dá)載體的不同之處 在于其表達(dá)元件的差異。實(shí)驗(yàn)原理啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組成

6、型表達(dá)和誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)。lac和tac，pl和pr，t7是最常用的啟動(dòng)子， 轉(zhuǎn)錄終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子、終止子、核糖體識(shí)別序列操縱子序列及配套的調(diào)控基因 誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件多克隆位點(diǎn)復(fù)制起始序列實(shí)驗(yàn)原理用作分離的載體蛋白被稱為標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽 （tag）。標(biāo)簽位于表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)的n端或者c端，能夠與目的基因融合表達(dá)（n端或者c端融合表達(dá)）。目前常用的標(biāo)簽有組氨酸標(biāo)簽（his-tag）谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（glutathione s transferase）標(biāo)簽（gst-tag）硫氧還蛋白（thioredoxin, trx）標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose bi

7、nding protein, mbp）蛋白質(zhì) a（protein a）纖維素結(jié)合位點(diǎn)（cellulose binding domain）標(biāo)簽等。一般對于小分子用較大的tag（如gst）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小tag（如his）減少對目的蛋白的影響。實(shí)驗(yàn)原理 篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記/ /報(bào)告基因表達(dá)報(bào)告基因表達(dá) 抗藥性基因，抗藥性基因，amp是最常見的篩選標(biāo)記，是最常見的篩選標(biāo)記，kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素。新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素。 抗性基因的選擇要注意是否會(huì)對研究對象產(chǎn)生干擾，抗性基因的選擇要注意是否會(huì)對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代

8、比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。謝物相互作用。 gfp（綠色熒光蛋白）是最常用的報(bào)告基因了，半（綠色熒光蛋白）是最常用的報(bào)告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。乳糖苷酶，熒光素酶。 一些融合表達(dá)一些融合表達(dá)tag也有報(bào)告基因的功能。也有報(bào)告基因的功能。實(shí)驗(yàn)原理 常用表達(dá)載體常用表達(dá)載體 pgex系列載體是谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶（gst）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的載體。 ptac promoter amp pgex - kg pet系列的載體是his6融合蛋白的表達(dá)載體。 t7 kana pet - 14b實(shí)驗(yàn)原理 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá) laci q（lactose）

9、 laci是大腸桿菌中l(wèi)ac 操縱子（operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)的阻遏蛋白是lac 操縱基因（operator）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。 當(dāng)有乳糖存在時(shí)，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對操縱基因的抑制，使lac 操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacz（-半乳糖苷酶)、lacy（透性酶)、laca(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達(dá)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。 iptg（異丙基-d-1-硫代半乳糖苷) 作為乳糖的類似物與laci阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制，因此iptg經(jīng)常作為lac 操縱子的誘導(dǎo)劑而使用。實(shí)驗(yàn)原理amprplasmidpgex-kggstlaciqptac promoterampriptg多克

10、隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理bamh inde ibamh icdna酶切酶切nde i基因片段基因片段酶切后的目的基因酶切后的目的基因 酶切酶切 連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化篩選（藍(lán)白斑）篩選（藍(lán)白斑）鑒定（鑒定（pcr、酶切、測序）、酶切、測序）原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功 原核表達(dá)的誘導(dǎo)條件原核表達(dá)的誘導(dǎo)條件 iptg濃度：濃度： 0.01-5mmol/l 誘導(dǎo)時(shí)間：誘導(dǎo)時(shí)間：3h 誘導(dǎo)溫度：誘導(dǎo)溫度：15-42 實(shí)驗(yàn)原理 目的蛋白質(zhì)的純化目的蛋白質(zhì)的純化 破碎細(xì)胞 超聲破碎 溶菌酶裂解 從細(xì)胞蛋白中純化出gst和his融合蛋白 gst可以通過谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。由于gst

11、對谷胱甘肽的親和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對gst及其融合蛋白進(jìn)行純化，最后通過含有游離的谷胱甘肽的緩沖液,洗脫結(jié)合的gst融合蛋白。 poly his多聚組氨酸能與多種過渡金屬或過渡金屬鰲和物結(jié)合，因此帶his-6的蛋白能結(jié)合與固化的ni2+樹脂，用適當(dāng)?shù)木彌_液（pbs）洗沖洗去除其他雜蛋白后，再用可溶的競爭性鰲合劑（咪唑）洗脫可以回收靶蛋白。實(shí)驗(yàn)原理 目的蛋白質(zhì)的檢測目的蛋白質(zhì)的檢測 蛋白質(zhì)分子量的檢測 sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳 目的蛋白質(zhì)的分析實(shí)驗(yàn)原理 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）是目前用于測定蛋白質(zhì)分子量最好的方法。 sds

12、是一種強(qiáng)陰離子型去污劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入sds和還原劑后，強(qiáng)還原劑例如巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，通過加熱使蛋白質(zhì)解離。解離后的氨基酸側(cè)鏈與sds結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-sds復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)中加入蛋白質(zhì)中加入 sds 并加熱，并加熱， sds 分子上的非極性區(qū)分子上的非極性區(qū) (黃色尾巴黃色尾巴)會(huì)與蛋白質(zhì)上的非會(huì)與蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長條分子，上面布滿極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長條分子，上面布滿 sds 分子。分子。sds 分分子的極性區(qū)子的極

13、性區(qū) (洋紅色圓點(diǎn)洋紅色圓點(diǎn))，則露在外面，以增加親水性。，則露在外面，以增加親水性。sds是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。sds最終使蛋白質(zhì)變成具有高負(fù)電荷的線狀分子。最終使蛋白質(zhì)變成具有高負(fù)電荷的線狀分子。97.0 kda實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 誘導(dǎo)、培養(yǎng)誘導(dǎo)、培養(yǎng) 37恒溫?fù)u床 電泳檢測電泳檢測 h

14、oefer minive vertical electrophoresis system 儀器與設(shè)備 lb培養(yǎng)基、amp、iptg 30%丙烯酰胺貯液 1.0m tris(ph6.8)(濃縮膠),1.5m tris(ph8.8)(分離膠) 10%sds，10%過硫酸銨（aps作用主要是提供自由基，然后在促凝劑temed的作用下使丙烯酰胺及甲叉丙烯酰胺聚合。 ），四甲基乙二銨（temed可以催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，從而加速丙烯酰胺凝膠的聚合 ） 1xtris-甘氨酸電泳緩沖液：25mm tris, 250mm 甘氨酸，0.1% sds 1xsds上樣緩沖液：50mm tris-hcl（6.8），

15、100mm dtt，2% sds，10% 甘油，0.1% 溴酚藍(lán) 染色液：90甲醇：90冰乙酸：20水0.5g r-250 脫色液：90甲醇：90冰乙酸：20水實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)步驟 培養(yǎng) 誘導(dǎo) 樣品制備 sds-page 凝膠檢測實(shí)驗(yàn)步驟1）挑取單菌落，接入3ml含氨芐青霉素（50ug/ml）的lb培養(yǎng)液， 37培養(yǎng)過夜。2）取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素（50ug/ml）的lb培養(yǎng)液，37振蕩培養(yǎng)2h以上，至對數(shù)中期（a600=0.50.6）。3）吸出1ml未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物放在一個(gè)微量離心管中，室溫高速離心1min，沉淀懸浮于100ul pbs中，加入溶菌酶（終濃度1mg/ml）37

16、度消化。4）在剩余培養(yǎng)物中加入iptg至終濃度1mmol/l，37 繼續(xù)培養(yǎng)3h，取1ml樣品放于微量離心管中，室溫高速離心1min ，沉淀懸浮于100ul pbs中，加入溶菌酶（終濃度1mg/ml） 37度消化。 。5）消化后混合等體積的1 x sds凝膠加樣緩沖液，100度加熱3min，室溫高速離心1min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測6 ）將電泳槽玻璃板洗凈，吹干，并用凡士林封邊,安裝好7 ）配12%分離膠，將配好的分離膠立即倒入凝膠槽內(nèi)，至凝膠槽 高三分之二處，加蒸餾水密封。待膠凝固后（約需 30min倒掉 水，用吸水紙吸干8）配5%濃縮膠將配好的濃縮膠

17、立即倒入凝膠槽內(nèi)（以插入梳子不 溢出為宜），插入梳子9）待膠凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中10）制備好的樣品加入上樣孔11）連接電泳儀12）打開電源，調(diào)整電壓至80v，待樣品跑過濃縮膠（大約需 30min）后將電壓調(diào)至120v，待指示劑（溴酚蘭）到達(dá)凝膠 的底部距離下緣1cm時(shí)停止電泳，大約需2h，電泳結(jié)束。sds-page聚丙烯酰胺凝膠配制（mini ve）12分離膠5%濃縮膠h2o2.45 ml 2.05ml30%丙稀酰胺3.0 ml0.5mltris 緩沖液1.9 ml（1.5m ph8.8）375ul （1.0m ph6.8）10%sds75 ul30ul10%過硫酸銨75 ul30u

18、l temed3 ul3ul注：1 . 丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時(shí)要小心，操作請務(wù)必戴手套。 2. 過硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。 3. 1塊膠可以用10 ml離心管，2塊膠要使用小三角瓶便于混勻，配制 后余液可暫時(shí)留存，便于參考膠凝固時(shí)間，一般30min即可。目的蛋白質(zhì)的檢測-考馬斯亮藍(lán)染色 考馬斯亮藍(lán)r250（coomassie brilliant blue）是一種三苯甲烷紡織染料，又稱酸藍(lán)83，分子上含有兩個(gè)s03h基團(tuán)，偏酸性，能結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。 能夠檢測出大于0.1ug蛋白條帶。 將凝膠浸泡在染色液中，室溫在搖床上緩慢染色4小時(shí)（或過夜）。 脫染：將染液回收，凝膠先用蒸餾水漂洗一次，浸入脫染液中脫染，