人骨髓間充質(zhì)干細胞分離鑒定方法的改進

1、人骨髓間充質(zhì)干細胞分離鑒定方法的改進作者：吳潔瑩，廖燦，許遵鵬，陳勁松，辜少玲【摘要】本研究的目的是建立一種基于臨床移植需要的分離、培 養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, msc)的方 法，為配合造血干細胞移植的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。采用per co 11 分離液(1.073 g/ml)從新鮮成人骨髓穿刺液中分離msc,應(yīng)用貼壁 篩選法傳代培養(yǎng)，流式細胞儀檢測細胞表面抗原，成骨誘導(dǎo)體系(地 塞米松0. 1 u mol/l> b-甘油磷酸鈉10 mmol/l>抗壞血酸磷酸鹽50 n mol/l)及脂肪誘導(dǎo)體系(地塞米松1 umol/l、牛胰島素

2、5 mg/l> 1-甲基-3-異丁基-黃卩票吟0. 5 mmol/l>消炎痛60 u mol/l)分別誘導(dǎo) msc定向分化，通過細胞形態(tài)觀察及免疫化學(xué)染色進行鑒定。結(jié)果表 明：從成人骨髓液中分離培養(yǎng)出msc,穩(wěn)定表達cd73、cd105、cd166, 不表達cd34、cd45o定向誘導(dǎo)的成骨細胞表達堿性磷酸酶活性，脂肪 細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴。結(jié)論：采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法并 通過流式細胞術(shù)檢測及定向誘導(dǎo)分化，能夠從成人骨髓液中分離出 msc,并完成細胞表型及多向分化潛能的初步鑒定。木操作方案具有一 定的臨床應(yīng)用價值?！娟P(guān)鍵詞】間充質(zhì)干細胞a modified method t

3、o isolate and identify the adult mesenchymal stem cells from human bone marrowabstract the study was aimed to establish a protocol of isolating and culturing adult mesenchymal stem cel 1 s (msc) from human bone marrow aspirate and identify them by surface antigen analysis and committed differentiati

4、on in order to provide an experimental foundation for achieving a therapeutic benefit in applying msc in hematopoietic stem cell transplantation. mscs were obtained from fresh human bone marrow aspirate by gradient centrifugation with percoll (1. 073 g/ml) and anchoring culture in l-dmem with 10% fe

5、tal bovine serum by a full medium exchange every 3 days the msc surface antigens, including cd34, cd45, cd73,cd105,cd166,were analyzed on facscan flow cytometer under culture in conditioned medium for osteogenesis (the hormone cocktail containing 0. 1 u mol/l dexamethasone , 10 mmol/l glycerol-2-pho

6、sphate and 50 u mol/l ascorbic acid) and adipogenesis (the cocktail containing 1 u mol/l dexamethasone, 5 mg/l insulin, 0.5 mmol/l l-methyl-3-isobutylxanthine and 60 u mol/l indomethacin), mscs committedly differentiated into osteoblasts and adipocytes the differentiated mesenchymal stem cells were

7、identified by morphological observation and immunohistochemical staining the results showed that by gradient centrifugation and adhesion culture, mscs could be isolated and culture-expanded from human bone marrow aspirate these cells were uniformly negative for cd34, cd45 and positive for ci)73, cd

8、105 and cd 166 the osteogenic differentiated cells were positive for alkaline phosphatase (alp) and the adipogenic differentiated cells displayed accumulation of lipid vacuoles, as detected by oil red 0. it is con eluded that msc can be isolated and expand-cullured from adult human bone marrow aspir

9、ate and committedly differentiate into osteoblasts and adipocytes msc primary identification can be accomplished by flow cytometry and induced differentiation the set of methods in current experiment shows somewhat practical value for basic research and clinical application.key words mesenchymal ste

10、m cell; isolation method; identification method; cell culture; committed differentiation間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, msc)是最早自骨 髓中分離出的一類具有自我更新及多向分化潛能的組織干細胞lo 作為多種骨髓基質(zhì)細胞的祖細胞，msc具有穩(wěn)定和修復(fù)造血微環(huán)境， 促進造血干細胞增殖、分化，調(diào)節(jié)淋巴細胞免疫功能，減輕移植排斥 反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)2o msc的發(fā)現(xiàn)為針對性解決造血干細胞移植， 尤其是臍血移植中的干細胞數(shù)量相對不足及減少移植物抗宿主病提供 了一個有效途徑3, 4。木研究旨

11、在建立一種從成人骨髓組織中分離、 培養(yǎng)、擴增msc的簡便易行的方法，通過流式細胞儀檢測細胞表面抗 原和定向誘導(dǎo)分化，完成對獲得細胞的初步鑒定，為干細胞移植的臨 床治療及組織損傷修復(fù)工程提供實驗基礎(chǔ)。材料和方法材料與試劑骨髓穿刺液5 ml取自于健康成人移植供者，肝素抗凝，4°c 保存。分離培養(yǎng)試劑：percoll細胞分離液(1. 073 g/ml, pharmacia 產(chǎn) 晶)，msc 專用培養(yǎng)基 mesenculttm (msc basal medium and mesenchymal stem cel 1 stimulatory supplements, stem cel 1 產(chǎn)品

12、) 和胎牛血清(fbs, stem cell產(chǎn)品)，低糖及高糖dmem培養(yǎng)基 (dulbeccoz s modified eagle medium, gibco brl 產(chǎn)品)，胰蛋白 酶(sigma產(chǎn)品)；誘導(dǎo)試劑：地塞米松(dexamethasone)> b _甘油 磷酸鈉(b-glycerol-2-phosphate disodium salt)> 抗壞血酸磷酸 鹽(ascorbic aci d-2-phosphate sal t) > 3-異丁基-1-甲基黃卩票吟 (3isobuty 1-lmethy 1 xanthine, ibmx)> 胰島素(insulin

13、)> 消炎 痛(indomethacin)及堿性磷酸酶(alp)染色試劑盒均為sigma產(chǎn)品； 流式相關(guān)抗體：鼠抗人單克隆抗體cd45-fitc、cd34-pe、cd73-pe、 cd166-pe (bd pharmigen 產(chǎn)品)、cd105-fitc (serotec 產(chǎn)品)。主要 儀器：細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶(corning)；超凈工作臺(廣州醫(yī)學(xué) 生物工程研究所，gx-ii型)，細胞培養(yǎng)箱(wtc binder),流式細胞儀 (facscalibur, becton dickinson 產(chǎn)品)，倒置顯微鏡、照相機 (olympus),熒光顯微鏡、數(shù)碼相機(nikon),低溫冷凍離

14、心機(iec centra)o方法人骨髓msc的分離培養(yǎng)與傳代無菌條件下用等量pbs稀釋肝素抗凝骨髓液，在10 ml消毒 離心管屮加入6 ml percoll分離液，再將4 ml稀釋的骨髓液小心加 至分離液表面，820xg離心20分鐘；吸取分界面的白色絮狀細胞層, 用低糖dmem培養(yǎng)基混勻,300xg離心10分鐘,洗滌2次。按2 x 105/cm2 密度接種于含msc專用培養(yǎng)基的75 cm2培養(yǎng)瓶，37°c> 5% c02培養(yǎng) 箱全濕條件下培養(yǎng)48小時，全量換液，去除血細胞及其它未貼壁成分。 用含10% fbs的低糖dmem培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，每 3天全量換液。細

15、胞融合達80%以上，加入0. 10%-0. 15%胰蛋白酶-edta 溶液2. 5 ml消化，按1 ： 4或1 ： 5傳代。取3代以上的細胞進行實驗。msc表面抗原的檢測取第3代生長達80%融合的貼壁細胞，用胰蛋白酶消化，計 數(shù)后取2 x 106個細胞，分裝6管，每管加入10卩1熒光標記抗體 cd45-fitc、cd34-pe、cd73-pe、cd105-fitc、cd166-pe,另設(shè) 1 管為 空口對照，室溫避光30分鐘；用pbs反復(fù)洗2-3次，減少非特異性結(jié) 合；加入200 n 1 pbs混勻細胞，并以1%多聚甲醛固定，4°c保存， 24小時內(nèi)上流式細胞儀檢測。定向誘導(dǎo)msc向

16、成骨細胞分化的方法與鑒定收集消化后細胞，按3 000 cells/cm2接種于6孔板或24 孔板，待多數(shù)細胞貼壁后，換用含10%fbs的高糖dmem培養(yǎng)液，加入 成骨誘導(dǎo)體系：地塞米松0. 1 u mol/l> b-廿油磷酸鈉10 mmol/l> 抗壞血酸磷酸鹽50 umol/l,每3天全量換液，維持2-3周。用堿性磷酸酶試劑盒染色。定向誘導(dǎo)msc向脂肪細胞分化的方法與鑒定收集消化后細胞,按1 x 104 cells/cm2接種于6孔板或24 孔板，待多數(shù)細胞貼壁后，換用含10% fbs的高糖dmem培養(yǎng)液，加 入脂肪誘導(dǎo)體系：地塞米松1 u mol/l>牛胰島素5 mg/l

17、（或10 mg/l）>ibmx 0. 5 mmol/l、消炎痛 60 y mol/l (或 200 nmol/l),每 3 天全 量換液，維持2周。鏡下觀察細胞內(nèi)脂肪小滴形成情況，油紅0染色。 隨機選擇10個非重復(fù)視野，計數(shù)脂肪細胞陽性率，結(jié)果用均數(shù)土標準 差(x±d)表示。 結(jié)果形態(tài)學(xué)觀察percoll分離液分離獲得的細胞呈圓形，接種48小時金量換 液后，可見少量長梭形貼壁細胞，周圍有明亮的圓形細胞存在。隨著 培養(yǎng)時間延長，貼壁細胞迅速增多，呈漩渦狀生長，細胞變得細長而 有突起，其間散在分布的細小黑色顆?？赡転檎掣叫詮姷难毎?，胰 蛋白酶消化傳代后逐漸消失。原代培養(yǎng)的msc約

18、15天長滿，傳代后約 5-7天可達80%融合。連續(xù)培養(yǎng)12代，細胞生長情況無明顯差異，但 繼續(xù)培養(yǎng)至15代，細胞生長速度明顯減慢，細胞變大，形狀不規(guī)則, 胞內(nèi)顆粒增多(圖1)。流式細胞儀表型分析獲得的msc均質(zhì)性好，高表達間質(zhì)細胞標記cd73 (98.6% )、 cd105 (97. 7 % )、cd166 (97. 4% ),不表達造血細胞標記 cd45 (0.2%)、 cd34 (0.4%)(圖 2)。alp染色加入成骨誘導(dǎo)體系后約1周，可見細胞基質(zhì)出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣鈣沉積,至2-3周明顯增多,堿性磷酸酶染色強陽性;jiff對照組細胞以未加誘導(dǎo)劑的含10% fbs的高糖-dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)，染色呈

19、陰性(圖3)。油紅染色加入脂肪誘導(dǎo)體系后約2-3天，個別細胞內(nèi)就出現(xiàn)微小明亮 的脂肪滴，聚集在細胞一側(cè)。隨著誘導(dǎo)時間延長，出現(xiàn)脂滴的細胞增 多，脂滴明顯增大并發(fā)生融合，細胞也變成方形或角形，體積變大。 培養(yǎng)至2周，融合的脂肪滴幾乎充滿整個細胞，油紅染色呈明亮的橙 紅色。采用5 mg/l胰島素和60 u mol/l消炎痛誘導(dǎo)，出現(xiàn)脂滴的時 間早于10 mg/l胰島素和200 u mol/l消炎痛誘導(dǎo)，脂肪細胞陽性率 (90. 5%±4. 5%)大于后者(70. 5%±5. 5%)(圖 4)。討論本研究中從新鮮人骨髓穿刺液中分離獲得的骨髓基質(zhì)細胞具 有msc的一般生物學(xué)特性：細

20、胞為典型的成纖維細胞樣，呈漩渦狀貼 壁生長，體外擴增至12代，細胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，高表達間質(zhì)細 胞標記cd73 (sh3, 4)、cd105 (sh2)、cd166,不表達造血細胞標記cd34、cd45o在適宜的誘導(dǎo)條件下，msc能夠較為容易地分化為成骨 細胞及脂肪細胞，且具有多向分化能力。由此，建立了從新鮮成人骨 髓液分離培養(yǎng)、初步鑒定msc的實驗方案。msc在骨髓有核細胞中含量相對稀少，約為1/105 5,隨著 年齡增長，骨髓中msc的數(shù)量及增殖分化能力均顯著下降6。成人 骨髓中還存在著造血細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等多種細胞成分， 因此，必須找到合適的分離方法以獲得純度較高且數(shù)量較多

21、的細胞產(chǎn) 品，以滿足臨床需要。目前較為常用的方法有：根據(jù)msc低密度特性 采用密度梯度離心法;利用msc與培養(yǎng)底物的粘附性采用貼壁篩選法; 根據(jù)細胞大小和表面標記采用免疫磁珠或流式細胞分選法。貼壁法直 接接種骨髓細胞，在培養(yǎng)過程中不斷換液，去除非貼壁細胞，最終得 到富集的msc,但純度較低；分選法得到的msc純度較高，但細胞活 率受影響，而且費用昂貴。采用1. 073 g/ml percoll分離液進行密度 梯度離心并結(jié)合定期全量換液的貼壁篩選法，培養(yǎng)出的msc純度提高。 細胞接種和傳代密度對細胞的牛長速度和分化狀態(tài)有一定影響，尤其 是原代培養(yǎng)的人體細胞。本實驗采用2x105/cm2的密度接種

22、細胞，48 小時全量換液。傳代時按照1 ： 4或1 ： 5擴增，細胞密度沒有嚴格限 制，消化時將0. 25%的胰蛋白酶稀釋為0. 10%-0.15%,并盡量縮短 作用時間，減少對細胞的刺激。這樣處理的細胞生長良好，多次傳代 不會影響生物學(xué)特性。體外研究發(fā)現(xiàn)，msc具有多能分化的潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為不同的結(jié)締組織細胞，并把這一現(xiàn)象作為判斷msc自我更新和多向分化能 力的指標之一。利用msc易于分離擴增、表型穩(wěn)定的生物學(xué)特性，可 將其作為研究多能干細胞定向分化調(diào)控機制的理想模型。已發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(mapk)家族成員erk、jnk、p38的特異性抑制劑能夠增強脂肪生成轉(zhuǎn)錄因了 c/ebp。、

23、b及過氧化物酶體增殖物活化受體(ppar-y )的表達，促進msc向脂肪分化，同時抑制成骨分化7； 骨髓基質(zhì)祖細胞在向成骨和脂肪細胞分化之間存在某種平衡，erk可 能是體內(nèi)決定msc分化方向的開關(guān)8o本實驗聯(lián)合應(yīng)用地塞米松、甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽、胰島素、消炎痛、tbmx,誘導(dǎo)人骨髓msc向成骨細胞及脂肪細胞分化。b-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽 可為成骨細胞的形成提供磷元素，并促進鈣鹽沉積；地塞米松激活糖 皮質(zhì)激素受體，促進c/ebps生成，同時降低脂肪細胞分化抑制因子 pref-l的表達;胰島素與igf-1、irs等受體結(jié)合，激活akt, ras, erk1/erk2等信號傳導(dǎo)通路；消炎

24、痛為非類固醇抗炎劑，是ppar- y 的配體；ibmx提高細胞內(nèi)camp水平，激活camp反應(yīng)元件結(jié)合蛋口 (creb),調(diào)控c/ebp (的表達，誘導(dǎo)ppar- y和c/ebpa產(chǎn)生，參與脂肪細胞的早期生成9, 10。結(jié)果還顯示，低劑量胰島素和消炎痛誘 導(dǎo)msc分化為脂肪細胞的陽性率更高，提示這兩種藥物在高濃度時可 能存在一定的拮抗效應(yīng)，胰島素促進erk的活化可能導(dǎo)致ppar- y磷 酸化而降低其轉(zhuǎn)錄活性，部分抵消了消炎痛的作用，但該結(jié)果有待重 復(fù)實驗加以證實。骨髓中存在著造血組織和非造血組織兩種成分，機體內(nèi)正常造血 功能的維持依賴于造血干細胞的口我更新和造血微環(huán)境的完整與穩(wěn) 定。msc作為

25、多種骨髓基質(zhì)細胞的前體細胞，參與造血微環(huán)境的穩(wěn)態(tài) 調(diào)控，并為機體新陳代謝及組織損傷修復(fù)提供“庫存”細胞，在干細 胞移植和組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。木研究初步建立了從成人 骨髓穿刺液中獲得和鑒定msc的實驗方案，具有操作簡單、便于掌握、 實驗周期較短等特點，適于在臨床實驗室推廣應(yīng)用，為今后msc更好 地進行臨床治療打下基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I】1 cap lan a i. mesenchymal slem cells j orthop res, 1991: 9: 641-6502devine sm, hoffman r. role of mesenchymal stem cells in hemat

26、opoietic stem cell transplantation. curr opin hematol, 2000; 7: 358-3633maitra b, szekely e, gjini k, et a 1. human mesenchymalstem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress t-cell activation. bone marrow transplant, 2004; 33: 597-6044le-blanc k, rasmusson i, sundberg b, et al. treatment of severe acute graftversushost disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells lancet, 2004; 363 (9419): 1439-14415pittenger mf, mackay am, beck sc, et a 1. multilinea