血液系統(tǒng)疾病常見(jiàn)動(dòng)物模型

1、；血液系統(tǒng)疾病常見(jiàn)動(dòng)物模型造血系統(tǒng)疾?。―isease of hematopoietic system），除了地中海貧血等少數(shù)疾病具有明確的病因以外，再盛贊該性貧血等大多數(shù)疾病都還沒(méi)有明確的病因，造血系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型，就成為研究造血系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理、探索新型治療技術(shù)和新藥研究的基本工具。一、缺鐵性貧血?jiǎng)游锬Ｐ腿辫F性貧血（iron deficiency anemia，IDA）是體內(nèi)用來(lái)合成血紅蛋白（HGB）的貯存鐵缺乏，HGB合成減少而導(dǎo)致的小細(xì)胞低色素性貧血，主要發(fā)生于以下情況：（1）鐵需求增加而攝入不足，見(jiàn)于飲食中缺鐵的嬰幼兒、青少年、孕婦和哺乳期婦女。（2）鐵吸收不良，見(jiàn)于胃酸缺乏、小

2、腸粘膜病變、腸道功能紊亂、胃空腸吻合術(shù)后以及服用抗酸和H2受體及抗劑等藥物等情況。（3）鐵丟失過(guò)多，見(jiàn)于反復(fù)多次小量失血，如鉤蟲(chóng)病、月經(jīng)量過(guò)多等。IDA是一種多發(fā)性疾病，據(jù)報(bào)道，在多數(shù)發(fā)展中國(guó)家，約2/3的兒童和育齡婦女缺鐵，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的預(yù)防和治療具有重要的意義。在這些研究中，缺鐵性貧血的動(dòng)物模型（Animal model of IDA），又是實(shí)施研究的基礎(chǔ)工具。常見(jiàn)的IDA動(dòng)物模型的構(gòu)建技術(shù)如下：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：一般選用SD大鼠，4周齡，雌雄不拘，體重65g左右，HGB130g/L。建模方法：低鐵飼料加多次少量放血法。低鐵飼料一般參照AOAC配方配制，采用EDTA浸泡處理

3、以去除飼料中的鐵，飼料中的含鐵量是誘導(dǎo)SD大鼠形成缺鐵性貧血模型的關(guān)鍵，現(xiàn)有研究表明，飼喂含鐵量<15.63mg/Kg的飼料35天，SD大鼠出現(xiàn)典型IDA表現(xiàn)，而飼喂含鐵40.30mg/Kg的飼料SD大鼠出現(xiàn)缺鐵，但并不表現(xiàn)貧血癥狀。建模時(shí)一般采用去離子水作為動(dòng)物飲水，以排除飲水中鐵離子的影響。少量多次放血主要用于模擬反復(fù)多次小量失血導(dǎo)致的鐵丟失，還可以加速貧血的形成。放血一般在低鐵飼料飼喂2周后進(jìn)行，常用尾靜脈放血法，11.5ml/次，2次/周。模型指標(biāo)：（1）HGB100g/L；（2）血象：紅細(xì)胞體積較正常紅細(xì)胞偏小，大小不一，中心淡染區(qū)擴(kuò)大，MCV減小、MCHC降低；（3）血清鐵（

4、SI）降低，常小于10mol/L，血清總鐵結(jié)合力（TIBC）增高，常大于60mol/L。需要指出的是，以上模型不能用于鐵吸收不良相關(guān)IDA的防治研究。根據(jù)具體的研究需要，也可以適當(dāng)調(diào)整建模方法。二、再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ驮偕系K性貧血（aplastic anemia），簡(jiǎn)稱再障，系多種病因引起的造血系統(tǒng)退行性變，紅骨髓總?cè)萘坎粩鄿p少，黃骨髓不斷增加，造血衰竭，以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的一組綜合征。再障的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前存在四種假說(shuō)：（1）“種子”學(xué)說(shuō)，有證據(jù)表明，再障與患者造血干細(xì)胞存在某種內(nèi)在缺陷有關(guān)。（2）“土壤”學(xué)說(shuō)，有證據(jù)表明，再障與患者的造血微環(huán)境存在某種缺陷，對(duì)造血支持不

5、良有關(guān)。（3）“蟲(chóng)子”學(xué)說(shuō)，有證據(jù)表明，免疫反應(yīng)、藥物、病毒損傷造血干細(xì)胞可致再障發(fā)生。（4）“遺傳”學(xué)說(shuō)，有證據(jù)表明再障具有遺傳易感性。目前，再障的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療都是有待深入研究的課題，這些研究都需要大量的動(dòng)物模型。目前已報(bào)道的再障動(dòng)物模型構(gòu)建技術(shù)有：（一） 化學(xué)方法建模1.腺嘌呤致大鼠腎性貧血模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雌雄不拘。建模方法：腺嘌呤腎毒性建模法，由腎臟分泌的粗紅細(xì)胞生成素（EPO）是紅系、巨核系分化、成熟所必需的細(xì)胞因子，腺嘌呤可導(dǎo)致腎臟病變，使EPO分泌不足，進(jìn)而導(dǎo)致紅系和巨核系造血障礙。王威等于1999年報(bào)道，利用飼喂含腺嘌呤0.75%，投飼量300mg/(kg.d)，

6、連續(xù)喂養(yǎng)7周，獲得腎衰竭貧血模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物紅細(xì)胞、血紅蛋白及紅細(xì)胞壓積等主要紅系指標(biāo)均、血小板均顯著下降。用途：可作為腎性貧血的發(fā)病機(jī)制研究、疾病進(jìn)展研究和治療藥物篩選的動(dòng)物模型。2.馬利蘭致骨髓抑制的再障模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠、SD大鼠、家兔，雌雄不拘。建模方法：利用馬利蘭的骨髓選擇性抑制作用，一次性超致死劑量給藥或者多次小劑量給藥，均可導(dǎo)致造血干細(xì)胞、骨髓微環(huán)境的抑制，形成再障。（1）口服給藥，15mg/kg/周或30mg/kg/周，總給藥劑量達(dá)到118-153mg/kg時(shí)，可致家兔的再障，出現(xiàn)全血細(xì)胞減少、淋巴細(xì)胞比值增加、骨髓黃化和骨髓纖維化。（2）一次性給藥，35mg/kg腹腔注射，可致

7、大鼠再障。（3）口服給藥，18mg/kg/天，連續(xù)給藥10天，可致NIH小鼠再障，出現(xiàn)血細(xì)胞減少和骨髓有核細(xì)胞降低，建模穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率高。3.苯致骨髓抑制的再障模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：CD1小鼠、家兔。建模方法：苯類化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，在骨髓富集（可達(dá)血清濃度的20倍），對(duì)骨髓有較強(qiáng)的抑制作用，可導(dǎo)致再障。（1）皮下注射給藥，苯與玉米油1:1混合物，4.0ml/kg，3次/周，共給藥25次，可致CD1小鼠再障，表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少、骨髓黃化、脂肪細(xì)胞等非造血細(xì)胞數(shù)目增多，骨髓間質(zhì)血竇充血、出血伴水腫。（2）皮下注射給藥，純苯，0.5-1.0ml/kg/天，3次/周，連續(xù)給藥2周以上，可致全血細(xì)胞

8、減少、造血細(xì)胞減少。（二） 物理方法建模1.外部照射建模法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，雌雄不拘。建模方法：射線等高能射線可穿透機(jī)體，起DNA 損傷，干擾DNA復(fù)制，阻斷有絲分裂，對(duì)造血干細(xì)胞等分裂增值活躍的細(xì)胞有強(qiáng)抑制作用。使用鈷60等放射性同位素，亞致死劑量（6.0Gy）輻照以后，可致小鼠全血再障，維持時(shí)間較長(zhǎng)，但輻照的劑量不好控制，稍大易致小鼠死亡，稍低則個(gè)別小鼠不易達(dá)到造血抑制效果。2.內(nèi)部照射建模法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠，雌雄不拘。建模方法：放射性同位素153Sm（釤）、89Sr（鍶）、32P（32磷）、186Re(186錸)、188Re(188錸)、105Rh（105銠）、177LU（177镥）和60C

9、o（60鈷），能產(chǎn)生射線及親骨性特點(diǎn)，進(jìn)入人體后對(duì)造血組織進(jìn)行內(nèi)照射。將氯化鍶，按每克體重6.4或2 Ci腹腔注射給予1112周齡的小鼠，6Ci組動(dòng)物于35d后全部死亡2Ci組動(dòng)物全部存活。6Ci組的小鼠于21d后股骨骨髓顯示為脂肪髓。全血細(xì)胞減少，骨髓有核細(xì)胞數(shù)和CFU-S產(chǎn)率都減少。應(yīng)用32P給小鼠一次靜脈注射1.4mCi/kg體重也可導(dǎo)致再障。三、溶血性貧血?jiǎng)游锬Ｐ腿苎载氀?hemolytic anemia,HA)是一種常見(jiàn)的貧血類型，是指由于某種原因使紅細(xì)胞存活期縮短，破壞增加，超過(guò)了骨髓代償能力所引起的一類貧血，是常見(jiàn)的造血系統(tǒng)疾病?！驹炷C(jī)制】動(dòng)物注射一定量的乙酰苯肼(acety

10、lphenylhydrazine,APH)，APH是一種強(qiáng)氧化劑，能特異性地對(duì)紅細(xì)胞起緩慢而進(jìn)行性地氧化損傷作用，尤其是干擾紅細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，促進(jìn)血紅蛋白變性而形成海氏小體，也可直接破壞紅細(xì)胞的膜蛋白和脂類，使膜溶解破裂，紅細(xì)胞崩解，造成溶血性貧血?！驹炷７椒ā?小鼠第1、4、7天皮下注射APH生理鹽水溶液0.2g/kg、0.1g/kg、0.2g/kg，第9天造模成功，其他給藥方法也可以造成此模型。2大鼠  第1、4天皮下注射APH生理鹽水溶液0.16g/kg、0.08g/kg，第8天造模成功；或兩次劑量均為0.2g/kg，第10天造模成功。3家兔  以2A

11、PH生理鹽水溶液給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或肌內(nèi)注射23次，劑量為0.1g/kg，即可建立溶血性貧血模型。觀察指標(biāo)：一般生長(zhǎng)狀態(tài)觀測(cè)，包括一般行為、毛發(fā)、出血點(diǎn)及死亡情況；外周血常規(guī)參數(shù)測(cè)定，如血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)和血紅蛋白含量；血細(xì)胞化學(xué)指標(biāo)變化，如中性粒細(xì)胞的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、三磷腺苷酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，海氏小體，骨髓象檢查等指標(biāo)?！灸Ｐ吞攸c(diǎn)】注射APH后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物陸續(xù)出現(xiàn)活動(dòng)減少、毛發(fā)暗淡無(wú)光澤、攝食減少、體重下降、疲乏無(wú)力、嗜睡、皮膚蒼白等現(xiàn)象。外周血血紅蛋白和紅細(xì)胞進(jìn)行性下降；網(wǎng)織紅細(xì)胞、海氏小體和白細(xì)胞總數(shù)則顯著增多。中性粒細(xì)胞的堿性

12、磷酸酶、酸性磷酸酶、三磷腺苷酸酶、琥珀酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸酶，骨髓均有不同程度異常變化?！灸Ｐ驮u(píng)估和應(yīng)用】用注射強(qiáng)氧化劑APH的方法可制作出符合臨床特征的溶血性貧血?jiǎng)游锬Ｐ停珹PH用量可通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，上述劑量可供參考。本方法建模周期短，操作簡(jiǎn)便，模型動(dòng)物癥狀和外周血象、血細(xì)胞的生化學(xué)變化與人類溶血性貧血基本相似，為研究實(shí)驗(yàn)性溶血性貧血提供了一種簡(jiǎn)易模型。四、白細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型人類白細(xì)胞減少癥是臨床上常見(jiàn)的病癥。為了研究該病癥的發(fā)病規(guī)律和篩選有效的升高白細(xì)胞的藥物，可用環(huán)磷酰胺、馬利蘭等化學(xué)物質(zhì)，過(guò)量x射線、射線輻射損傷，細(xì)菌、真菌感染和遺傳因素來(lái)建立白細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型。1. 環(huán)磷酸

13、胺誘發(fā)的白細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型(animaln model of cyclophosphamide induced lenkocytopenia) 【造模機(jī)理】環(huán)磷酰胺是抗癌藥，是實(shí)驗(yàn)常用的烷化毒，能使脫氧核糖核酸變性、核分裂停頓，造成白細(xì)胞生成減少?！驹炷７椒ā恳孕∈笞鳛閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，按每公斤體重腹腔注射或皮下注射環(huán)磷酰胺5070 mg。用生理鹽水配成2 mg/m1的環(huán)磷酰胺溶液。每只小鼠注射0.5 mL，即可成功地復(fù)制白細(xì)胞減少癥動(dòng)物模型，按同樣方法亦可復(fù)制白細(xì)胞減少癥的大鼠模型。2食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥貓模型(cat model of alimentary toxic aleucia)【造

14、模機(jī)理】ATA是由于人食用真菌污染的食物引起致死的真菌中毒。人的ATA表現(xiàn)為白細(xì)胞進(jìn)行性減少、貧血、壞死性咽峽炎、發(fā)熱、出血及膿毒血癥。【造模方法】1981年，Lutsky等用倍半萜(Sesquiterpene)T-2毒素(從鐮刀菌屬的類分支孢菌中分離出來(lái)的單端孢菌素)膠囊，每48 h給健康貓口服0.08 mg/kg體重，直至發(fā)病建立了食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥的貓模型。初期伴有輕度白細(xì)胞增多，隨后是嚴(yán)重的進(jìn)行性白細(xì)胞減少。伴有全身軟弱無(wú)力，便血、后腿共濟(jì)失調(diào)、嘔吐、厭食、脫水、體重減輕?！灸Ｐ蛻?yīng)用】貓是一種較大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可用來(lái)充分評(píng)價(jià)食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥的藥理學(xué)、病理學(xué)、血液學(xué)、生物化學(xué)、免

15、疫學(xué)及臨床方面的問(wèn)題。但是，小鼠、大鼠、脈鼠、免、犬、豬、綿羊、家禽、牛、馬等均不能建立ATA的動(dòng)物模型。3周期性粒細(xì)胞減少癥犬模型(dog model of cyclic neutropenia) 【造模機(jī)理】人類周期性粒細(xì)胞減少患者，病程遷延多年，周期有規(guī)律。常隔21 d(1425d)發(fā)作一次，每次持續(xù)約1周。發(fā)作時(shí)有全身不適、頭痛、感染、發(fā)熱。嬰兒患者病死率高。【造模方法】 犬的周期性粒細(xì)胞減少是一種遺傳性疾病，為常染色體隱性遺傳。骨髓造血細(xì)胞用期性成熟受阻，僅見(jiàn)于大牧羊犬出于具有淡灰色皮毛，又稱為灰牧羊犬，中性粒細(xì)胞減少與其淡灰色皮毛緊密連鎖，該犬一直作為周期性粒細(xì)胞減少癥的動(dòng)物模型。

16、這種犬的紅細(xì)胞與粒細(xì)胞成熟同時(shí)受阻，由于周圍血紅細(xì)胞壽命長(zhǎng)，其成熟中斷期相對(duì)較短，因此，不表現(xiàn)紅細(xì)胞的減少：犬的中性粒細(xì)胞平均壽命僅10 h，當(dāng)骨髓粒系造血細(xì)胞成熟中斷時(shí)，骨髓儲(chǔ)存的粒細(xì)胞迅速釋放入血而耗盡。隨后粒細(xì)胞嚴(yán)重減少(0100)×105L。每隔913d發(fā)作一次，每次持續(xù)25d。伴嚴(yán)重感染，待粒細(xì)胞恢復(fù)后13d內(nèi)感染消失。多數(shù)病犬壽命僅12歲，尸體解剖可見(jiàn)內(nèi)臟與淋巴組織中有淀粉樣物質(zhì)沉積?；既Y狀與人相似，但并發(fā)癥更多、更嚴(yán)重，死亡更早。4. 60Co-射線輻射建立小鼠白細(xì)胞減少癥模型【造模機(jī)理】人類在自然條件下受到天然和輻射的影響常引發(fā)白細(xì)胞減少等病理現(xiàn)象,在臨床上放療也是

17、治療腫瘤的主要方法之一,但放療的主要副反應(yīng)為骨髓抑制，從而導(dǎo)致外周血白細(xì)胞下降?！驹炷７椒ā啃∈?2 只，雌雄各半，分為4 組：ICR 小鼠雌性組、ICR 小鼠雄性組、C57BLP6J 小鼠雌性組和C57BLP6J 小鼠雄性組,每組8 只。自眼眶靜脈叢取全血20L，測(cè)定正常小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)后, 采用60Co-射線一次性全身照射小鼠, 源皮距為1.5 m，照射劑量為5 Gy，照射后第3 d 測(cè)定外周血白細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果顯示無(wú)論雄性還是雌性ICR 小鼠的正常白細(xì)胞數(shù)量均極顯著低于C57BLP6J 小鼠。我們還探討了輻射對(duì)于不同性別不同的影響，結(jié)果表明雄性C57BLP6J 在照射后第3 d白細(xì)胞數(shù)

18、量顯著高于其雌性小鼠, 提示雄性C57BLP6J 小鼠耐輻射能力可能強(qiáng)于雌鼠。通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察小鼠照射后白細(xì)胞數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)在5Gy 的照射劑量下,小鼠的白細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間持續(xù)降低,而且隨時(shí)間推移小鼠出現(xiàn)被毛蓬松,活動(dòng)減少，食欲減退、體重滯長(zhǎng)等癥狀，至第5 d ICR 小鼠有死亡現(xiàn)象發(fā)生。由此提示在造模后應(yīng)立即開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù),可以達(dá)到較佳的治療效果，藥物干預(yù)最遲不可超過(guò)照射后第3 d。五、白血病動(dòng)物模型白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性疾病。根據(jù)不同分類方法，可有數(shù)十種類型。絕大多數(shù)人類白血病可以用化學(xué)(如烷化刑)、物理(如電離輻射)、生物(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)以及轉(zhuǎn)基因方法，在不同動(dòng)物（小鼠、豚鼠、大鼠、貓、

19、牛、長(zhǎng)臂猿等）誘發(fā)白血病，建立動(dòng)物模型。1 T淋巴細(xì)胞白血病小鼠(L615)動(dòng)物模型(animal model of T 1ymPhocytic 1eukemia) 【造模方法】1965年，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所用津638病毒誘發(fā)的昆明小鼠白血病組織的無(wú)細(xì)胞提取液，皮下注射給新生615小鼠，經(jīng)81 d潛伏期，取一只患白血病小鼠，用生理鹽水制備脾細(xì)胞懸液(25)，皮下注射給4只成年615小鼠，均發(fā)生白血病，平均存活時(shí)間為29.7 d，以患病小鼠的脾臟為瘤源，在615小鼠連續(xù)移植傳代，能百分之百發(fā)病，且存活時(shí)間逐漸縮短，達(dá)30代后建成穩(wěn)定的白血病模型稱L615白血病。 L615小鼠存活時(shí)間為(

20、6.7±1.2) d，除皮下接種外，腹腔接種亦可百分之百發(fā)病，存活時(shí)間稍短，但無(wú)腹水形成。L615小鼠白血病對(duì)各類抗腫瘤藥物有不同程度的敏感性。在7種抗代謝類藥物中，6種有明顯療效，如6-巰基膘吟、5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶核苷可使40以上的動(dòng)物存活1個(gè)月以上；16種烷化劑中，14種有明顯療效，其中環(huán)磷酰胺等9種藥物可使部分動(dòng)物存活1個(gè)月以上。L615 T細(xì)胞白血病小鼠的脾細(xì)胞懸浮體外培養(yǎng)還建立了L615 T細(xì)胞白血病細(xì)胞系，可在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，亦可長(zhǎng)期冷凍保存?zhèn)溆谩615 T細(xì)胞白血病小鼠，亦是我國(guó)自己建立的T細(xì)胞白血病小鼠動(dòng)物模型。它是人類T細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制、藥物篩選及藥效

21、、預(yù)后等研究的很好的動(dòng)物模型。在此基礎(chǔ)上建立了我國(guó)特有的小鼠白血病模型系統(tǒng)，如L7212、L7710、L7711、L759、L7811等均為T淋巴系統(tǒng)白血病。2 粒單核細(xì)胞白血病（WEHI-3）小鼠模型(animal model of myelomonocytic leukemia) 【造模方法】用礦物油注入小鼠體內(nèi)造成產(chǎn)生白血病的體內(nèi)環(huán)境。1966年Qsserman等建立粒單雙系細(xì)胞的白血病動(dòng)物模型，用7周齡雄性BALB/c小鼠18只，每只小鼠腹腔注射醫(yī)用石蠟油0.4 mL，在11周齡與15周齡時(shí)各重復(fù)注射一次。在7周齡與14周齡之間，皮下注射丙酸睪酮0.01 mg(溶于0.05 m1橄欖油

22、中)，每周5次，17同齡時(shí)再皮下注射睪酮0.25 mg一次。其個(gè)11只小鼠發(fā)生腫瘤，第一批是在6月齡時(shí)（即停止注射石蠟油2個(gè)月后)發(fā)生腫瘤，其余是在915月齡間發(fā)生。這種腫瘤稱為wEHI-3。 從原代粒單核細(xì)胞白血病小鼠取數(shù)個(gè)實(shí)體瘤制備單細(xì)胞懸液，移植傳代給8只受體小鼠全部發(fā)生腫瘤，移植后1721d取其中的4只小鼠脾細(xì)胞懸液再移植傳代，每種懸液注入4只受體小鼠，每組小鼠繼續(xù)移植傳代，頭3次的移植傳代時(shí)間為20 d，以后的傳代時(shí)間則為14 d。獲得4個(gè)亞系即為WEHI-3A、B、C、D。A亞系，綠色白血病，當(dāng)粒細(xì)胞達(dá)50%以上時(shí)，其綠色是由于髓過(guò)氧化物酶與內(nèi)顆粒結(jié)合所致，與原代腫瘤一樣，有40條

23、染色體，B亞系：非綠色白血病、39條染色體，在體外培養(yǎng)能形成集落。C亞系：非綠色白血病40條染色體。D亞系：綠色白血病，為四倍體核型。其核型在移植傳代過(guò)程中可發(fā)生變化，如B亞系，第2、第3次移植傳代時(shí)，39條染色體有1條具有近端著絲粒的標(biāo)記染色體，而在第1415次移植傳代之間就變成中間著絲粒的標(biāo)記染色體，在移植過(guò)程中患粒一單核細(xì)胞白血病的BALB/c小鼠血象與骨髓象均有變化。3. 人類白血病的小鼠模型(mice model of human myeloid leukemia)【造模機(jī)理】 用免疫耐受性強(qiáng)的人類胎兒骨片植入重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人類造血細(xì)胞與造血微環(huán)境均植入

24、小鼠，建立具有人類造血功能的SCID小鼠模型稱為SCIDhu小鼠。再將髓系白血病患者的骨髓細(xì)胞植入SCIDhu小鼠皮下的人類胎兒骨片內(nèi)，植入的髓系白血病細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)在SCIDhu小鼠體內(nèi)的人類造血微環(huán)境中，即為人類髓系白血病的小鼠模型，這是當(dāng)今研究人類髓系白血病最理想的動(dòng)物模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴細(xì)胞功能聯(lián)合缺陷，這種小鼠能接受人類器官移植物。【造模方法】 (1) SCID-hu小鼠：CB-17 scid/scid 繁殖的近交小鼠(SCID)，68周齡時(shí)用抗生素處理。在無(wú)菌條件下，從1923 妊娠周齡的胎兒取出股骨和脛骨，剪成5mm× mm×l

25、mm的骨片，植入SCID小鼠皮下，并從每個(gè)胎兒供體制備胸腺細(xì)胞用于檢測(cè)同種異體HLA。 (2) 白血病細(xì)胞注射：急性髓性白血病患者骨髓細(xì)胞(0.42) ×104個(gè)活細(xì)胞(常用凍存解凍后的細(xì)胞)懸浮于含10胎牛血清的PM1640培養(yǎng)液20 d,用微注射器將細(xì)胞懸液直接注射人68周前植入SCID-hu小鼠的人胎骨片內(nèi)。選擇移植骨與白血病細(xì)胞的供體是HLA同種異型，便于追蹤人肋骨移植片中細(xì)胞的來(lái)源。白血病細(xì)胞的體內(nèi)傳代：將已生長(zhǎng)有白血病細(xì)胞的骨移植片再制備細(xì)胞懸液，取(0.52)×106個(gè)活細(xì)胞，注入第2個(gè)SCID-hu受體小鼠的移植骨片內(nèi)。處理小鼠MHC-I(主要組織相容性復(fù)合

26、體I類)抗原的單抗，直接與染料熒光素異硫氰化物或藻紅蛋白結(jié)合，用流式細(xì)胞儀將細(xì)胞分類并分析細(xì)胞來(lái)源。胎骨植入后23周時(shí)，骨片內(nèi)有壞死與纖維化，CFUGM與BFUE減少，未見(jiàn)造血中心；移植45周時(shí)，骨片內(nèi)出現(xiàn)由淋巴系與未成熟的髓系細(xì)胞組成的造血中心；68周后，植入胎骨片結(jié)構(gòu)與正常胎兒造造血骨髓類似，并能維持正常造血達(dá)20周。用ME43(人類細(xì)胞抗原的特異抗體)與Ly5.1(小鼠血細(xì)胞的特異抗體)檢測(cè)，植入骨片的細(xì)胞中人類細(xì)胞占70以上，而小鼠細(xì)胞僅占520。胎兒骨片內(nèi)的人類基質(zhì)細(xì)胞可刺激人的造血干細(xì)胞的增殖與分化，以維持正常造血。將人的急性髓性白血病細(xì)胞注入SCID-hu小鼠的一塊胎骨片內(nèi)，46

27、周后，胎兒骨片內(nèi)的正常造血細(xì)胞被急性白血病細(xì)胞的增殖所取代，而且還選擇性地轉(zhuǎn)移到植入的其他胎骨片內(nèi)?！灸Ｐ蛻?yīng)用】該模型是人類白血病細(xì)胞生長(zhǎng)在小鼠體內(nèi)的人類造血微環(huán)境中，因此能更精確地用來(lái)研究人類自血病發(fā)病機(jī)制與對(duì)新療法的評(píng)價(jià)，是目前研究白血病的最佳動(dòng)物模型。該模型的建立原理與方法也適用于其他白血病與惡性腫瘤動(dòng)物模型的建立。但應(yīng)注意植入小鼠的胎兒骨片與成人骨艙造血釘些不同。4. 急性B 淋巴細(xì)胞白血病動(dòng)物模型的建立【造模機(jī)理】急性白血病是兒童常見(jiàn)的血液系統(tǒng)腫瘤,急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL ) 約占70% , 其中80%來(lái)自B 細(xì)胞系,N alm-6 是急性人B 淋巴細(xì)胞系白血病細(xì)胞株,在普通的R

28、MPI-1640 培養(yǎng)基中容易生長(zhǎng)，繁殖快，惡性度高, 能引起彌散性疾病, 可移植入裸鼠或SC ID 小鼠。裸鼠T 淋巴細(xì)胞缺陷，而SC ID 小鼠T、B 淋巴細(xì)胞聯(lián)合缺陷, 更容易移植成功, 但是價(jià)格昂貴。為此，本實(shí)驗(yàn)采用裸鼠建立白血病動(dòng)物模型?！驹炷７椒ā?用無(wú)菌PBS 液將環(huán)磷酰胺濃度調(diào)整到10 mg/mL, 腹腔注射環(huán)磷酰胺2 mg/只, 連續(xù)注射2 d; 24 h 后,收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的N alm-6 細(xì)胞, 1 000 r/min 離心5 min 后, 懸浮于無(wú)菌PBS 中, 調(diào)整細(xì)胞密度至2. 5×107個(gè)/mL, 尾靜脈注射5×106個(gè)/只(200 L)

29、每隔12 d 觀察小鼠癥狀, 以后肢出現(xiàn)癱瘓為發(fā)病標(biāo)準(zhǔn), 記錄小鼠發(fā)病和死亡日期。 待小鼠瀕死時(shí), 頸椎脫臼法將其處死, 立即取小鼠的肝、脾、肺、心臟、腎、腸、腦組織、骨髓、胰腺、睪丸、卵巢等, 經(jīng)10% 中性福爾馬林固定脫水、透明、浸蠟、包埋, 制成石蠟切片, H-E 染色后在光鏡下觀察各個(gè)組織腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)情況。圖1裸鼠B 系A(chǔ)LL 白血病動(dòng)物模型Fig.1The nude mice model of B-ALL腫瘤模型小鼠組織內(nèi)有大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)箭頭所示)圖3小鼠組織病理檢查結(jié)果(×100 倍)Fig.3The histopatho logical exam ination

30、of each organ (×100)【模型特點(diǎn)】白血病小鼠的發(fā)病時(shí)間不僅與小鼠周齡有關(guān), 也與注射的腫瘤細(xì)胞數(shù)目有密切關(guān)系, 但與雌雄關(guān)系不大。Gunther 用6 周齡的SCID 小鼠, 每只注射1×106個(gè)N alm-6 細(xì)胞, 平均32 d后肢行動(dòng)遲緩, 39 d 癱瘓; U ckun 用67 周齡的雌性SCID 小鼠 5 , 每只注射1×106個(gè)N alm-6細(xì)胞, 有56% 的小鼠平均33 d 發(fā)生癱瘓, 39 d全部死亡, 兩研究小鼠發(fā)病時(shí)間相似; Herrera用1013 周齡的SCID 小鼠 6 , 注射5×106個(gè)N alm-6 細(xì)

31、胞后平均36 d 發(fā)病。本研究采用56 周的裸鼠, 每只注射5×106個(gè)N alm-6 細(xì)胞, 平均20 d 發(fā)病, 模型建立成功率100% , 但是發(fā)病時(shí)間比上述報(bào)道早, 可能是由于使用的小鼠周齡小, 注射腫瘤細(xì)胞數(shù)目多, 進(jìn)入小鼠體內(nèi)后生長(zhǎng)繁殖較快, 導(dǎo)致小鼠發(fā)病較早。2.人慢性粒細(xì)胞白血病動(dòng)物模型的建立【造模機(jī)理】目前建立人慢性粒細(xì)胞白血病動(dòng)物模型的方法主要有3 種,包括用慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞種植免疫缺陷鼠(SCID 或NOD/SCID) 、用表達(dá)P210bcr/abl逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞并移植入正常鼠體內(nèi)和構(gòu)建bcr/abl轉(zhuǎn)基因鼠。【造模方法】免疫缺陷小鼠人慢粒白

32、血病模型：2002 年Ramshaw 等發(fā)現(xiàn)在體外半固體培養(yǎng)基上用人GMCSF 拮抗劑E21R 可抑制全部7 個(gè)CML 患者CML 細(xì)胞的克隆形成，繼而他們采用人CML 細(xì)胞(1×108 細(xì)胞只) 分別輸入SCID 鼠和人GMCSF 轉(zhuǎn)基因SCID 鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)人CML 細(xì)胞在SCID 小鼠體內(nèi)難以定植，而在轉(zhuǎn)人GMCSF 基因的SCID 小鼠體內(nèi)6 周后CML 細(xì)胞數(shù)量可達(dá)到高峰，證明人CML 細(xì)胞在體內(nèi)、體外生長(zhǎng)均依賴人GMCSF7 。Nicolini 等用表達(dá)人特異性的造血生長(zhǎng)因子IL23、GMCSF、SF 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染的小鼠骨髓細(xì)胞接種NODSCID 小鼠，324周后

33、小鼠血清IL23、GMCSF、SF 可達(dá)ngml 水平,將人造血干細(xì)胞或胎肝細(xì)胞移植到這些NODSCID 小鼠體內(nèi)，和未轉(zhuǎn)染造血生長(zhǎng)因子的NODSCID 小鼠相比，發(fā)現(xiàn)人髓系白細(xì)胞數(shù)明顯增加，人造血干細(xì)胞明顯向髓系方向分化, 而紅系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞明顯減少8 。由此可見(jiàn)，轉(zhuǎn)人GMCSF 基因的SCID 鼠或NODSCID 小鼠可用于制備較為理想的人CML 動(dòng)物模型。用表達(dá)P210bcrPabl 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細(xì)胞并移植正常鼠：Daley 等分離雌性BALBc 小鼠的骨髓細(xì)胞，用表達(dá)bcrabl 融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染，篩選后注入到5 只612 周齡經(jīng)致死劑量(900 cGy)

34、 照射的同源雄性BALBc 小鼠體內(nèi)，小鼠出現(xiàn)CML 相關(guān)癥狀以及急性淋巴細(xì)胞性白血病9 。bcrPabl 轉(zhuǎn)基因小鼠模型：Honda 等18 對(duì)P210bcrabl轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行深入研究。他們克隆分析小鼠Tec 基因的啟動(dòng)子序列和功能，發(fā)現(xiàn)由Tec 啟動(dòng)子調(diào)控的基因僅特異性地表達(dá)在造血干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。他們用小鼠的Tec 基因的啟動(dòng)子序列( -1948 至+ 22) 代替以前所使用的MT 啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列，制備轉(zhuǎn)基因載體。在所產(chǎn)生的87 只轉(zhuǎn)基因鼠中,有84 只轉(zhuǎn)基因小鼠首先出現(xiàn)粒細(xì)胞異常增生、高血小板血癥，經(jīng)一定時(shí)間后發(fā)生骨髓增殖綜合征(MPD)，和人CML 極為相似。其中只有兩只轉(zhuǎn)基因

35、鼠在出生后即表現(xiàn)為急性白血病，但它們的子代經(jīng)過(guò)一段潛伏期后表現(xiàn)骨髓增生綜合征。這一研究表明選擇恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子對(duì)構(gòu)建CML 轉(zhuǎn)基因鼠是十分重要的。【模型應(yīng)用】CML 動(dòng)物模型的研究發(fā)展迅速,分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使我們有可能制備出更加完善的CML 動(dòng)物模型,用于我們對(duì)CML 發(fā)病機(jī)理的研究和有效治療方法的探索。六、出血性疾病動(dòng)物模型出血性疾病種類很多，根據(jù)參與止血機(jī)制的系統(tǒng)可分為血管因素的異常、血小板因素的異常、凝血系統(tǒng)的異常以及纖溶系統(tǒng)的異常。特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP），因血小板因素異常導(dǎo)致。獲得性血友病A則因凝血系統(tǒng)的異常導(dǎo)致。目前，該兩種疾病已有相應(yīng)的動(dòng)物模型，均為兔和小鼠。

36、1. 特發(fā)性血小板減少性紫斑(idiopathic thrombocytope nic purpura,ITP)兔、小鼠模型【造模機(jī)理】用含抗血小板抗體的血清注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注人的抗血小板抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)，使動(dòng)物體內(nèi)血小板消耗而導(dǎo)致血小板數(shù)量減少故又稱為免疫性消耗性血小板減少癥。【造模方法】ITP兔模型：采用新西蘭白兔，雄雌均可，體重24kg；脈鼠，大于3月齡均可，雌雄不拘。 (1) 豚鼠抗兔血小板血清的(GP-APs)制備：用米巴比妥鈉(30 mg/kg體重)從耳緣靜脈注射麻醉免，按6:1(V/V)從免頸動(dòng)脈取全血與酸性枸椽酸右旋糖(Acid citrate dextrose，ACD )混

37、合，pH值4.5，經(jīng)離心，分離血小板，并洗滌，用生理鹽水稀釋制成混懸液。用上述血小板混懸液(10血小板)注人豚鼠腹腔，此后每間隔1個(gè)月注射一次，連續(xù)2次，共注射3次(3×10個(gè)血小飯)。末次注射后的第6天，從脈鼠心臟穿刺取血，離心后取上層血清，隨即分別用等量1:1(V/V)兔壓緊紅細(xì)胞和洗滌過(guò)的兔淋巴細(xì)胞各吸附血清一次，用生理鹽水稀釋，即為豚鼠抗免血小板抗血清，分裝后儲(chǔ)存于-70冰箱待用、按ELISA法和放射免疫沉淀法檢測(cè)抗血清效價(jià)。 (2)兔ITP模型的建立： 1）急性短期兔ITP模型：苯巴比妥鈉麻醉兔，插入頸動(dòng)脈套管后。耳緣靜脈注射豚鼠抗兔血小板血清(根據(jù)抗血清效價(jià)與降血小板之間的量效關(guān)系，確定抗血清的注射量)。間隔15min，從頸動(dòng)脈套管取全血注入裝有EDTA的管內(nèi)做血小板計(jì)數(shù)，在注射后的