微生物實(shí)驗(yàn)考試重點(diǎn)

1、實(shí)驗(yàn)一、培養(yǎng)基制備與消毒滅菌一、培養(yǎng)基：滿足微生物生長的營養(yǎng)需要，人工配制的混合營養(yǎng)基質(zhì)。用途：用于微生物的分離、培養(yǎng)、增殖、保藏及鑒定。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于腐生細(xì)菌的培養(yǎng)）馬鈴薯糖培養(yǎng)基（常用于培養(yǎng)真菌）高氏一號培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)放線菌）二、培養(yǎng)基配制原則1）根據(jù)營養(yǎng)不同配制不同培養(yǎng)基；2）注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度及配比；3）調(diào)節(jié)適宜的pH值；4）考慮加生長因子；5）培養(yǎng)基應(yīng)物美價(jià)廉；6）滅菌處理三、培養(yǎng)基分類1、根據(jù)化學(xué)組成分類(1)天然培養(yǎng)基 完全用天然物質(zhì)或其浸出汁配制。成分不確定。如肉汁、豆芽汁、牛乳、土豆汁是天然營養(yǎng)原料。酸奶、飲料酒、腐乳、醬類的發(fā)酵生產(chǎn)。優(yōu)點(diǎn)：配制方便，成本較低

2、，營養(yǎng)豐富。生產(chǎn)上用缺點(diǎn)：成分不確定。（2）合成培養(yǎng)基 全由化學(xué)成分已知的物質(zhì)配制的培養(yǎng)基。成分確定。如：高氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)：成分確定，重復(fù)性強(qiáng)，宜于科學(xué)研究 如菌種選育，遺傳分析。實(shí)驗(yàn)室用。缺點(diǎn)：費(fèi)用較高。（3）半合成培養(yǎng)基 由部分天然物質(zhì)和一些成份已知的化學(xué)藥品配制而成。如：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分更全面、均衡 實(shí)驗(yàn)室、發(fā)酵業(yè)用得最多。2、根據(jù)物理狀態(tài)分類（1）固體培養(yǎng)基概念：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂、明膠、硅膠等。常用的是瓊脂（洋菜）。瓊脂加入量1.52.0。瓊脂的特性：1、成分為多縮半乳糖2、絕大多數(shù)微生物不能利用3、融化溫度96 ，凝固溫度45 4、對微生物

3、無毒性 固體培養(yǎng)基作用：培養(yǎng)菌落進(jìn)行分離、鑒定、計(jì)數(shù)、保藏（2）半固體培養(yǎng)基加入凝固劑。瓊脂加入量0.20.5%作用：觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)狀況。（3）液體培養(yǎng)基不加凝固劑 用于發(fā)酵業(yè)。液體培養(yǎng)。3、按用途差異分類（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基 概念：含有微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)。用于普通微生物培養(yǎng)。細(xì)菌通用培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。真菌通用培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。（2）加富培養(yǎng)基在普通培養(yǎng)基中加入某些特殊物質(zhì)或某些生長素，只適于一種或一類微生物的生長。特點(diǎn)：某種微生物富集逐漸淘汰其它各種微生物。（3）選擇培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)微生物的生理特性配制?？纱龠M(jìn)某種微生物生長，抑制某類微生物生長。如：加青霉素的培養(yǎng)基，分

4、離霉菌和酵母菌。 加1%酚分離放線菌 （4）鑒別培養(yǎng)基概念：用以區(qū)別不同微生物種類的培養(yǎng)基。特點(diǎn)：確保所培養(yǎng)的微生物有豐富的營養(yǎng)條件。 顯示微生物的某些形態(tài)構(gòu)造或生理代謝上的特點(diǎn)。如：伊紅美蘭培養(yǎng)基區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。（5）活體培養(yǎng)基用某些活的動(dòng)植物體或離體的生活組織細(xì)胞作培養(yǎng)基。 病毒培養(yǎng)。四、滅菌消毒：應(yīng)用理化方法殺滅部分微生物（主要是病原微生物）。滅菌：應(yīng)用理化方法殺滅物體上所有微生物。一）、加熱高溫滅菌 1.干熱滅菌 火焰燒灼滅菌 熱空氣滅菌2.濕熱滅菌 常壓蒸汽滅菌 高壓蒸汽滅菌 煮沸法滅菌 超高溫滅菌二）、紫外線滅菌三）、過濾滅菌四）、化學(xué)藥劑的消毒與滅菌1.高溫滅菌：利用高

5、溫使菌體蛋白和核酸變性而失去活力以達(dá)到殺菌的目的。2.紫外線滅菌：誘發(fā)菌體核酸結(jié)構(gòu)變異，及使空氣中氧電離、水氧化而產(chǎn)生殺菌化學(xué)物質(zhì)以殺滅雜菌。3.過濾除菌：將處理的含菌液體或氣體通過細(xì)菌過濾器，使雜菌被機(jī)械截留從而達(dá)到除菌。4.化學(xué)藥劑的消毒和滅菌：殺菌劑（破壞微生物的代謝機(jī)能并有致死作用）；消毒劑；防腐劑（抑制微生物的生長繁殖）。干燥熱空氣箱滅菌 用法：160-170,2小時(shí)（利用熱空氣滅菌 ) 特點(diǎn)：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死。所以溫度高、時(shí)間長。高壓蒸汽滅菌法:利用水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，提高溫度以達(dá)到高溫滅菌目的方法。 a 方法： 一般121（1kg/cm

6、2或15磅/英寸2） 20min-30min。b 適用：耐高溫物品如培養(yǎng)基，無菌水，培養(yǎng)皿。 c 注意事項(xiàng)： 滅菌開始排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓； 滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。干熱滅菌的操作n 包扎。n 裝箱（物品不可與滅菌箱內(nèi)壁接觸，且不可擺放過擠）n 滅菌（啟動(dòng)開關(guān)，并打開排氣孔，待溫度升至80-100關(guān)閉排氣孔，繼續(xù)升溫至160-170 計(jì)時(shí)，恒溫2小時(shí)）n 降溫，取物（關(guān)閉電源，自然降溫到60度開箱取物）高壓蒸汽滅菌的操作n 滅菌前準(zhǔn)備（在鍋內(nèi)加適量水）。n 裝放物品（不要過擠，且容器口端不要與物品接觸）n 加熱放氣（打開放氣閥，待有大量水汽排出，維持35分鐘，鍋內(nèi)空氣排盡，關(guān)上放氣閥

7、）n 升溫保壓（溫度，壓力升至滅菌所需時(shí)計(jì)時(shí)，壓力1.05Kg/cm2,121.3 ，2030分鐘）n 出鍋（關(guān)閉電源，待指針回零，打開放氣閥，稍等一些時(shí)間，再取物） 濕熱滅菌較干熱滅菌效果好1) 特點(diǎn)：溫度低、時(shí)間短、滅菌效果好。2) 滅菌效果好的原因： k 菌體內(nèi)含水量越高凝固溫度越低。 k 蒸汽冷凝會(huì)放出潛熱。 k 飽和水蒸汽穿透力強(qiáng)。 3、高壓蒸汽滅菌（1） 滅菌前的準(zhǔn)備：將高壓蒸汽滅菌鍋的內(nèi)桶取出，向外鍋內(nèi) 加入適量的水，將內(nèi)桶放入。（2） 裝放待滅菌物品：將已包扎好的物品放入內(nèi)桶。蓋上鍋蓋，以兩兩對稱方式同時(shí)旋緊螺栓，勿使漏氣。（3） 加熱排氣：接通熱

8、源，同時(shí)打開排氣閥，待見有大量水汽排出時(shí)，維持3-5min，鍋內(nèi)空氣排盡，關(guān)上排氣閥。（4） 升溫保壓： 壓力為1.05kg/cm2（121.3）,20-30min（5） 出鍋：隔斷熱源，自然降溫，待壓力表指針回到零，打開排氣閥，稍等一些時(shí)間，再開蓋取物。實(shí)驗(yàn)二 油鏡的使用及細(xì)菌 基本形態(tài)觀察一、油鏡比低倍鏡、高倍鏡觀察物體更清晰。原因：1） 油鏡分辨率高于低倍鏡、高倍鏡2） 油鏡匯聚光線的能力大于低倍鏡、高倍鏡 分辨率是指顯微鏡能夠分辨的最小距離即鑒別限度（R） R=（2NA） (為入射光波波長； NA為顯微鏡數(shù)值孔徑)為標(biāo)本、物鏡之間介質(zhì)的折射率。為光軸上物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡有效

9、直徑兩端最大夾角角度的一半。 二、染色莢膜染色: 主要成分多為糖類，無色透明且不易著色常用負(fù)染色觀察。負(fù)染色是將細(xì)菌細(xì)胞和背景著色，從而把無色透明、不著色的莢膜結(jié)構(gòu)襯托顯現(xiàn)出來。芽孢染色:細(xì)菌芽孢壁厚而致密，透性低，難于染色，但一旦被染色又難于脫色。因此先用強(qiáng)著色力的染料（孔雀綠）處理，并同時(shí)加熱，使菌體以及芽孢均著色，后使菌體脫色，而芽孢保留原色，經(jīng)復(fù)染（蕃紅），菌體與芽孢分別以不同顏色顯現(xiàn)。三、油鏡使用主要步驟觀察前準(zhǔn)備 ：顯微鏡的準(zhǔn)備和調(diào)試視野明亮低倍鏡觀察高倍鏡觀察（此步可以省略）油鏡觀察：加香柏油，油鏡頭浸入香柏油中后調(diào)焦顯微鏡油鏡頭的清洗和歸位（二甲苯清洗）實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的簡單染色和

10、革蘭氏染色一、簡單染色的原理1、 細(xì)菌細(xì)胞微小，且含水量較多，在普通光鏡下表現(xiàn)為無色透明，不易觀察，所以必須進(jìn)行染色處理，使細(xì)胞著色，便于觀察。2、 簡單染色是使用單一染料染色，可用于觀察細(xì)菌形態(tài)、大小、及排列方式。3、 染色前一般要將細(xì)胞固定，其目的是殺死菌體并使之粘附于玻片上，還可以增強(qiáng)菌體的著色能力。固定有加熱法和化學(xué)法兩種，無論采用何種方法均應(yīng)維持細(xì)胞原有形態(tài)。 簡單染色操作步驟1涂片：載玻片、無菌水、斜面菌種、無菌操作、均勻的薄層2干燥：3固定：加熱固定4染色： 結(jié)晶紫染1min，或石炭酸復(fù)紅染1min。5水洗：6 干燥：7鏡檢：低倍鏡觀察以確定目標(biāo)和范圍，再換用油鏡觀察繪圖。 二、

11、革蘭氏染色原理革蘭氏染色是用于細(xì)菌鑒別的一種重要染色方法。它是根據(jù)革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成的不同而使用一系列的染色處理使之差別顯色。其染色方法是先將細(xì)菌分別用結(jié)晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染。最終被染成紅色的是革蘭氏陰性細(xì)菌；被染成紫色的是革蘭氏陽性細(xì)菌。第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁 阻留在細(xì)胞內(nèi)。第三步：酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)。 G+ 菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。 G- 菌

12、：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無色，蕃紅復(fù)染后呈紅色。操作步驟1涂片：方法同單染色，然后干燥、固定。2初染：滴加結(jié)晶紫染色1min，后用水沖洗。3媒染：滴加碘液染色1-2min，后用水沖洗，甩盡殘余水4脫色：用95%乙醇沖洗30秒（需要嚴(yán)格控制時(shí)間和濃度），然后立即用水沖洗。5復(fù)染：用石炭酸復(fù)紅覆蓋涂片進(jìn)行復(fù)染，石炭酸復(fù)紅染1min。水洗，晾干。6鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用油鏡觀察。注意事項(xiàng)：1、 選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細(xì)菌會(huì)被染成紅色而造成假陰性。2、 涂片不宜過厚，以

13、免脫色不完全造成假陽性。3、 脫色是革蘭氏染色是否成功的關(guān)鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。關(guān)鍵步驟：酒精脫色實(shí)驗(yàn)四 放線菌、真菌形態(tài)觀察及各類微生物菌落特征觀察區(qū)分和識(shí)別各類微生物可從菌落形態(tài)（群體形態(tài)）和細(xì)胞形態(tài)（個(gè)體形態(tài)）兩方面進(jìn)行，菌落形態(tài)是無數(shù)細(xì)胞形態(tài)的集中反映，因此，每一大類微生物都有其一定的菌落特征，可通過這些特征差異區(qū)分和識(shí)別之。特征描述：形狀、大小、顏色、邊緣、隆起、光澤、質(zhì)地等。細(xì)菌菌落特征：凝膠狀、表面較光滑濕潤、與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，易挑取，正反顏色一致。放線菌特征：致密堅(jiān)硬、多皺、不易用針挑起，不透明。孢子成熟后，表面粉末狀，干燥。酵母菌菌落特征：與細(xì)菌相似比

14、細(xì)菌大而厚，不透明，表面光滑、濕潤、粘稠，易用針挑起。多呈乳白色。霉菌的菌落特征：比細(xì)菌菌落大，由菌絲組成疏松的絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，有的無固定大小，延至整個(gè)培養(yǎng)基中，產(chǎn)色素，使菌落顯色。1、印片法操作步驟:1 用撥針將平板上的菌落培養(yǎng)基切割成小方塊，并用撥針挑起一塊菌落培養(yǎng)基（注意無菌操作），用火焰微加熱的潔凈載玻片，以生長的菌落面朝向載玻片，在載玻片上不同部位印壓。2 將印片加熱固定。3 用蕃紅染色2-3min，水洗風(fēng)干。4 鏡檢：先用低倍鏡觀察，后換用油鏡觀察氣生菌絲、孢子絲孢子等結(jié)構(gòu)。注意事項(xiàng)：用力要輕，且不要錯(cuò)動(dòng)，染色水洗時(shí)水流要緩，以免破壞孢子絲形態(tài)。2、水浸片法操作步驟：（1）

15、在載玻片上滴加一滴碘液，用接種環(huán)以無菌操作方式挑取少許啤酒酵母，在碘液中充分混勻，蓋上蓋玻片。（2）鏡檢：先低倍鏡觀察，后換用高倍鏡觀察細(xì)胞形態(tài)注意事項(xiàng)：1、 用接種環(huán)將菌體與染液混合時(shí)不要?jiǎng)×彝磕?，以免破壞?xì)胞。2、 滴加染液要適中，否則用蓋玻片覆蓋時(shí)，染液過多會(huì)溢出，過少會(huì)產(chǎn)生大量氣泡。3、 蓋玻片要緩慢傾斜覆蓋，以免產(chǎn)生氣泡。實(shí)驗(yàn)五 微生物細(xì)胞大小的測定及顯微鏡下直接計(jì)數(shù)一、鏡臺(tái)測微尺及目鏡測微尺 測定微生物細(xì)胞大小是在顯微鏡下利用測微尺進(jìn)行。測微尺可分為目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。目鏡測微尺是特制的圓形玻片，中央有一刻度尺（100等分），可放入目鏡鏡筒內(nèi)，用于測定細(xì)胞大小。鏡臺(tái)測微尺為一載

16、玻片，上貼有圓形蓋片，中央有總長度為1mm(100等分)，每小格長0.01mm (10um) 。目鏡測微尺每小格大小隨顯微鏡放大倍數(shù)不同而改變，使用目鏡測微尺進(jìn)行測量之前必須用鏡臺(tái)測微尺標(biāo)定，以求出在某一放大倍數(shù)下目鏡測微尺每小格所代表的長度，然后用標(biāo)定好的目鏡測微尺進(jìn)行測量。 1、放置目尺：取出目鏡，旋開接目鏡，將目尺放在目鏡鏡筒的中間隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目鏡，并插入鏡筒。2、放置臺(tái)尺：將臺(tái)尺放置于顯微鏡的載物臺(tái)上，使刻度面朝上。3、標(biāo)定目尺：先用低倍鏡觀察，找到臺(tái)尺刻度，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目尺與臺(tái)尺的刻度軸線相平行，移動(dòng)臺(tái)尺使目尺與臺(tái)尺某一區(qū)間的兩對刻度線完全重合，然后計(jì)數(shù)出兩重合線

17、間各自所占格數(shù)，通過如下公式計(jì)算：目尺每小格長度（um）= 兩對重合刻度線之間臺(tái)尺所占格數(shù)×10 兩對重合刻度線之間目尺所占格數(shù) 菌類大小表示方法：（微米）細(xì)菌：球菌：測直徑 如：0、52、0um 桿菌和螺旋菌：測寬和長 如：寬*長（um） 0、5*1、02、0（um）放線菌：測分支管狀的直徑 如：0、5um二、血球計(jì)數(shù)板利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是將菌懸液放入血球計(jì)數(shù)板與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，因?yàn)橛?jì)數(shù)室容積一定，所以可根據(jù)測定值推算出菌懸液單位體積所含微生物的總數(shù)量它是特制的厚載玻片，中央?yún)^(qū)域有四條凹槽而形成三個(gè)平臺(tái)，中間平臺(tái)較寬，它又被一短橫槽分隔為兩

18、部分，每一部分均有一個(gè)方格網(wǎng)。中間平臺(tái)比兩邊平臺(tái)低0.1mm。每一方格網(wǎng)可分為九個(gè)大方格，中央大方格就是計(jì)數(shù)室。大方格分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又可分為16個(gè)小方格。每個(gè)大方格共含有400個(gè)小方格。計(jì)數(shù)室大方格邊長為1mm，底面積為1mm2，高0.1mm,所以每個(gè)計(jì)數(shù)室固定容積為0.1mm3。 計(jì)數(shù)室每個(gè)小方格容積為： 0.1×10-3÷400（14）×106(ml)計(jì)算公式：每ml菌液含菌數(shù) = N ×K ×d N：每個(gè)小方格含菌數(shù)平均值；d：菌液稀釋倍數(shù)；K = 4×106 三、實(shí)驗(yàn)方法步驟1 鏡檢計(jì)數(shù)室：對計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若內(nèi)

19、有污物，清洗后才能計(jì) 數(shù)。2 加樣液：先在血球計(jì)數(shù)板兩個(gè)計(jì)數(shù)室部位加蓋玻片，再用無菌 玻棒或滴管沾取待測菌懸液稀釋液（已搖勻），從蓋玻片邊緣 滴加，使菌液沿縫隙靠毛細(xì)作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室內(nèi)。靜置5min。3 顯微鏡計(jì)數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板置于載物臺(tái)上，先用低倍鏡觀察，后 換高倍鏡觀察計(jì)數(shù)。位于格線上菌體只計(jì)上邊線和左邊線上的， 如果出芽酵母芽體大小達(dá)到母細(xì)胞一半時(shí)，可計(jì)作兩個(gè)菌體。選 擇五個(gè)視野，在每個(gè)視野內(nèi)任意選擇五個(gè)小方格計(jì)數(shù)，求出小方 格菌體數(shù)量平均值。4 根據(jù)公式計(jì)算每ml菌液含菌數(shù)。5 測量完畢后，取下蓋玻片用水沖洗血球計(jì)數(shù)板（嚴(yán)禁用硬物刷 洗），晾干，放入盒內(nèi)保存。注意事項(xiàng)（1）取待測稀釋

20、菌懸液向血球計(jì)數(shù)板加樣前，須將菌懸液充分搖勻。（2）加樣過程中，應(yīng)避免將菌液滴在蓋玻片上。（3）由于菌體在計(jì)數(shù)室中處于不同空間位置，須在不同焦距下才能觀察到，故觀察時(shí)須不斷調(diào)節(jié)微調(diào)，計(jì)數(shù)菌液中全部菌體，盡量避免遺漏。 實(shí)驗(yàn)六 環(huán)境因素對微生物生長的影響 紫外線對微生物有誘發(fā)突變和致死作用，因紫外線照射劑量不同而異，低劑量用于微生物誘變育種，高劑量用于實(shí)驗(yàn)室或工作間消毒殺菌。紫外線照射劑量與照射光強(qiáng)、距離以及照射時(shí)間相關(guān)。 某些化學(xué)藥劑（消毒劑）抑制或殺滅微生物，其效應(yīng)強(qiáng)弱與試劑類型、濃度、作用時(shí)間以及作用對象有關(guān) ，有些藥劑在濃度極低的情況下仍然有較強(qiáng)的作用。微生物之間存在拮抗。微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物如青霉素等抗生素可以選擇性抑制或殺死其他微生物。不同微生物的抗菌譜不同。青霉素僅對革蘭氏陽性菌起作用。實(shí)驗(yàn)七 土壤微生物分離純化及測數(shù) 實(shí)驗(yàn)八 微生物生理生化特性檢測一、 糖發(fā)酵的原理 不同細(xì)菌對糖的分解利用能力存在較大差異，且產(chǎn)物不同，是常用的鑒別微生物的生化方法。有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸和氣體；有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。若產(chǎn)酸，