第五章高效毛細(xì)管電泳和電動色譜

1、第五章第五章 高效毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電高效毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電動色譜分析法動色譜分析法2毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本原理3毛細(xì)管電泳裝置毛細(xì)管電泳裝置4毛細(xì)管電動色譜毛細(xì)管電動色譜5實驗技術(shù)實驗技術(shù)61概述概述應(yīng)用應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 電泳：電泳：帶電粒子在電場作用下于一定介質(zhì)帶電粒子在電場作用下于一定介質(zhì)中發(fā)生定向運動的現(xiàn)象。中發(fā)生定向運動的現(xiàn)象。 高效毛細(xì)管電泳：高效毛細(xì)管電泳：以毛細(xì)管為分離通道，以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力進(jìn)行高效、快速以高壓直流電場為驅(qū)動力進(jìn)行高效、快速分離的一種電泳技術(shù)。分離的一種電泳技術(shù)。一、發(fā)展歷史一、發(fā)展歷史目前：分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展

2、最快的分離技術(shù)目前：分析化學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展最快的分離技術(shù)1930年，瑞典化學(xué)家年，瑞典化學(xué)家Tiselius（1948年榮獲諾貝爾化學(xué)獎）年榮獲諾貝爾化學(xué)獎）1981年，年，Jorgenson和和Lukacs成功地對丹?；被針悠烦晒Φ貙Φ；被針悠愤M(jìn)行了快速、高效分離。進(jìn)行了快速、高效分離。二、優(yōu)缺點二、優(yōu)缺點樣品量少、操作簡便、分離效率高、分樣品量少、操作簡便、分離效率高、分析成本低、應(yīng)用面廣。析成本低、應(yīng)用面廣。 但但CECE制備能力差，在進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和檢制備能力差，在進(jìn)樣的準(zhǔn)確性和檢測靈敏度等方面比高效液相色譜法略遜。測靈敏度等方面比高效液相色譜法略遜。 三、分類三、分類毛細(xì)管區(qū)帶電

3、泳毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）毛細(xì)管等速電泳毛細(xì)管等速電泳（CITP）毛細(xì)管等電聚焦毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）毛細(xì)管電動色譜毛細(xì)管電動色譜（CEC）親和毛細(xì)管電泳親和毛細(xì)管電泳（ACE）一、電泳分離基礎(chǔ)一、電泳分離基礎(chǔ)1、電泳淌度、電泳淌度 式中，式中，ueue為電泳淌度；為電泳淌度；E E為電場強度；為組分的分為電場強度；為組分的分離度；為組分的電動電位；離度；為組分的電動電位；為介質(zhì)的介電常為介質(zhì)的介電常數(shù)；數(shù)；為介質(zhì)的粘度；為介質(zhì)的粘度；d d為與離子大小有關(guān)的常為與離子大小有關(guān)的常數(shù)數(shù) EdEeiee第二節(jié)第二節(jié) 毛細(xì)管電泳的基本原理毛細(xì)管電泳的基本原理 當(dāng)電場強度一定時離子的電泳淌度不同

4、，在當(dāng)電場強度一定時離子的電泳淌度不同，在電場中的移動速率不一樣，利用這個原理電場中的移動速率不一樣，利用這個原理可以將不同的離子彼此分離。可以將不同的離子彼此分離。2 2、電滲流、電滲流 電滲流是指毛細(xì)管中的溶劑在軸向直電滲流是指毛細(xì)管中的溶劑在軸向直流電場作用下而發(fā)生的定向流動現(xiàn)象。流電場作用下而發(fā)生的定向流動現(xiàn)象。NNNNNN界面界面吸附層吸附層 緊密層緊密層 擴散層擴散層管管壁壁 毛細(xì)管內(nèi)壁的雙電層模型毛細(xì)管內(nèi)壁的雙電層模型-.荷負(fù)電粒子；荷負(fù)電粒子； +.荷正電粒子；荷正電粒子； N.電中性粒子電中性粒子 電滲流與高效液相色譜的流型對比電滲流與高效液相色譜的流型對比 與電泳類似，常用

5、電滲淌度表示電滲流大小，與電泳類似，常用電滲淌度表示電滲流大小，如下式所示：如下式所示： 式中，式中，為電滲淌度；為電滲淌度；eoeo為電滲速度為電滲速度. .在電滲流存在的情況下，組分的遷移速度是它的在電滲流存在的情況下，組分的遷移速度是它的電泳速度和電滲流速度的總和，可以用下式表電泳速度和電滲流速度的總和，可以用下式表示：示： EeoEeoe二、毛細(xì)管區(qū)帶電泳二、毛細(xì)管區(qū)帶電泳 特征：特征：是整個系統(tǒng)都用同一種電泳緩沖液充滿是整個系統(tǒng)都用同一種電泳緩沖液充滿. .緩沖液由緩沖液由緩沖試劑、緩沖試劑、pHpH調(diào)節(jié)劑、溶劑調(diào)節(jié)劑、溶劑和和添加劑添加劑組組成。成。分離原理：分離原理：當(dāng)電流通過時

6、，緩沖液中的陽當(dāng)電流通過時，緩沖液中的陽離子、陰離子分別以恒定的速度向陽極和離子、陰離子分別以恒定的速度向陽極和陰極移動，由于試樣中各個組分間荷質(zhì)比陰極移動，由于試樣中各個組分間荷質(zhì)比的差異，以不同的速度在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)的差異，以不同的速度在分立的區(qū)帶內(nèi)進(jìn)行遷移行遷移. .如果試樣中各個組分的遷移率差別如果試樣中各個組分的遷移率差別較大，就能將各個組分分離。較大，就能將各個組分分離。特點：特點：速度快、分辨率高、消耗低等速度快、分辨率高、消耗低等。水中無機陰離子及有機酸根的分離圖譜。水中無機陰離子及有機酸根的分離圖譜。 15311632432157 8 10141719202122242526

7、272830343536611121318232933t/min1.401.801.602.002.202.402.602.8010936種陰離子的CZE分離圖譜1.S2O32-；2. Br-；3.Cl-；4.SO42-；5. NO2-；6. NO3-；7. 鉬酸根；8. 疊氮（化物）；9. WO42-；10.一氟磷酸根；11.ClO3-；12.檸檬酸根；13. F-；14.甲酸根；15. PO43-；16. 亞磷酸根；17. 次氯酸根；18. 戊二酸根；19. 鄰苯二甲酸根；20. 半乳糖二酸根；21. 碳酸根；22. 乙酸根；23. 氯乙酸根；24. 乙基磺酸根；25. 丙酸根；26. 丙

8、基磺酸根；27. 天冬酸根；28. 巴豆酸根；29. 丁酸根；30. 丁基磺酸根；31. 戊酸根；32. 苯甲酸根；33. L-谷氨酸根；34. 戊基磺酸根；35. d-葡萄糖酸根；36. d-半乳糖醛酸根.三、毛細(xì)管凝膠電泳三、毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管凝膠電泳毛細(xì)管凝膠電泳 CGECGE）：按照試樣中各個組）：按照試樣中各個組分相對分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離的方法。分相對分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離的方法。用途：常用于蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸、核糖核用途：常用于蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸、核糖核酸、酸、DNADNA片段的分離和測序及聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)片段的分離和測序及聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的分析。物的分析。CGECGE能達(dá)到能

9、達(dá)到CECE中最高的柱效。中最高的柱效。線形聚丙烯酰胺溶液分離混合線形聚丙烯酰胺溶液分離混合DNADNA的電泳圖譜。的電泳圖譜。1010151520201 12 24 43 35 57 76 6t/mint/minDNADNA在線形聚丙烯酰胺溶液中的電泳圖譜在線形聚丙烯酰胺溶液中的電泳圖譜1. 564bp1. 564bp；2. 2.0kbp2. 2.0kbp；3. 2.3kbp3. 2.3kbp；4. 4.4kbp4. 4.4kbp；5. 5. 6.6kbp6.6kbp；6. 9.4kbp6. 9.4kbp；7. 23.1kbp.7. 23.1kbp.四、毛細(xì)管等電聚焦四、毛細(xì)管等電聚焦 毛細(xì)

10、管等電聚焦是基于不同蛋白質(zhì)或多肽之毛細(xì)管等電聚焦是基于不同蛋白質(zhì)或多肽之間等電點的差異進(jìn)行分離的電泳技術(shù)。間等電點的差異進(jìn)行分離的電泳技術(shù)。 毛細(xì)管等電聚焦最具特色的應(yīng)用是測定毛細(xì)管等電聚焦最具特色的應(yīng)用是測定蛋白蛋白質(zhì)的等電點質(zhì)的等電點。在。在異構(gòu)酶鑒定、單克隆抗體、異構(gòu)酶鑒定、單克隆抗體、多克隆抗體、血紅蛋白亞基多克隆抗體、血紅蛋白亞基等研究中，經(jīng)常等研究中，經(jīng)常用毛細(xì)管等電聚焦。用毛細(xì)管等電聚焦。五、親和毛細(xì)管電泳五、親和毛細(xì)管電泳 親和毛細(xì)管電泳是利用配體與受體之間存在特異性親和毛細(xì)管電泳是利用配體與受體之間存在特異性相互作用，可以形成具有不同荷相互作用，可以形成具有不同荷- -質(zhì)比的

11、配合物而達(dá)質(zhì)比的配合物而達(dá)到分離目的。到分離目的。t/min2486123t/min2486123 緩沖液加緩沖液加Ca2+ 緩沖液加緩沖液加EDTA微白蛋白的親和毛細(xì)管電泳分離圖譜微白蛋白的親和毛細(xì)管電泳分離圖譜 1. 電滲峰；電滲峰；2. 蛋白峰；蛋白峰；3. 未知組分未知組分高壓電源2 3 45 7 1 6 毛細(xì)管電泳裝置示意圖毛細(xì)管電泳裝置示意圖1. 高壓電極槽；高壓電極槽；2. 毛細(xì)管；毛細(xì)管；3. 檢測器；檢測器；4. 鉑絲電極；鉑絲電極；5. 低壓電極槽；低壓電極槽；6. 恒溫系統(tǒng)；恒溫系統(tǒng)；7. 記錄記錄/數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理.第三節(jié)第三節(jié) 毛細(xì)管電泳裝置毛細(xì)管電泳裝置一、電泳電壓

12、一、電泳電壓u 電泳電壓是控制柱效、分離度和分析時間的重要因素。電泳電壓是控制柱效、分離度和分析時間的重要因素。u 電泳分離體系的最佳工作電壓，與緩沖液濃度、毛細(xì)電泳分離體系的最佳工作電壓，與緩沖液濃度、毛細(xì)管內(nèi)徑及長度有關(guān)。管內(nèi)徑及長度有關(guān)。u 除選擇工作電壓外，還應(yīng)選擇電壓施加方式除選擇工作電壓外，還應(yīng)選擇電壓施加方式.通常有恒通常有恒壓、恒流、恒功率、梯度升壓、梯度降壓等工作模式。壓、恒流、恒功率、梯度升壓、梯度降壓等工作模式。ABt/min14.5017.2522.7520.0025.50梯度升壓方式對毛細(xì)管電泳分離的影響梯度升壓方式對毛細(xì)管電泳分離的影響A. 2kV至至25kV，0m

13、in，一步升壓；，一步升壓；B.2kV至至25kV，5min，線性梯度，線性梯度升壓升壓.樣品：樣品：-乳球蛋白乳球蛋白A，溶菌酶，細(xì)胞色素，溶菌酶，細(xì)胞色素C，肌紅蛋白，微白蛋白，肌紅蛋白，微白蛋白 二、毛細(xì)管及其溫度控制二、毛細(xì)管及其溫度控制毛細(xì)管電泳柱作為分離分析的載體，其毛細(xì)管電泳柱作為分離分析的載體，其材料、材料、形狀、內(nèi)徑、柱長、溫度形狀、內(nèi)徑、柱長、溫度對分離度和重現(xiàn)性都對分離度和重現(xiàn)性都有影響。有影響。1 1、毛細(xì)管的選擇、毛細(xì)管的選擇目前多用圓管形彈性熔融石英毛細(xì)管，俗稱融硅毛目前多用圓管形彈性熔融石英毛細(xì)管，俗稱融硅毛細(xì)管。細(xì)管。同樣電壓下，毛細(xì)管孔徑越小，電流越小，產(chǎn)生的

14、同樣電壓下，毛細(xì)管孔徑越小，電流越小，產(chǎn)生的焦耳熱越少。焦耳熱越少。毛細(xì)管內(nèi)壁的表面特性對毛細(xì)管內(nèi)壁的表面特性對CECE的行為有顯著影響。的行為有顯著影響。 2 2、 毛細(xì)管溫度控制毛細(xì)管溫度控制 電泳溫度的選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)電泳溫度的選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)性控制、分離效率控制和分離介質(zhì)對溫度性控制、分離效率控制和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。的限制等因素。可以用空氣循環(huán)或水循環(huán)的方式降溫。可以用空氣循環(huán)或水循環(huán)的方式降溫。還有一種固體恒溫方式，采用熱傳導(dǎo)系數(shù)還有一種固體恒溫方式，采用熱傳導(dǎo)系數(shù)高的合金材料制成電熱控制器，可以快速高的合金材料制成電熱控制器，可以快速散發(fā)焦耳熱。散發(fā)焦

15、耳熱。t/min01051520305040電流（/A）123毛細(xì)管電流隨時間變化曲線毛細(xì)管電流隨時間變化曲線1.1.空氣自然對流；空氣自然對流；2.2.空氣強制對流；空氣強制對流；3.3.固態(tài)固態(tài)電熱冷卻。電熱冷卻。三、進(jìn)樣三、進(jìn)樣1. 1. 電動進(jìn)樣電動進(jìn)樣試樣因離子遷移和電滲作用進(jìn)入管內(nèi)。試樣因離子遷移和電滲作用進(jìn)入管內(nèi)。2. 2. 壓力進(jìn)樣壓力進(jìn)樣管中溶液流動，將試樣帶入。管中溶液流動，將試樣帶入。3. 3. 擴散進(jìn)樣擴散進(jìn)樣利用濃度差擴散原理將樣品分子引入毛細(xì)管利用濃度差擴散原理將樣品分子引入毛細(xì)管四、檢測器四、檢測器紫外檢測器紫外檢測器激光誘導(dǎo)熒光檢測器激光誘導(dǎo)熒光檢測器質(zhì)譜檢測器

16、質(zhì)譜檢測器電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器 毛細(xì)管電動色譜：以電滲流為驅(qū)動力的一種色譜技毛細(xì)管電動色譜：以電滲流為驅(qū)動力的一種色譜技術(shù)，并且將術(shù)，并且將CECE的高效和的高效和HPLCHPLC的高選擇性相結(jié)合，除的高選擇性相結(jié)合，除可以分離離子化合物外，可以分離不帶電荷的中性可以分離離子化合物外，可以分離不帶電荷的中性化合物。化合物。填充柱毛細(xì)管電動色譜(PCCEC）膠束電動毛細(xì)管色譜（MECC）分類分類第四節(jié)第四節(jié) 毛細(xì)管電動色譜毛細(xì)管電動色譜陰極陽極溶質(zhì) 表面活性劑 電泳 電滲流第五節(jié)第五節(jié) 實驗技術(shù)實驗技術(shù)一、毛細(xì)管涂層技術(shù)一、毛細(xì)管涂層技術(shù) 7 7種蛋白質(zhì)在五氟代芳基涂層種蛋白質(zhì)在五氟代芳基涂

17、層A A和未涂層和未涂層B B毛細(xì)毛細(xì)管中的管中的CZECZE圖譜。圖譜。A162028243236t/min273139354347B12345678蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在APFAPF涂層涂層和未涂層毛細(xì)管中和未涂層毛細(xì)管中的的CZECZE圖譜圖譜1. 1. 溶菌酶；溶菌酶；2. 2. EOFEOF指示劑；指示劑；3. 3. 核核糖核酸酶；糖核酸酶；4. 4. 胰胰蛋白酶原；蛋白酶原；5. 5. 鯨肌紅蛋白；鯨肌紅蛋白；6. 6. 馬肌紅蛋白；馬肌紅蛋白；7. 7. 人碳酸酐酶人碳酸酐酶B B；8. 8. 牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶B. B. 毛細(xì)管涂層技術(shù)通常采用動態(tài)修飾和表面涂層兩類方法。 動態(tài)修飾

18、方法 表面涂層方法緩沖液中加入添加劑，并讓緩沖液與毛緩沖液中加入添加劑，并讓緩沖液與毛細(xì)管充分平衡細(xì)管充分平衡.如加入陽離子表面活性劑如加入陽離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨十四烷基三甲基溴化銨(tetradecyl trimethyl ammonium bromide ,TTAB)，能在內(nèi)壁形成物理吸附層，使能在內(nèi)壁形成物理吸附層，使EOF反向反向.添加劑還有聚乙烯亞胺、甲基纖維素添加劑還有聚乙烯亞胺、甲基纖維素(MC)、十六烷基溴化銨、十六烷基溴化銨(CTAB)等。等。包括物理涂布、化學(xué)鍵合、溶膠包括物理涂布、化學(xué)鍵合、溶膠-凝膠法等凝膠法等.最常用的是最常用的是Si-O-Si-R 鍵合鍵合方式，采用雙官能團(tuán)的偶聯(lián)劑，如聚甲基丙烯基硅二醇、方式，采用雙官能團(tuán)的偶聯(lián)劑，如聚甲基丙烯基硅二醇、3-氨丙基三氨丙基三甲氧基硅烷等，親水官能團(tuán)與管壁表面的硅羥基進(jìn)行共價結(jié)合，