分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、南通大學(xué) 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 系 級(jí)班 學(xué)號(hào) 姓名 目 錄實(shí)驗(yàn)一 組織和細(xì)胞RNA的制備實(shí)驗(yàn)二 核酸定量和電泳分析實(shí)驗(yàn)三 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)實(shí)驗(yàn)四 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體外擴(kuò)增目的基因?qū)嶒?yàn)五 PCR產(chǎn)物的TA克隆（連接）實(shí)驗(yàn)六 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)七 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及重組子的篩選實(shí)驗(yàn)八 質(zhì)粒DNA的抽提實(shí)驗(yàn)九 質(zhì)粒DNA分子的鑒定及酶切分析 實(shí)驗(yàn)一 組織和細(xì)胞RNA的制備（一)實(shí)驗(yàn)原理：TRIzol法提取組織或細(xì)胞總RNATRIzol可以在破壞細(xì)胞使RNA釋放出來(lái)的同時(shí)，保護(hù)RNA的完整性 。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA 可以通過(guò)

2、異丙醇沉淀來(lái)還原。無(wú)論是人、動(dòng)物、植物還是細(xì)菌組織，TRIzol法對(duì)少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。（2） 實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣品處理： 1)培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。 2)組織：取50-100mg組織（新鮮或-70及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置5min。2. 加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。3. 4離心，12000rpm×15m

3、in，取上清。4. 加入0.5ml異丙醇（或與上清等體積），將管中液體輕 輕混勻，靜置10min。5. 4離心，12000rpm×10min，棄上清。6. 加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4，7500rpm×5min，棄上清。7. 晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65促溶10-15min）。注：（一）操作注意事項(xiàng)1. 樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會(huì)使內(nèi)源性RNase的抑制不完全，導(dǎo)致RNA降解。2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須嚴(yán)格防止RNsae的污染。3. 要避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。 （二）R

4、NA實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)RNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。 實(shí)驗(yàn)二 RNA定量和電泳分析1 RNA定量 (一）實(shí)驗(yàn)原理：RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40g/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD2

5、60值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低，說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降（2） 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)： RNA濃度=1.4mg/ml; OD260=1.93;2. RNA快速電泳1） 快速電泳原理：電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著

6、與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 二）實(shí)驗(yàn)步驟：1)RNA電泳所用器械如制膠的模具、梳子、電泳槽等用清洗劑洗干凈后用雙蒸水沖洗二遍后在室溫晾干備用。2)用新的1×TAE 配制1 %瓊脂糖凝膠,倒膠時(shí)溴化乙錠(EB)直接加入凝膠中。3）制備好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽后再加入經(jīng)高壓滅菌過(guò)的1×TAE , 緩沖液液面淹過(guò)膠面。3)點(diǎn)樣時(shí),樣品RNA 每10l 加入2l 6×上樣緩沖液，150V電泳10

7、分鐘左右便可取出凝膠在紫外燈下觀看所提取的RNA 的質(zhì)量或進(jìn)行拍照記錄。 三）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：18S28S實(shí)驗(yàn)三 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（一）實(shí)驗(yàn)原理：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，可為進(jìn)一步擴(kuò)增提供模板。（二）實(shí)驗(yàn)步驟： 1）取RNase -free的0.5ml微量離心管，冰上依次加入下列試劑的混合物至管中： 5×BU-Script buffer 4 l dNTPmix( 10mM ) 1 l Primer 1 l10pmol/l Oligo（dT）18或25pmol/l Random primers 20U/l

8、RNase Inhibitor 1 l200U/l BU-Script Reverse Transcriptase 1 lRNase-free H2O to (12-X) l 充分混勻，短暫離心后置于冰上。2）加總RNA 至以上混合管中：10ng-1g total RNA or 10-500 ng mRNA X l總體積 20 l（注意：RNase Inhibitor應(yīng)于RNA模板之前加入管中。）3）充分混勻，短暫離心后執(zhí)行以下步驟：1. 30 10分鐘；2. 42 60分鐘；3. 99 5分鐘；4. 4 5分鐘結(jié)束后短暫離心收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，-20保存?zhèn)溆?。注：?shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防

9、止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂。2.實(shí)驗(yàn)中所有物品都應(yīng)避免RNA酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。實(shí)驗(yàn)四 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體外擴(kuò)增目的基因（一）實(shí)驗(yàn)原理：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93-94）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷

10、酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72將單核苷酸從引物的3端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?3方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。 PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制

11、的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途：(1) 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文庫(kù)；(3) 從cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以進(jìn)行序列測(cè)定；(5) 突變的分析；(6) 染色體步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。（二）操作步驟1在冰浴中，將以下各成分加入一無(wú)菌0.5ml離心管中。 2xTaq MasterMix 10 l 引物1（10M） 1 l 引物2（10M） 1 l DNA模板（50ng-1g/l） 1 l ddH2O 7 l- 總體積 20 l2 調(diào)整好反應(yīng)程序

12、。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93 30s 56 30s 72 30s，循環(huán)30次，最后在72 保溫7min。3 結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4待電泳檢測(cè)或-20長(zhǎng)期保存。4 PCR的電泳檢測(cè)：取5l PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（3） 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：2 1注：實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。所有試劑都應(yīng)沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。2. 試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。3. PCR的樣品

13、應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。4. 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。5. 內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）、-Actin（-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。6. PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。7. 防止DNA的污染：1) 采用DNA酶處理RNA樣品。2) 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因

14、和mRNA的共線性。 實(shí)驗(yàn)五PCR產(chǎn)物的克?。ㄒ唬㏄CR克產(chǎn)物克隆分類及實(shí)驗(yàn)原理：1）PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的35外切酶活性和53的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有53校對(duì)能力，擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端連接

15、的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和PCR產(chǎn)物上產(chǎn)生長(zhǎng)的可互補(bǔ)的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5端加入一段某種限制酶的識(shí)別序列。如果兩個(gè)引物選用不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，就可以做到定向連接。另一類利用部分PCR產(chǎn)物3端帶有一個(gè)凸出的dAMP的特性，構(gòu)建3端帶有凸出的dTMP的載體。一般采用的方法是先把載體用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70或72下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應(yīng)體系中用Taq DNA聚合酶處理半小時(shí)（也有人報(bào)道處理12小

16、時(shí)能提高克隆效率，這樣加T反應(yīng)會(huì)更徹底）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成加T反應(yīng)。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。如果使用ddTTP，效果會(huì)更好。這種方法一般稱為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50100倍。2）PCR產(chǎn)物的TA克隆原理TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中（圖4）。 圖4 T-A克隆構(gòu)建示意圖（二）操作步驟

17、：1) 連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。2) 10l體積反應(yīng)體系如下：取T載體1l (50ng)，加入等摩爾數(shù)PCR產(chǎn)物 。加入含ATP的10×Buffer 1l，T4 DNA連接酶合適單位(3U/l，加1l)，用ddH2O 補(bǔ)足至10l 。3) 稍加離心，通常為14-16水浴連接8-14hr，或4過(guò)夜。4) 連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。 注：實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。2. PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過(guò)純化。3. 在PCR產(chǎn)物回收、純化過(guò)程中防止外來(lái)DNA污染。4. 不同廠家生產(chǎn)的T4 DNA連接酶反應(yīng)條件稍有不同，但其產(chǎn)品說(shuō)明書

18、上均有最適反應(yīng)條件，包括對(duì)不同末端性質(zhì)DNA分子連接的T4 DNA連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連接酶緩沖液（10×、5×、2×），其中多已含有要求濃度的ATP，應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融使其分解。實(shí)驗(yàn)六 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。其原理是：在0下的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化緩沖液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羥基鈣磷酸復(fù)合物，此復(fù)合物粘附于細(xì)菌細(xì)胞表面。42短時(shí)間熱處理（熱休克），可以促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將處

19、理后的細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)液中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型(如Amp抗性) 得到表達(dá)。然后再涂布于含有氨芐青霉素的選擇性平板上，37培養(yǎng)過(guò)夜，這樣即可得到轉(zhuǎn)化菌落。（二）實(shí)驗(yàn)步驟：1. 保存于-70的DH5（或其他菌種）用接種環(huán)劃菌于1.5%瓊脂平板上，37恒溫倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（約14-16 hr）。2. 挑取單菌落，接種于2.0ml LB液體培養(yǎng)基中，37恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12hr）。3. 取0.5ml 過(guò)夜培養(yǎng)液，接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)2-2.5hr，至OD600為0.4-0.5時(shí)，放置于4冰箱冷卻1-2hr。（注：以下操作均應(yīng)在

20、冰浴中進(jìn)行。）4. 將培養(yǎng)液1.5ml分裝入1.5ml離心管中，4離心，4000rpm×10min，棄去上清。5. 重復(fù)第4步。6. 用冰浴的0.1M MgCl2 0.5ml懸浮30min。7. 4離心，4000rpm×10min，棄去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液100l懸浮。8. -70凍存?zhèn)溆?。注：?shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：制備感受態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的，15 lbf/in2高壓滅菌20min。實(shí)驗(yàn)七連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及重組子的篩選（一）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的原理：轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性

21、狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-, M-)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法(如電擊法、CaCl2 、RbCl 等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞( Compenent cells )。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子( Transformant

22、，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。（二）實(shí)驗(yàn)步驟： 1新鮮制備的或-70下保存的100mL感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕地將細(xì)胞均勻懸浮。 2加入5m l重組質(zhì)粒（適量連接產(chǎn)物，一般不超過(guò)10l），輕輕混勻。 3冰上放置20分鐘。 4于42熱休克90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min； 5加200 m l LB培養(yǎng)液，37 250轉(zhuǎn)分振蕩培養(yǎng)30分鐘。 6室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉100-200 ml上清液，用剩余的培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮。 7將培養(yǎng)物適量涂于1%瓊脂LB平板（根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG）， 8平皿在37下正向放置1小時(shí)，待瓊脂凝

23、膠表面沒(méi)有液體流動(dòng)后，將平皿倒置，培養(yǎng)過(guò)夜12-16hr。（一）重組子的篩選實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基

24、因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為-互補(bǔ)。由-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。（1） 實(shí)驗(yàn)步驟：1 每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100l用無(wú)菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37下培養(yǎng)半小時(shí)以上,直至液體被完全吸收。2 倒置平板于37繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時(shí),待出現(xiàn)明顯而又

25、未相互重疊的單菌落時(shí)拿出平板。3 放于4數(shù)小時(shí),使顯色完全（此步麥康凱培養(yǎng)基不做）。不帶有pBS質(zhì)粒DNA的細(xì)胞,由于無(wú)Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體的轉(zhuǎn)化子由于具有-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍(lán)色菌落。帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養(yǎng)基和x-gal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。注：實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，因此可將上述連接產(chǎn)物通過(guò)熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí)，導(dǎo)入的重組DNA也

26、得到增殖。2. 白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過(guò)鑒定。3. 基因重組菌用滅菌甘油保存，建議甘油終濃度8-20%，菌液與甘油充分混勻后-70度保藏。（三）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)： 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的平皿示藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)八 質(zhì)粒DNA的提?。ㄒ唬?實(shí)驗(yàn)原理：1. 堿裂解法提取質(zhì)粒利用的是共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線狀的染色體DNA片段在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線狀的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開變性，在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此依然相互盤繞而緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的醋酸鉀高鹽緩沖液使pH降低后，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DN

27、A的兩條互補(bǔ)鏈迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，而線狀的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，不能迅速而準(zhǔn)確地復(fù)性，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒DNA卻留在上清液中。（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟(從細(xì)菌中抽提質(zhì)粒)：1將過(guò)夜培養(yǎng)的2-4m1細(xì)菌，12,000rpm高速離心1分鐘，徹底去除上清。(菌液較多時(shí)可以多次離心收集菌體)2加入200 m l solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。（注：Solution I內(nèi)含RNaseA，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，4保存。）3加入250 m l Solution II，立即輕柔上下顛倒離心管5-

28、10次，使細(xì)菌裂解，室溫放置(2-5分鐘左右)至溶液變成澄清。（注：溫度低時(shí)，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保溫溶解，搖勻后使用。）4加入350 m l Solution III，立即輕柔上下顛倒5-10次至出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，使之充分中和，室溫放置2分鐘。512,000rpm高速離心15分鐘。6取出2ml樣品收集管和吸附柱，在管壁標(biāo)上樣品號(hào)，將步驟5中的上清小心吸取全部轉(zhuǎn)移到吸附柱里。12,000rpm離心1分鐘。7取下吸附柱，棄去掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一支收集管中，吸取700 m l Wash Solution到吸附柱，離心1分鐘。8重復(fù)步驟7一次。9取下吸附柱

29、，棄去掉收集管中的廢液，將柱放入同支收集管中，12,000rpm高速離心2分鐘。10將吸附柱放入干凈的15m1的離心管中，在柱子膜中央加30-50 m l TE或滅菌純水，不要蓋上離心管蓋，室溫下放置2分鐘；蓋上離心管蓋，室溫12,000rpm高速離心1分鐘。注意：將TE或水預(yù)熱到50左右可以提高洗脫效率。11 取1-2m l洗脫液做濃度測(cè)定，1%瓊脂糖凝膠電泳或酶切分析。 實(shí)驗(yàn)九 質(zhì)粒DNA的鑒定和酶切分析一 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定（一）.實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH 溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量堿基的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷

30、，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型，具有不同分子量的DNA片段遷移速度不一樣， 遷移速度與DNA分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可以分離分子量相同、但構(gòu)型不同的DNA分子。一般提取的質(zhì)粒有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)，開環(huán)DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA有一條鏈斷裂，(open circular DNA，簡(jiǎn)稱ocDNA)，線狀質(zhì)粒DNA， 即質(zhì)粒DNA 在同一處兩條鏈都發(fā)生斷裂(linear DNA，

31、簡(jiǎn)稱LDNA)。由于這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同，因此通常抽提的質(zhì)粒在電泳后往往出現(xiàn)3條帶，其中超螺旋質(zhì)粒DNA泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。（二）.實(shí)驗(yàn)步驟1、制備1瓊脂糖凝膠：稱取1 g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100mL 1×TAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻即可。2、膠板的制備 1） 選擇適當(dāng)大小干凈的有機(jī)玻璃內(nèi)槽，放好樣品梳子。2）將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，加入3-5l 溴化乙錠儲(chǔ)存液（2mg/mL）搖勻，緩緩倒入有機(jī)玻璃制膠槽內(nèi)，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。3）待膠凝固后，小心地

32、拔出梳子，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在電泳槽內(nèi)。注意：DNA樣品孔應(yīng)朝向負(fù)電極一端。4）加電泳緩沖液至電泳槽中，加液量要使液面沒(méi)過(guò)膠面1-1.5毫米。3、加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔(記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量)。4、電泳1）接通電泳槽與電泳儀的電源。DNA的遷移速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，一般電場(chǎng)強(qiáng)度不要超過(guò)5Vcm。2）當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。注意：溴化乙錠為致癌物，須戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染環(huán)境。(四)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果在紫外燈(360nm或254nm)下觀察染色后的電泳凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶(在紫外燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，以防紫外線對(duì)眼

33、睛的傷害作用)。 M1 1 2 3 M2 圖6：質(zhì)粒酶切圖譜 M1 、M2 ：DNA Marker 1 ：載體（上）與插入片段（下） 2 ：線性載體 3 ：超螺旋載體（不含插入片段）二、質(zhì)粒DNA分子的限制性內(nèi)切酶消化（一）、實(shí)驗(yàn)原理： 限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的DNA序列位點(diǎn)上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為4、5或6個(gè)核苷酸且呈二重對(duì)稱的特異序列，切割位點(diǎn)相對(duì)于二重對(duì)稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對(duì)稱軸處同時(shí)切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段，另一些酶則在對(duì)稱軸兩側(cè)相對(duì)的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即粘端）的DNA片段。1個(gè)單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50l體積1小時(shí)內(nèi)完全切開1g噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件，甚至對(duì)同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對(duì)其生產(chǎn)的酶制劑優(yōu)化過(guò)反應(yīng)條件，因此購(gòu)買的內(nèi)切酶說(shuō)明書上均有其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，同時(shí)提供有酶切緩沖液（buff