實驗六菠菜葉綠體分離與熒光觀察(1)

1、 實驗六實驗六菠菜葉片葉綠體分離與熒光觀察菠菜葉片葉綠體分離與熒光觀察實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康?、了解、了解細胞器分離細胞器分離的一般原理，的一般原理，掌握基本分離方法。掌握基本分離方法。2、觀察葉綠體、觀察葉綠體自發(fā)熒光與間接自發(fā)熒光與間接熒光熒光實驗原理細胞器的分離：細胞器的分離：先勻漿先勻漿差速離心。差速離心。將組織勻漿后在等滲介質(zhì)中將組織勻漿后在等滲介質(zhì)中差速離心差速離心，是分離細胞器的常用方法。是分離細胞器的常用方法。實驗原理實驗原理用低滲、超聲破碎或研磨等勻漿方法可使細胞質(zhì)用低滲、超聲破碎或研磨等勻漿方法可使細胞質(zhì)膜破損，形成細胞核、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)膜破損，形成細胞核、線粒體、葉綠體、

2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細胞器和細胞組分組網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細胞器和細胞組分組成的混合勻漿，再通過成的混合勻漿，再通過差速離心差速離心，可將各種亞，可將各種亞細胞組分和各種顆粒分開。細胞組分和各種顆粒分開。實驗原理實驗原理 差速離心差速離心：即利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，：即利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，分離各種亞細胞組分和各種顆粒。分離各種亞細胞組分和各種顆粒。 在一定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度、大小不同的顆粒在一定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度、大小不同的顆粒其沉降速度不同，其沉降速度不同，依次增加離心力和離心時間，依次增加離心力和離心時間，密度及大密度及大小不同的

3、顆粒會先后分批沉降在離心管底部，分批收集即小不同的顆粒會先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分可獲得各種亞細胞組分。 顆粒在離心場中，其沉降速度取決于其顆粒在離心場中，其沉降速度取決于其大小、形狀大小、形狀和和密度密度，也與也與離心力離心力及及介質(zhì)黏度介質(zhì)黏度有關(guān)。有關(guān)。Differential centrifugation沉降順序沉降順序：核：核線粒體線粒體溶溶酶體與過氧化物酶體酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體與高爾基體核蛋白體。核蛋白體。High speedLow speed實驗原理實驗原理自發(fā)熒光：自發(fā)熒光：細胞內(nèi)含有的某些天然物質(zhì)，細胞內(nèi)含有的某些天然物質(zhì)，經(jīng)

4、短波光照射后所發(fā)出的光。經(jīng)短波光照射后所發(fā)出的光。誘發(fā)熒光：誘發(fā)熒光：物體經(jīng)熒光染料染色后，再物體經(jīng)熒光染料染色后，再經(jīng)短波光照射所發(fā)出的熒光。經(jīng)短波光照射所發(fā)出的熒光。1器材器材離心機、研缽、天平、顯微鏡、離心管、紗布、離心機、研缽、天平、顯微鏡、離心管、紗布、燒杯、量筒、滴管、載玻片、蓋玻片燒杯、量筒、滴管、載玻片、蓋玻片2 2材料材料新鮮菠菜葉新鮮菠菜葉3 3試劑試劑0.35mol/L0.35mol/L氯化鈉溶液氯化鈉溶液 （等滲介質(zhì)）（等滲介質(zhì)）一、葉綠體的分離與觀察一、葉綠體的分離與觀察1 1、菠菜及實驗用器皿放入、菠菜及實驗用器皿放入0-40-4預(yù)冷。預(yù)冷。2 2、取新嫩菠菜葉，洗

5、凈擦干、去粗脈，稱、取新嫩菠菜葉，洗凈擦干、去粗脈，稱1 10g0g，放入放入研缽。研缽。3 3、加入、加入0.35mol/L0.35mol/L氯化鈉溶液氯化鈉溶液20ml20ml，快速研磨（快速研磨（30-30-60s60s）。）。4 4、將勻漿用、將勻漿用4 4層紗布層紗布過濾。過濾。5 5、將濾液裝入、將濾液裝入2 2支離心管，經(jīng)天平上支離心管，經(jīng)天平上平衡平衡后，放入離心后，放入離心機中，機中，1000r/min1000r/min離心離心minmin，去上清，沉淀即為葉綠去上清，沉淀即為葉綠體。體。6 6、加、加0.35mol/L0.35mol/L氯化鈉氯化鈉溶液溶液2ml2ml，懸浮沉淀。懸浮沉淀。7 7、取葉綠體懸液滴于載玻片上，加蓋片。、取葉綠體懸液滴于載玻片上，加蓋片。8 8、普通光鏡下觀察，、普通光鏡下觀察，熒光顯微鏡下演示葉綠體的熒光顯微鏡下演示葉綠體的直接直接熒光熒光。注意事項：注意事項：實驗步驟實驗步驟二、葉綠體的二、葉綠體的間接熒光間接熒光觀察觀察 取葉綠體懸液滴于載玻片上，取葉綠體懸液滴于載玻片上，滴加滴加1 1滴滴0.01%0.01%吖啶橙吖啶橙，染色，染色10min10min，加蓋片，熒光顯微鏡觀察葉綠體加蓋片，熒光顯微鏡觀察葉綠體的的間接熒光。間接熒