中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)考查知識(shí)點(diǎn)整理

1、藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)考查知識(shí)點(diǎn)整理第一部分：HPLC使用注意事項(xiàng)1、HPLC組成：泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀2、反相色譜：分離機(jī)理：“反相色譜”固定相極性小于流動(dòng)相極性常用流動(dòng)相：乙腈、甲醇，水3、色譜柱的分類：按填料：球形、無(wú)定形按含碳量：C18、C8按應(yīng)用：分析柱、制備柱、預(yù)處理柱按粒徑：150mm*4.6mm,5m等按填料類型：正相柱、反相柱、手性柱4、鍵合相色譜柱的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定不易流失；應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑；消除硅羥基的不良影響；缺點(diǎn)：pH得在38范圍內(nèi)5、C18柱的活化：90% 10% 90%的甲醇溶液1ml/min依次沖洗30min6、流動(dòng)相：使用之前需超

2、聲脫氣（PPT18） 目的：色譜泵輸液準(zhǔn)確 提高檢測(cè)性能 保護(hù)色譜柱 流動(dòng)相脫氣的方法：加熱，抽真空，超聲，通惰性氣體 流動(dòng)相組成： 流動(dòng)相配置： 緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不要儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，避免pH值發(fā)生變化和成分分解，影響色譜分離的效果； 有機(jī)溶液和緩沖液使用前均需經(jīng)0.45m微孔濾膜過(guò)濾； 流動(dòng)相使用前脫氣。7、常用定量方法： 外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法（準(zhǔn)確麻煩） 內(nèi)標(biāo)物的要求：化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測(cè)品相似；樣品中不存在；不與樣品組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；保留值與待測(cè)值接近；濃度相當(dāng)；與其他色譜峰分離好8、樣品的預(yù)處理： 目的：除雜質(zhì)；濃縮微量成分；改善分離；保護(hù)色譜柱；提高檢測(cè)靈敏度 方法：高速離心，過(guò)濾，選擇性沉淀，

3、衍生反應(yīng)；液固萃取、液液萃取 沉淀蛋白的溶劑： 有機(jī)溶劑：乙腈、甲醇 強(qiáng)酸：三氯乙酸、過(guò)氯酸 鹽：50%硫酸銨、10%TCA分析測(cè)定用試劑為色譜純及以上，水為超純水第二部分：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、考慮問(wèn)題：動(dòng)物種屬、給藥劑量、取血時(shí)間、采樣量、血藥濃度大概范圍2、分析方法建立：色譜柱、流動(dòng)相組成、柱溫箱溫度、樣品處理方法、風(fēng)量下限與標(biāo)曲范圍第三部分：實(shí)驗(yàn)相關(guān)條件與數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)一： 1、采血點(diǎn)設(shè)計(jì)一般原則 為獲得給藥后的一個(gè)完整的血藥濃度-時(shí)間曲線，采樣時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)應(yīng)兼顧藥物的吸收相、平衡相（峰濃度附近）和消除相。一般在吸收相至少需要23個(gè)采樣點(diǎn)，對(duì)于吸收快的血管外給藥的藥物，應(yīng)盡量避免第一個(gè)點(diǎn)是峰濃度

4、（Cmax）；在Cmax附近至少需要3個(gè)采樣點(diǎn)；消除相需要46個(gè)采樣點(diǎn)。整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到35個(gè)半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/101/20。為保證最佳采樣點(diǎn)，建議在正式試驗(yàn)前，選擇23只動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，然后根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，審核并修正原設(shè)計(jì)的采樣點(diǎn)。 2、動(dòng)物給藥方式：股靜脈注射3、麻醉：腹腔注射20%烏拉坦4、采血方式：眼眶靜脈叢采血（0.3ml/次）5、蛋白沉淀方式：10%高氯酸，渦旋，15000rpm 10min,取100ul上清二次離心6、非那西丁色譜條件流動(dòng)相：50mM磷酸鹽緩沖液（6.8g磷酸二氫鉀加入到152mL的氫氧化鈉溶液（0.1mol/L）中，并稀釋到1L）

5、：乙腈（60:40） 色譜柱：島津 Shimadzu VP-ODS; 150×4.6; 5m 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm 柱溫：40 進(jìn)樣體積：20L6、參數(shù)計(jì)算由曲線線性判斷為一房室模型，參數(shù)計(jì)算如下：參數(shù)公式值C0由y = 9.511e-0.02 令x=0得9.511l/mlT1/2由y = 9.511e-0.02 令y=0.5C0得34.66mink由T1/2=0.693/k得0.02min-1VdVd=X(給藥量)/C0 X=1.25ml*2mg/ml=2.5mg262.8mlCLCL=k*Vd5.25min-1ml-1MRTMRT=1/k50.01minAUCAUC=X/CL48

6、0g.min參數(shù)非房室值k由-k/2.303=-0.0110.025min-1AUCAUC0100min=278.56 AUC100=C100min/k=18.7 AUC0100min+ AUC100=278.56+18.7297.14g.minAUMCAUMC0100min=9030 AUMC100=t100minC100min/k+C100min/k2= 3141.1 AUMC=AUMC0100min+ AUMC10012171g*min2/mlMRTMRT=AUMC/AUC MRT=1/k40.96min/40minC0C0=Div/VSS=2.5mg/344.65ml7.253l/ml

7、T1/2無(wú)CLDiv/AUC=2.5mg/297.14g.min8.41min-1ml-1VssVSS=Div.AUMC/AUC2=2.5mg*12171.1/297.142344.65ml實(shí)驗(yàn)二：1、肝微粒體的制備方法版本一：獲取肝臟：大鼠禁食不禁水24小時(shí)后取肝臟，組織勻漿：稱重剪成碎塊后加入勻漿液制成勻漿，差速離心：勻漿液49000g離心15min，棄去沉淀和脂肪層取上清液于100000g離心管中離心20min,棄上清，沉淀用pbs輕輕沖洗。重懸沉淀：用10ml勻漿液重懸，凍存管分裝后置-80冰箱內(nèi)保存蛋白定量：BCA法版本二：大鼠拉頸椎處死, 開(kāi)腹取肝臟, 用濾紙吸干水分, 稱質(zhì)量。立

8、即放入冰冷的蔗糖溶液中清洗, 用剪刀剪成碎塊, 反復(fù)清洗至無(wú)血色。加 4 倍肝質(zhì)量的蔗糖溶液, 在冰浴中用組織勻漿機(jī)制成勻漿,再超聲分散 30 s, 4 C下 10 000 r/min -離心20 min。 上清液用四層紗布過(guò)濾除漂浮脂物,濾液在 4 C 下 50 000 r/min 離心 60 min, 棄上清液, 沉淀用焦磷酸鉀緩沖液懸浮均勻, 在 4 C 下50 000 r/min 離心 60 min, 沉淀即為肝微粒體。用Tris HCl 緩沖液懸浮均勻, 體積為原上清液的1/ 4 即可, 分裝于塑料管中, 于- 80 C保存, 采用Lowry 法測(cè)定肝微粒體蛋白濃度 版本三：2、NADPH體系: 葡萄糖- 6- 磷酸(G- 6- P)<10mM> 葡萄糖 6 磷酸脫氫酶(G- 6- P- OH) <1U/mL> -NADP+ <0.5mM> 氯化鎂 5mM3、溫孵實(shí)驗(yàn)步驟： 肝微粒體（0.2mg/mL,80L），非那西丁溶液,37水浴預(yù)溫孵5mi