臨床免疫定性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量保證

1、臨床免疫定性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量保證臨床免疫定性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量保證一、相關(guān)基礎(chǔ)知識一、相關(guān)基礎(chǔ)知識u 質(zhì)量保證質(zhì)量保證(quality assurance,qa)(quality assurance,qa) 為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量,要求提供充分可信性所必要的有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施。也可以說是為了提供信任表明實(shí)體能夠滿足質(zhì)量要求，而在質(zhì)量體系中實(shí)施并根據(jù)需要進(jìn)行證實(shí)的全部有計(jì)劃和有系統(tǒng)的活動(dòng)。 u 室內(nèi)質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制（internal quality control,iqc)internal quality control,iqc) 由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性

2、程度，旨在監(jiān)測和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作。u 室間質(zhì)量評價(jià)室間質(zhì)量評價(jià) （external quality assessment, eqaexternal quality assessment, eqa） 為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果與靶值的差異，由第三方機(jī)構(gòu)，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價(jià)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。這是對實(shí)驗(yàn)室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評價(jià)，而不是用來評價(jià)實(shí)時(shí)的測定結(jié)果的可接受性。當(dāng)eqa用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，常描述

3、為實(shí)驗(yàn)室能力比對檢驗(yàn)（proficiency testing, pt）。常用臨床免疫檢驗(yàn)方法常用臨床免疫檢驗(yàn)方法u 三大“標(biāo)記”免疫檢驗(yàn)技術(shù):熒光標(biāo)記、放射性核素標(biāo)記和酶標(biāo)u 其它標(biāo)記免疫測定技術(shù)：發(fā)光物標(biāo)記、金標(biāo)、鑭系元素標(biāo)記等u 免疫沉淀和免疫凝集試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法的選擇實(shí)驗(yàn)方法的選擇u 公認(rèn)的參考方法。u 參照衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心制定的臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范中所推薦的方法。u 根據(jù)權(quán)威部門發(fā)布的方法學(xué)評價(jià)結(jié)果，選用線性關(guān)系好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的實(shí)驗(yàn)方法。方法的評估方法的評估 參數(shù)設(shè)定 ：真陽性 tp ，真陰性 tn ，假陽性fp ，假陰性 fn u 敏感性 :患者中陽性百分率 公式： 1

4、00 u 特異性 :非患者中陰性百分率 公式： 100 方法的評估方法的評估 u 診斷效率 :準(zhǔn)確區(qū)分患者及非患者能力 公式： 100% u 陽性預(yù)測值 :在所有陽性結(jié)果中真患者百分率 公式： 100%方法的評估方法的評估 u 陰性預(yù)測值 :在所有陰性結(jié)果中非患者百分率 公式： 100%二、影響二、影響elisaelisa測定的因素測定的因素u 標(biāo)本收集u 實(shí)驗(yàn)室測定u 報(bào)告和解釋u 灰區(qū)的設(shè)置 u 結(jié)果報(bào)告和解釋u 室內(nèi)質(zhì)控 樣本的外源性干擾因素樣本的外源性干擾因素：u 標(biāo)本溶血 u 標(biāo)本被細(xì)菌污染 u 標(biāo)本貯存時(shí)間過長 u 標(biāo)本凝固不全 u 冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 樣本的內(nèi)源性干擾因素樣

5、本的內(nèi)源性干擾因素：u 類風(fēng)濕因子u 補(bǔ)體u 異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體u 溶菌酶u 磷脂u 藥物小分子u 總蛋白濃度 試劑盒的因素試劑盒的因素 u 固相材料:聚苯乙烯塑料 u 抗原:純化、合成和基因工程抗原 u 抗體：多抗、單抗和基因工程抗體 u 酶結(jié)合物：酶免疫測定的核心成份 u 色原底物： opd 和 tmb u 運(yùn)輸貯存 儀器的校準(zhǔn)與標(biāo)定儀器的校準(zhǔn)與標(biāo)定 u 酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)一定要定時(shí)進(jìn)行（一般使用頻繁不超過半年，最多不超過一年）。u 加樣器及水浴用溫度計(jì)均應(yīng)進(jìn)行計(jì)量校準(zhǔn)后使用，前者可采用稱重法校準(zhǔn)，后者可到國家計(jì)量單位進(jìn)行。酶免疫測定操作中的注意事項(xiàng)酶免疫測定操作中的注意事項(xiàng)u 加

6、樣加樣u 溫育溫育u 洗板洗板u 顯色顯色u 比色比色u 結(jié)果判斷結(jié)果判斷u 結(jié)果報(bào)告及解釋結(jié)果報(bào)告及解釋加樣加樣u 定期對移液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn) u 加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。 u 全自動(dòng)加樣系統(tǒng)的標(biāo)本“交叉污染”問題 。u 操作時(shí)差對結(jié)果的影響 溫育溫育u 常采用的溫育溫度有 43 、 37 、室溫等。 u 溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所需時(shí)間相對較短。 u 溫育時(shí)，微孔板應(yīng)置于水?。ǜ∮谒妫┗驖窈兄校允狗磻?yīng)溶液的溫度迅速與室溫平衡。 u “邊緣效應(yīng)”的排除: 使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度。洗板洗板u 洗滌是el

7、isa測定過程中決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵步驟 。u 洗板液一般為含0.05% tween20 的中性 pbs 。 u 手工洗板要避免氣泡殘留孔內(nèi)，洗板機(jī)洗板時(shí)，將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象 。u 機(jī)洗的次數(shù)要通過多次實(shí)驗(yàn)來確定。顯色顯色u 加入底物 a 和 b 后，應(yīng)振蕩混勻 u 當(dāng)?shù)孜餅?opd(鄰苯二胺） 時(shí)，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行；底物為tmb（四甲基聯(lián)苯胺）時(shí)，要新鮮配制。u 顯色時(shí)間：建議在 37 下反應(yīng)1530分鐘后，終止反應(yīng)比色測定。 比色比色u 加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測定前應(yīng)振蕩混勻 u 測定時(shí)，要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適 u 最好選擇雙波長雙波長比色測定

8、，雙波長測定能去除背景的干擾，注意避免出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象?；覅^(qū)的概念灰區(qū)的概念u elisa“灰區(qū)”是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念。即將co值上下一段區(qū)域定為陽性可疑。處于“灰區(qū)”的樣本，可通過確認(rèn)試驗(yàn)或重復(fù)檢測來確定到底是陽性還是陰性 。如果重復(fù)檢測仍然落在“灰區(qū)”，則結(jié)果可報(bào)“陽性”?；覅^(qū)的設(shè)置灰區(qū)的設(shè)置 u 灰區(qū)”的設(shè)置有二種方式：co（1cv）， cv為該試劑的批內(nèi)cv (一般在15-20%)；co2s，s為實(shí)驗(yàn)室做室內(nèi)質(zhì)控rcv常規(guī)條件下的變異）的標(biāo)準(zhǔn)差。 結(jié)果判斷與報(bào)告結(jié)果判斷與報(bào)告u 按照試劑盒確定的 cut-off 值判斷結(jié)果 。u 對于“灰區(qū)”的問題，

9、報(bào)告方式引入“可疑”較為合理，同時(shí)對結(jié)果做必要的說明。u 各試劑盒co值差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，位報(bào)告結(jié)果的不一致對于臨床實(shí)驗(yàn)室來說是不可回避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點(diǎn)和“結(jié)果互認(rèn)”的最大障礙，所以必須引入陽性和弱陽性的報(bào)告方式。u elisa檢測的原始存根必須完整而全面地保存 。 室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量控制（ iqc ） u iqc是一個(gè)集體活動(dòng)，不光是對實(shí)驗(yàn)室一次測定的有效性的判斷，也反應(yīng)了實(shí)驗(yàn)室測定趨勢的變化。u iqc的失控不能做為處罰的依據(jù)，應(yīng)建設(shè)性的找出失控的原因，針對其采取措施加以改進(jìn)。u 對iqc應(yīng)定期進(jìn)行評價(jià)統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法u 質(zhì)控物濃度的選擇u 每

10、次（批）質(zhì)控物的數(shù)量和放置位置u 質(zhì)控規(guī)則u levey-jennings質(zhì)控圖方法 u “即刻法”質(zhì)控方法 質(zhì)控血清的選擇質(zhì)控血清的選擇u 弱陽性質(zhì)控血清：趨近測定下限的反應(yīng)物濃度水平；能靈敏的反映試劑盒測定下限的改變，確保弱陽性標(biāo)本不被漏檢。u 陰性質(zhì)控血清：避免分析物和微生物之間出現(xiàn)交叉反應(yīng)；能監(jiān)測到出現(xiàn)假陽性反應(yīng)常見的原因。定性免疫測定質(zhì)控物濃度的選擇定性免疫測定質(zhì)控物濃度的選擇u 陽性質(zhì)控標(biāo)本選擇陽性質(zhì)控標(biāo)本選擇： 可選擇可選擇s/co值減去三倍批間值減去三倍批間cv與該與該s/co值的乘積（仍大于值的乘積（仍大于1的質(zhì)控血清作室內(nèi)質(zhì)控用，計(jì)算公式：的質(zhì)控血清作室內(nèi)質(zhì)控用，計(jì)算公式：

11、 s/co（1-3cv%）1 s/co比值可在比值可在1.54之間之間u 弱陽性質(zhì)控標(biāo)本選擇弱陽性質(zhì)控標(biāo)本選擇： 選擇選擇s/co處于處于1.01.5左右的質(zhì)控血清以判斷每次測定時(shí)試劑左右的質(zhì)控血清以判斷每次測定時(shí)試劑盒測定下限的有效性。盒測定下限的有效性。每塊板質(zhì)控物的數(shù)量及位置每塊板質(zhì)控物的數(shù)量及位置u 23份弱陽性質(zhì)控u 23份陰性質(zhì)控u 隨機(jī)放置血液標(biāo)本中間levey-jennings levey-jennings 質(zhì)控圖方法質(zhì)控圖方法 u 基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義：穩(wěn)定條件下，在20個(gè) iqc 結(jié)果中不應(yīng)有多于1個(gè)結(jié)果超過2 sd （ 95.5% 可信限）限度；在1000個(gè)測定結(jié)果中超過3

12、sd （ 99.7% 可信限）的結(jié)果不多于3個(gè)。 如以3 s 為失控限，假失控的概率為0.3%。 u levey-jennings 質(zhì)控圖結(jié)合 westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法 westgardwestgard多規(guī)則質(zhì)控方法多規(guī)則質(zhì)控方法 u l 2s ：一質(zhì)控點(diǎn)在 2s 之外應(yīng)警惕。u 13s:一質(zhì)控點(diǎn)在 3s 之外，為失控。u r 4s ：連續(xù) 2 個(gè)質(zhì)控點(diǎn)相差 4s 。u 4 1s ：連續(xù) 4 個(gè)質(zhì)控點(diǎn)落同側(cè) 1s 之外。u x ：連續(xù) 7 個(gè)質(zhì)控點(diǎn)落均值一側(cè)。室內(nèi)質(zhì)控的現(xiàn)狀及應(yīng)對措施室內(nèi)質(zhì)控的現(xiàn)狀及應(yīng)對措施 u 對于抗體檢測，尤其是競爭法檢測hbeab、hbcab，由于不同試劑盒、不同

13、檢測方法間co值存在差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，在沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)、及明確的臨床意義的情況下，引入弱陽性報(bào)告方式。u 由于質(zhì)控品不穩(wěn)定，每個(gè)月需重新設(shè)立靶值 u 對位于“灰區(qū)”和弱陽性結(jié)果及少見模式結(jié)果進(jìn)行復(fù)查，避免偶然因素及孔間差對結(jié)果造成影響 質(zhì)控小結(jié)質(zhì)控小結(jié) u 定期召開質(zhì)控分析會，討論質(zhì)量控制情況u 要在常規(guī)條件下建立質(zhì)控圖參數(shù)，用s/co比值繪制質(zhì)控圖u 采用自制的質(zhì)控物，是一種經(jīng)濟(jì)的方法，關(guān)鍵是要確保質(zhì)控物的性質(zhì)穩(wěn)定u 使用新批次的外部對照質(zhì)控物時(shí)，必須重新繪制質(zhì)控圖。變異系數(shù)(cv)小于20 質(zhì)控小結(jié)u 建議長期和穩(wěn)定地使用一種質(zhì)量好的試劑盒，更換不同廠家的試劑盒后，必須重新繪制質(zhì)控圖。改用新批號試劑盒也應(yīng)重新制作質(zhì)控圖。 u 發(fā)現(xiàn)質(zhì)控結(jié)果失控，應(yīng)填寫報(bào)告單，上交質(zhì)量負(fù)責(zé)人，分析原因并決定是否發(fā)出檢測報(bào)告。 質(zhì)控小結(jié)u 根據(jù)不同質(zhì)控工作的具體要求，在westgard多規(guī)則方法中，實(shí)際采用的“多規(guī)則”本身并非嚴(yán)格的一成不變，而是可多可少，并可以用不同方式進(jìn)行組合。u 當(dāng)失控時(shí)，能確定產(chǎn)生失控的分析誤差的類型，有助確定失控原因以尋找解決問題的辦法。乙肝檢驗(yàn)存在的問題乙肝檢驗(yàn)存在的問題 u hbv基因組變異對病毒hbsag和hbeag測定影響問題