IgG存化與鑒定

1、實驗二、免疫球蛋白igg的純化與鑒定一、目的學(xué)習(xí)掌握免疫球蛋口 igg的提取、分離；理解離子交換層析的基本原理；并掌握川離 子交換層析分離純化蛋口質(zhì)的方法。二、實驗原理以抗原免疫動物來制備的抗血清是一個非常復(fù)雜的混合物，包括血清的全部成分。但是 同抗原特異性結(jié)合的抗體則主要是血清中的免疫球蛋白組分c通常川于制備酶標抗體或熒光 抗體的免疫球蛋口必須高度純化并具有特異性，不應(yīng)含有非抗體的血清蛋口。因此，為了濃 縮和提髙抗體的效價，或為制備免疫球蛋口特界性抗體吋，通常也需要分離和純化免疫球蛋 白。y球蛋白（igg）是血清免疫球蛋白的主要成分，約占全部免疫球蛋白的75%,因此， 抗體的分離純化主要是分

2、離純化igg。采用硫酸錢沉淀及層析、電泳等方法可提取純化分析 免疫球蛋白iggo鹽析一般是指溶液屮加入無機鹽類而使溶解的物質(zhì)析出的過程。如：加濃（nil） 2so4 使蛋門質(zhì)凝聚的過程。蛋門質(zhì)在水溶液屮的溶解度是由蛋門質(zhì)周用親水基團與水形成水化膜 的程度，以及蛋口質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋口質(zhì)溶液，小性鹽對水 分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同吋，中性鹽加 入蛋白質(zhì)溶液后，市于離了強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解 度降低，使蛋口質(zhì)分子之間聚集而沉淀。蛋白質(zhì)鹽析常川的屮性鹽，主要有硫酸彼、硫酸鎂、 硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉

3、等。其中應(yīng)用最多的硫酸彼，它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度人 （209時飽和溶液為754克/升；0°c時飽和溶解度為706克/升），在這一溶解度范圍內(nèi), 許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸錢分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì) 變性。透析（dialysis）是通過小分子經(jīng)過半透膜擴散到水（或緩沖液）的原理，將小分子與 生物人分了分開的一種分離純化技術(shù)。蛋白質(zhì)是人分了物質(zhì)，不能透過透析膜而小分了物質(zhì) 可以自由透過。層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換匍聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移 動相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素、多糖等的一項技術(shù)。在纖維素與葡聚糖分子上 結(jié)合有一定

4、的離子基團，當結(jié)合陽離子基團時，對換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二 乙氨乙基（dicthylaminoethyl, deae）纖維素。在纖維素上結(jié)合了deae,含有帶正電荷的陽 離子纖維素-o-c6h14n+h,它的反離子為陰離子（如ci-等），可與帶負電荷的蛋口質(zhì)陰離 子進行交換。當結(jié)合陰離子基團吋，可置換陽離子，稱為陽離子交換劑，如竣甲基 （carboxymethy, cm）纖維素。纖維素分子上帶有負電荷的陰離子（纖維素一och2coo 一），其反離子為陽離子（如na+等），可與帶正電荷蛋口質(zhì)陽離子進行交換。溶液的ph值與蛋 白質(zhì)等電點相同時，靜電荷為0,當溶液ph值人于蛋白質(zhì)等電點時

5、，則竣基游離，蛋片質(zhì)帶 負電荷。反z,溶液的ph值小于蛋白質(zhì)等電點時，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的 ph值距蛋白質(zhì)等電點越遠，蛋白質(zhì)的電荷越多。在適當?shù)柠}濃度下，溶液的ph值高于等電 點時，蛋白質(zhì)被陰離了交換劑所吸附；當溶液的ph值低于等電點時，蛋白質(zhì)被陽離了交換 劑所吸附。由于各種蛋口質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液 ph值發(fā)工改變，就會總接影響到蛋口質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋口質(zhì)逐個分 離開來。交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機鹽離子（如naci）都具有交換吸附的能力，當兩者同 時存在于一個層析過程中，則產(chǎn)牛競爭性的交換吸附。當q的濃度大時，蛋白質(zhì)不

6、容易被 吸附，吸附后也易于被洗脫，當ci濃度小時，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。 因此，在離子交換層析屮，一般采用兩種方法達到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的 離子強度，-種是改變洗脫液的ph值。ph值增高時，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之対陽離子 交換劑的吸附力減弱。ph值降低時，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨z降低了蛋白質(zhì)對陰離子交 換劑的吸附。當使用陰離了交換劑時，增加鹽離了，則降低ph值。當使用陽離了交換劑時， 增加鹽離子濃度，則升高溶液ph值。三、實驗試劑和器材1. 抗原免疫動物血清，購丁獸醫(yī)院的商用免疫血清2. 硫酸較飽和溶液硫酸彼800g-850g溶于loooml蒸飾水屮加熱至絕大

7、部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過濾， 置室溫過夜，然后以28%nh40h調(diào)ph至7.0 (不調(diào)ph值也可以)。3. 0.01 mol/l ph7.4磷酸鹽緩沖液4. 0.01 mol/l (含0.05 mol/l氯化鈉)ph7. 4磷酸鹽緩沖液5. l%bac12 溶液6. deae-纖維素(de-52)7.5x蛋白上樣緩沖液(10ml) 4度下保存：lmol/itirs-hci(ph&8)： 0.6ml；10%sds： 2ml50% 甘油：5ml2筑基乙醇：0.5ml1%漠酚蘭：lml水：0.9ml另外：sds不好溶解建議加熱溶解& 5 xtris-glycine buffer (s

8、ds-page 電泳緩沖液)1l：tris 15.lgglycine 94gsds 5.0g加入約800ml去離子水，攪拌溶解，加入去離子水將溶液定容至il9. 考馬斯亮藍染色液配制：稱収1g考馬斯亮藍r-250,置于1l燒杯中。量取250ml 的異丙醇加入上述燒杯屮，攪拌溶解。加入100ml的冰乙醋酸，均勻攪拌。加入650ml 的去離子水，均勻攪拌。用濾紙出去顆粒物質(zhì)后，宗溫保存，可回收利用。組分：0.1% (w/v)考馬斯亮藍r-250, 25% (v/v)異丙醇,10% (v/v)冰醋酸10. 脫色液配制：1l體積：醋酸100ml,乙醇50ml, dh20 850ml ,充分混合后使 用

9、。組份濃度：10% (v/v)酷酸，5% (v/v)乙醇11. 蛋白分離膠與濃縮膠：不同濃度sdspage分離膠的最佳分離范圍isds-pag旳海膠濃度最佳分齋范圍1g£915.926.56.010.07.512.50.30.5uncn0.0240.04£co13.923.28.01337.512.50.30.50.30.589 o53.04.03.85.00.150.2cnlo i o0.012 0.016m&mocmojlnldooln6v<02.74.02.53.80.10.150.10.15oon usolhiojcxicir-j00s om9oiin

10、 ocooiioin ptemed0.004mzm lh mmooiioo1i30%acr-bis(29:l)1.5m tris,ph8.8 10%sds10%過硫帥g o00o cco2卜 ssci叫tto(si sooolavt-ho mocmcmio0 m o o o6 rh rh£-9t卜omooo6&oz f q i 卜 o(nm o oo0.012 (6 卜卜ocm9sool o oo9voocn00lho00cmoo c>g p6 usm081incnolaotooo6 寸m081k©coo9 m o i o c> o9s oovmstrn

11、rsi6tcocm rno in t-h04oi§o ocn o o6 fhin 卜mottogc6o9im omo0io(n m o o o oo* s3r! oo2 cow £to s人 s 人 co rh rhq 職 uj £ 運 o uji15%膠蒸館水1.12.33.44.66.911.530%acr-bis(29:l)2.55.07.510.015.025.01.5m tris,ph8.81.32.53.85.07.512.510%sds0.050.10.150.20.30.510%過硫齣0.050.10.150.20.30.5temed0.0020.

12、0040.0060.0080.0120.02不同濃度sds-page濃縮膠的配制成分成分配制不同體枳sdspage濃縮膠所需各成分的體積（呈升）5%膠2346810蒸懾水1.42.12.74.15.56.830%acr-bis(29:l)0.330.50.671.01.31.7im tris, ph6.80.250.380.50.751.01.2510%sds0.020.030.040.060.080.110%過硫酸彼0.020.030.040.060.080.1temed0.0020.0030.0040.0060.0080.0112. 主要儀器和器材高速冷凍離心機，垂直電泳儀，透析袋，層析管

13、，紫外可見分光光度儀三、操作方法1.粗提取5 ml血清，加生理鹽水5 ml,再逐滴加入（nh4） 2s04飽和溶液10ml, 邊加邊攪拌，充分混合后，此時，即有大量的y球蛋口沉淀（主要為1曲）置 冰箱過夜。冷凍離心（3000r/min, 15min）o再50%飽和度（nh.）2s0.溶液洗滌沉 淀2次。取沉淀加少量生理鹽水溶解，裝入透析袋中，用蒸懈水透析除鹽（4°c 透析24h,中間換液數(shù)次）。透析外液用氯化鎖測硫酸根離子或奈氏試劑測氨離 子（用l%bac12檢查透析液屮的s0“2-或以奈氏試劑檢查nh4+ （取3-4ml透析 液，加試劑12滴，出現(xiàn)磚紅色即認為有nh4+存在）,直至

14、無s042-或nh4+出 現(xiàn)為止。透析后在透析袋內(nèi)冇少量沉淀，可用離心除去，或者用半徑為0. 44m 的濾膜過濾。2.準備deae纖維素（de52）層析柱（1）活化纖維素稱取deae32或52,放入5ml量筒中，加蒸徭水浸泡過夜，觀察溶脹后deae 的體積。根據(jù)所需層析柱的柱床體積計算所需deae的用量，稱取所需deae用蒸 憾水浸泡過夜，其間換兒次水，每次除去細小顆粒。用0.5mol/lnaoh溶液浸泡1h以上，用無離子水漂洗，使ph至8左右（用ph 試紙檢杳）。改用0.5mol/lha溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離了水洗至ph6 左右。再用0.5mol/lnaoh溶液浸泡1h以上，用無

15、離子水漂洗，使ph至中性。用 0.01 mol/lph7.4磷酸鹽緩沖液浸泡平衡1h以上。（2）裝柱將層析柱清洗干凈垂直同定到層析架上，加無離子水進行潤洗，打開下出液 i-i,水流暢通，即可裝柱。輕輕攪動將燒杯中已經(jīng)預(yù)處理的deae-52纖維索溶液，使形成均一的薄膠漿， 并立即沿玻棒倒入層析管內(nèi)，讓加入的deae-52纖維素在柱內(nèi)自然沉降，注意裝 柱的速度要慢，裝柱后，靜置12h以上，靜置過程中封閉出口，以免柱內(nèi)液體流 干，最后形成的纖維素柱床體積為層析柱體積的一半，一定讓柱內(nèi)水而高于纖維 素柱床界面2cm左右。用眼睛觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有否“紋路”或氣泡。如 果柱內(nèi)水位下降超過纖維索的液面

16、，一般都會有干柱的可能，觀察如果層析柱不 均一，必須重新裝柱。（3）平衡在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱屮的溶液用 層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統(tǒng)與柱層析過程中 的系統(tǒng)一致。其方法是：打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-lml/min, 當下出口流出液的ph值與平衡緩沖液的ph值一致吋，層析柱達到了平衡。在木 實驗中，用ph 7.40.01mol/l的i磷酸緩沖液預(yù)先將de52柱進行平衡。一般手動加 平衡液30min左右。3分離、純化igg類取上述粗提的igg蛋白溶液，置0.01 mol/lph7.4磷酸鹽緩沖液中透析平衡, 更換34次平

17、衡液。加入平衡后的的igg®白溶液。用0.01 mol/lph7.4磷酸鹽 緩沖液(1個柱體積)洗出第一蛋白質(zhì)峰，當0.01 mol/lph7.4磷酸鹽緩沖液液 面下降到離柱床界面1-2cm處時，改用0.01 mol/lph7.4磷酸鹽緩沖液一0.05 mol/lm化鈉溶液(23個林體積)洗脫第二蛋白質(zhì)峰。每次洗脫速度為0.2ml/mino 連續(xù)用2mlep管分步收集，測280nm處的吸光度值，給出洗脫曲線一。兩蛋口質(zhì) 峰均為igg,是不同的亞類。上樣量為5mllfil清時，得igg約35mg.分步收集的 樣甜包括，粗提的蛋白液，透析后的蛋白液，加入層析柱后流出的蛋白液，洗脫 過程中

18、流出的蛋白液。洗脫過程中流出的蛋白液在測定吸光度后，取吸光值較大 的蛋白液進行sdspage電泳檢測，每個步驟都收集蛋白液進行檢測時為了觀察 蛋白存化的過程。交換柱的再生：對于用過的deae-52纖維索，可以重復(fù)利用多次，但需要經(jīng) 過再生處理后才可以使用。再生處理可先用高濃度naci(l-2mol/l)過柱沖洗柱 床，以除去deae-52陰離子交換纖維所吸附的成份。然后，再用0.5 mol/l的 hci和naoh處理，處理方法與預(yù)處理完全相同。保存：介質(zhì)保存丁no%的乙醇 中，存放4°c,目的是防止介質(zhì)滋生細菌。4lgg的純度鑒定 sds-page凝膠電泳(1) 裝好電泳板，加入蒸館水，看是否漏水(2) 若不漏水，加入混合好的5 ml 6%分離膠溶液(加入分離膠后，分離膠 液面距膠板頂層3cm左右)，在分離膠上輕輕加入l2cm蒸憎水，放置30min；(3) 分